Summary
I øjeblikket afhænger alle slags vaskulariserede sammensatte allotransplantation lang-sigt-immunosuppression, svært ved at støtte for ikke-liv-kritiske indikationer. Vi præsenterer en ny svin tibial VCA model, der kan bruges til at studere knogle VCA og demonstrere brugen af kirurgiske angiogenese at opretholde knogle levedygtighed uden brug af langsigtede immun-graduering.
Abstract
Segmental knogletab som følge af traumer, infektion malignitet og medfødt anomali er fortsat en stor rekonstruktiv udfordring. Nuværende terapeutiske muligheder har betydelig risiko for svigt og betydelig sygelighed.
Brug af knogle vaskulariserede sammensatte allotransplantation (VCA) ville tilbyde både en tæt match af resektion knogle størrelse og form og den helbredende og remodellering potentialet i levende knogle. I øjeblikket er livslang drug immunosuppression (IS) påkrævet. Orgel toksicitet, opportunistisk infektion og svulster risici vedrører at behandle sådanne ikke-dødelige angivelser:
Vi har tidligere vist, at knogle og fælles VCA levedygtighed kan opretholdes i rotter og kaniner uden brug af lang sigt immunosuppression af implantation af modtagerens afledte fartøjer inden for VCA. Det genererer en autogen, neoangiogenic omsætning med målelige flow og aktive knogle remodellering, der kræver kun 2 uger af IS. Da små dyr adskiller sig fra mand betydeligt i anatomi, knogle fysiologi og Immunologi, har vi udviklet et svin knogle VCA model til at vurdere denne teknik før kliniske anvendelse er gennemført. Miniature svin er i øjeblikket meget udbredt for allotransplantation forskning, givet deres immunologiske, anatomiske, fysiologiske og størrelse ligheder til mand. Her, beskriver vi en ny svin orthotopic tibial ben VCA model at teste rollen som autogen kirurgisk angiogenese at opretholde VCA levedygtighed.
Modellen rekonstruerer segmental tibial ben defekter ved hjælp af størrelse - og figur-matchede allogene tibial ben segmenter, transplanteret på tværs af en større svin leukocyt antigen (SLA) uoverensstemmelse i Yucatan miniature svin. Næringsstof fartøj reparation og implantation af modtagerens afledte autogen skibe ind i medullær kanalen af allogene tibial ben segmenter er udført i kombination med samtidige kortsigtede IS. Dette tillader en neoangiogenic autogen omsætning til at udvikle sig fra den indopererede væv, opretholde strømmen gennem de allogene næringsstof fartøjer i kort tid. Når der oprettet, fastholder den nye autogen omsætning knogle levedygtighed efter ophør med medicinsk behandling og efterfølgende næringsstof fartøj trombose.
Introduction
Store segmental ossøse defekter skyldes traumer, infektion eller lemmer besparende kirurgi efter malignitet. Nuværende rekonstruktiv muligheder såsom vaskulariserede autogen knoglegraft, knogle transport, proteser udskiftning og befrugtede nekrotiske allografts, anvendt alene eller i kombination, er forbundet med betydelig morbiditet og har høje komplikationer1,2,3.
Tilstedeværelsen af en mikrovaskulære netværk er afgørende for dannelsen og homeostase af knoglen, støtte osteogenic, chondrogenic og mesenkymale stamceller kræves for knogle reparation4.
Transplantation af levende allogene knogle, en form for vaskulariserede sammensatte væv allotransplantation (knogle VCA), udføres med microsurgical anastomose af sin næringsstoffer pedicle, kan udgøre en fremtidig rekonstruktiv alternativ. Ligesom befrugtede allogene knogle, er øjeblikkelig stabilitet fastsat af tæt matchende knogle defekt morfologi. Ligesom autogen vaskulariserede graft, det giver øget helbredelse og remodellering af levende knoglevæv. Hindring i enhver allotransplant procedure er stadig behov for lang-sigt-immunosuppression (IS). Problemet er mere akut i bevægeapparatet væv, som kræver medicin doser 2 - 3 gange større end organtransplantation5. Dermed forbundne risici, herunder orgel toksicitet, malignitet, infektion eller udvikling af graft - versus - host sygdom er vanskeligt at retfærdiggøre i disse ordning-kritisk-programmer6. Episoder af akut og kronisk afvisning er dog stadig et stort problem med nuværende langsigtede er7. Løbende indsats nøje matche histocompatibility antigener, fremkalde donor-specifikke tolerance og/eller forbedre drug immunterapi er endnu ikke rutinemæssigt lykkedes i tillader kliniske stoffri væv overlevelse8,9.
Vi har tidligere vist midler til at opretholde knogle VCA levedygtighed og forbedre knogle remodellering i små dyremodeller af fremme af en ny autogen omsætning inden for transplanterede knogle. Dette gøres ved ekstra brugen af kirurgiske angiogenese fra implanterede autogen væv10,11,12. Allogen knogle segmenter kan transplanteres microsurgically med anastomose af næringsstof knogle segment pedicle. Desuden er vært-afledte fartøjer implanteret i medullær kanalen af allogene vaskulariserede knogle segment. I løbet af 2-ugers processen bevares passage af allogene næringsstof fartøjet med narkotika immunosuppression. Efter IS-tilbagetrækning, næringsstof pedicle vil i sidste ende thrombose13. Den nye kapillær seng, baseret på de vært-afledte fartøjer giver tilstrækkelig omsætning for at bevare væv levedygtighed. Knogle heling og remodellering er forbedret siden osteogenesis og angiogenese er koblet10,11,12. Der kræves ingen yderligere immunterapi og knogle levedygtighed er opretholdt langsigtede trods en immunologisk kompetente vært og fravær af donor-specifikke tolerance.
Oversættelse af denne nye metode af ben allotransplantation i klinisk praksis bør bedst forud for yderligere undersøgelse af healing, mekaniske egenskaber og Immunologi i en stor animalsk model. Svin-modellen er ideel for sådanne VCA forskning14,15,16. Miniature svin er sammenlignelige i størrelse og anatomi til mand, så skelet genopbygning ved hjælp af identisk kirurgiske implantater og teknikker. Svin immunologi er veldefineret, herunder svin leukocyt antigen (SLA) haplotypes og blodtyper, nødvendige for hårtransplantation kirurgi. Celle lineage undersøgelser er muligt med sex-uoverensstemmende transplantation, som er detaljerede analyser af immunrespons17,18,19,20,21.
Her, beskriver vi en knogle VCA allotransplantation model i Yucatan miniature svin, egnet til undersøgelse af segmental knogletab og genopbygning. Denne model kan bruges til at undersøge samspillet mellem kirurgisk angiogenese og kortsigtede IS på knogle VCA overlevelse og funktion, herunder osteocyte afstamning, bone blodgennemstrømning, healing og remodellering kapacitet, alloresponsiveness og biomekanik såvel som til teste andre innovative immun modulerende strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Mayo Clinic Rochester. Yucatan miniature svin tjener som både donorerne og modtagerne under denne kirurgiske VCA procedure. Parring af donor og recipient var baseret på DNA sekvens svin leukocyt antigen (SLA) haplotyping at sikre en stor uoverensstemmelse i SLA'er 22,23. Dyrene var alder - og vægt-matchede og af ens blodtype. To kirurgiske hold samtidig høstet et svin tibial ben segment med sin næringsstof fartøj fra donor og forberedt modtageren til at modtage orthopically-placeret allogene tibial ben segment. Samtidig med mikrovaskulære reparation af knogle næringsstof fartøjet, blev en modtager-afledte arteriovenøse bundt placeret i tibial målgruppen for autogen angiogenese.
1. presurgical præparater
- Hurtig Yucatan miniature svin dagen før proceduren og afveje dem for kontrolleret narkotika administration.
- Sindige dyr med xylazin (2 mg/kg) og kombinationen af Tiletamin HCL og zolazepam HCL (5 mg/kg), administreret subkutant.
- Placere et perifert kateter i en øre vene til intravenøs medicin og saltvand levering og administrere buprenorphin (0,18 mg/kg) og profylaktisk antibiotika (1 g cefazoline intravenøs og 5 mg/kg ceftiofur intramuskulær).
- Barbere den rigtige hindlimb og den venstre hals, der vil tjene som høst site for vaskulariserede tibial ben segment og site for placeringen af det centrale venøse kateter, henholdsvis.
- Kontrollere vitale tegn og niveauet af sedation ved at teste en lempelse af munden muskler.
- Intubate dyr med en passende størrelse endotrakealtube i brystbenet recumbency24.
- Overføre miniature svin til driften tabellen og oprette forbindelse til en ventilator maskine til vedligeholdelse af anæstesi ved at administrere isofluran (1-3%).
- Bekræfte den bedøvende dybde ved at teste palpebral, pupillary lys og cornea reflekser.
- Overvåge iltmætning med en puls oximeter transmission sonde er knyttet til øret. Bruge et blodtryk manchet og temperatur sonde for intraoperativ vitalfunktioner overvågning.
- Placer Yucatan miniature svin i en liggende stilling på en opvarmning pad. Derudover bruge en tvunget luft opvarmning tæppe under operationen for at forhindre hypotermi.
- Bruge vet salve på øjne til at forhindre tørhed under anæstesi.
2. høst af en vaskulariserede Tibial ben Segment
- Vask højre ben af hver miniature svin med povidon-jodopløsning. Tør hud med en steril håndklæde og drapere ekstremiteten i en steril mode. Omringe og isolere lemmer med en jod imprægnerede klæbende indsnit drapere at minimere risikoen for kontaminering.
- Udføre et snit med en skalpel anterolaterally i hindlimb, begyndende med knæleddet, udvide distalt langs den forreste højderyg af tibia til tibiotalar fælles.
- Dissekere huden og det subkutane væv med saks og trække de forreste rum muskler fra skinnebenet sideværts.
Bemærk: Frigivelse af tibialis anterior musklen oprindelse letter eksponering. Den interosseous membran er nu udsat. - Identificere den kranielle tibial arterie og vene (for at bruges senere som den arteriovenøse bundle for den kirurgiske angiogenese).
Bemærk: Kraniel tibial arterie og vene ligge på den forreste overflade af interosseous membran. - At forbedre den operative synsfelt, frigive en del fra tibial anterior musklen fra sin indsættelse og fjerne en del af den tibial højderyg ved hjælp af en oscillerende saven.
- Beskytte de kranielle tibial fartøjer, incise interosseous membran begyndelsen på niveau med den tibial tuberkelbakterier med en saks.
- Visualisere de caudale tibial fartøjer, kører distalt under membranen.
Bemærk: De gren fra de kranielle tibial fartøjer og give anledning til den tibial diaphysis lige distalt for tuberkelbakterier næringsstof pedicle. Det er nu muligt at visualisere næringsstof foramen og fartøjer der anløber skinnebenet på dens posterior lateral overflade lige distalt for den tibial tuberkelbakterier. - Tag den næringsstof pedicle med en microclamp. Fjern ikke den vaskulære pedicle.
- Identificere en muskel gren i den tibial anterior compartment nær næringsstof foramen; Dette kan bruges til anastomose vaskulariserede knogle allotransplant næringsstof fartøj. Markere muskel grenen med en microclamp.
-
Høsten af en 3,5 cm tibial ben segment herunder de vaskulære pedicle.
- Bruge en skæring jig for at sikre en nøjagtig og reproducerbar knogle resektion. Position og fix opskæring jig på den mediale overflade af skinnebenet at medtage næringsstof foramen og fartøjer.
- Styret af jig, udføre parallelle ben nedskæringer med en oscillerende sav til at fjerne en 3,5 cm tibial segment. Brug den samme placering og jig for både donor og modtager dyr for at maksimere størrelse og form match.
- Bruge en skæring jig for at sikre en nøjagtig og reproducerbar knogle resektion. Position og fix opskæring jig på den mediale overflade af skinnebenet at medtage næringsstof foramen og fartøjer.
- Når begge stykker har foretaget med oscillerende saven, rotere tibial ben segmentet for at visualisere den næringsstof pedicle på den bageste overflade. Opdele næringsstof pedicle på sin oprindelse fra den kranielle tibial arterie med saks. Dissekere og gratis tibial segmentet med saks, forlader en tynd manchet af periosteum og muskel på dens overflade.
- Trække tibial ben segmentet og ophøje tibial ben segmentet med sin vaskulære pedicle med en skarp klemme, forlader den kranielle tibial arterie i sted.
Bemærk: Vaskulariserede knogle segment er nu klar til mikrovaskulære overførsel og en 3,5 cm tibial ben defekt er blevet oprettet i hver Yucatan miniature svin. - Ligate de kranielle tibial fartøjer på ankel med resorberbare polyglactin 3-0 sutur, frigøre dem med en manchet af perivascular væv til at oprette en arteriovenøs (AV) bundt. Efterlad suturer mindst 5 cm lang at lette implantering i tibial ben segmentet.
3. Orthotopic Tibial ben VCA genopbygning i kombination med kirurgisk angiogenese
-
Udveksle høstede tibial ben segmenter med sin næringsstof pedicles mellem de to dyr at bruge dem som knogle VCAs.
- For at tillade passage af den kranielle tibial arteriovenøse (AV) bundt i tibial ben segmentet, fjerne den V-formet segment fra den proksimale junction websted ved hjælp af oscillerende saven.
- Bor et hul på 0,5 cm i diameter i den distale del af defektstedets tibial ben og ind i medullær kanalen tibial ben-segmentet og indføre den modtagende AV bundt, der har været forbundet distalt, ind i intramedullary kanalen til at fremme efterfølgende autogen nyt blod levering.
-
Placer vaskulariserede tibial ben segment orthotopically ind i den modtagende defekt.
- Anastomose tibial ben segment for grenen rede muskel den tibial forreste rum i en ende til-ende måde ved hjælp af simple afbrudt Sutur teknik og 9-0 sutur25næringsstof pedicle.
- Bekræfte passage af mikrovaskulære anastomose med malkning test26.
-
Opnå osteosyntese ved hjælp af en 9-hullers 3,5 mm låsning plade.
- Plads 9-hullers pladen på tibia anteromedially. Fastgør pladen med tre bicortical skruer over og under tibial ben segmentet. Derudover placerer unicortical skruer i tibial ben segmentet for intern fiksering. For at bekræfte korrekte placering af knoglen VCA og plade, bruge anteroposterior og laterale røntgenbilleder.
- Udføre fascial og lagdelte hud lukning ved hjælp af afbrudt 3-0 og 2-0 resorberbare suturer. Endelig forsegle såret med en okklusiv gennemsigtig dressing.
4. det centrale venøse kateter placering i jugularis ydre vene
-
For postoperative drug administration og immunosuppressive (IS) stof niveau overvågning, skal du placere en venøs kateter i den eksterne halsfedt ved hjælp af en åben teknik. Udføre placering ved afslutningen af proceduren allotransplantation under bedøvelse (Se afsnit 1).
- Udføre en anterolaterale indsnit i halsen med en skalpel. Dissekere det subkutane væv med saks og udsætte den venstre halsfedt.
- Placer en Hickman kateter i halsfedt gennem et lille hul i den eksterne halsfedt og Fastgør det med ikke-resorberbare suturer. Exteriorize kateter i ryggen af tunnelføring subkutant.
- Sikre kateter at huden og tæt om halsen i lag ved hjælp af afbrudt 3-0 og 2-0 resorberbare suturer.
- Placer okklusiv bandager over snit. Brug et fiskenet bandage til holder bandager og kateteret på plads.
5. postoperative behandling og opfølgning
- Umiddelbart efter operationen, behandling af Yucatan miniature svin med en intramuskulær injektion af carprofen (4 mg/kg) for postoperative analgesi. Administrere buprenorphin (0,18 mg/kg) for at behandle smerter af høj intensitet efter behov.
- Tillad gris til at inddrive i 60 min og derefter returnere grisen til en særlig intensiv afdeling pan og overvåge nøje indtil fuldstændig helbredelse.
- Flytte Yucatan miniature svin til en normal bur og give ad libitum adgang til vand og mad.
- Administrere tacrolimus (0,8-1,5 mg/kg/dag) og mycophenolatmofetil (MMF) (50-70 mg/kg/dag) mundtligt og methylprednisolon natrium succinat intravenøst (begyndende med 500 mg/dag) for to uger.
- Justere daglige doser af immunosuppressive lægemidler efter trug i blodet, satsning nemlig 5.0-30,0 ng/mLfor tacrolimus og 1,0-3,5 µg/mL for MMF, henholdsvis. Reducere dosis af methylprednisolon gradvist indtil vedligeholdelsesdosis af 50 mg per dag er nået.
- Administrere profylaktisk antibiotika gentamicin (3 mg/kg intravenøst) og ceftiofur (5 mg/kg intramuskulært) for to uger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne teknik blev med held udført i fire SLA store uoverensstemmelse mellem Yucatan miniature svin og segmental tibial defekter rekonstrueret ved hjælp af størrelse-matchede tibial VCA. Samtidige næringsstof fartøj reparation af ben allotransplant og implantation af en AV bundt fra modtagerens dyret inden for allotransplant medullær kanalen tilladt både øjeblikkelig knogle omsætning og udvikling af en ny autogen blodforsyning over tid (figur 1). På 16 uger var en neoangiogenic omsætning blevet etableret inden for alle tibial VCAs, visualiseret ved mikro-beregnet tomografisk (mikro-CT) angiografi efter injektion af en røntgenfast Angiografisk polymer (125 ml) i femoralis fartøjer og afkalkning af den tibial VCA (figur 2).
Figur 1 : Orthotopic tibial ben VCA procedure. Diagrammet viser den kirurgiske procedure. (A) Donor procedure: høsten af en tibial ben segment med sin næringsstof pedicle. (B) udveksling af tibial ben segmenterne mellem store SLA uoverensstemmelse svin. (C) modtageren procedure: arteriovenøse bundt implantation: kraniel tibial fartøjer er omhyggeligt indsat i medullær kanalen. (D) mikrovaskulære anastomose af næringsstof pedicle til muskel gren af den forreste tibial rum og plade osteosyntese af den tibial diaphysis. Brugt med tilladelse fra Mayo Foundation for medicinsk uddannelse og forskning. Alle rettigheder forbeholdes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant 3D mikro-CT Angiografisk billede af en decalcified tibial VCA segment. Neongiogenic omsætning (gul pil) er afbildet efter perfusion med en røntgenfast silicium løsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Miniature svin viste ingen tegn på angst eller selvmutilation. Alle sårene helet uden infektion og dyr ambulated normalt, i sidste ende kunne bære fuld vægt på den opererede rigtige lemmer fra den første postoperative dag på. På undersøgelse slutpunktet på 16th uger alle Yucatan miniature svin havde fået over 150% af deres oprindelige kropsvægt (pretransplant: 56.0 ± 6.1 versus 16 uger posttransplant: 84.5 ± 6.0).
To uger af immunosuppression, bestående af tacrolimus, blev mycophenolatmofetil (MMF) og methylprednisolon succinat brugt til at opretholde blodgennemstrømning gennem de næringsstoffer pedicle, indtil en ny autogen blodforsyning er blevet etableret inden for de allogen knogle allotransplant. I løbet af 2 ugen blev immunosuppression periodiske blodprøver taget fra den jugularis kateter at vurdere stoffet i blodet. Doser blev justeret for at opretholde lavpunktet blodets indhold af 5-30 ng/ml for tacrolimus og 1-3,5 µg/ml for MMF (tabel 1). Ingen narkotika relaterede komplikationer opstod og rettet lavpunktet niveauer for tacrolimus og mycophenolatmofetil kunne være opnået (figur 3 og figur 4).
| Immunsupprimerende | Initiale dosis | Lavpunktet niveauer | Vedligeholdelsesdosis |
| Tacrolimus | 0,8-1,5 mg/kg/dag | 5-30 ng/ml | |
| Mycophenolatmofetil | 50-70 mg/kg/dag | 1-3 µg/ml | |
| Methylprednisolon natrium succinat | 500 mg | 50 mg |
Tabel 1: kort sigt immunosuppression protokol. Afbildet er immunosuppressive protokollen for de første 2 uger post transplantation med den startdosis for Tacrolimus, mycophenolatmofetil og Prednisolon. Desuden rettet lavpunktet niveauer for Tacrolimus og mycophenolatmofetil mofetil og vedligeholdelsesdosis af Prednisolon er vist.
Figur 3 : Trug i blodet for Tacrolimus. Median og interkvartil række opnåede lavpunktet niveauer for Tacrolimus over de første 2 uger post transplantation er afbildet. Fejllinjer betegne det interkvartil område. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Trug i blodet for mycophenolatmofetil. Median og interkvartil vifte af trug blodets indhold af mycophenolatmofetil over de kortsigtede immunosupression periode på 2 uger er vist. Fejllinjer betegne det interkvartil område. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Trods ophør af immunosuppression efter to uger, periodiske radiologiske evaluering på forskellige tidspunkter (2, 4, 6, 10 og 16 uger) af betjente højre bagben lemmer med røntgenstråler afslørede progressive knogle heling over undersøgelsen periode på 16 uger når sorteres efter to uafhængige og blindet observatører (figur 5)27,28. Mikro-CT analyse på 16th uger blev brugt til at kvantificere både volumen og tæthed af hård hud, samt bridging knogledannelse på host/knogle VCA kryds og ben VCA allotransplant udseende27. Vedligeholdelse af intern fiksering uden tab af nedsættelse eller taber, fremmes af de nye autogen blodforsyning, kunne blive demonstreret28. Ossøse union blev opnået i alle forbenede (figur 6).
Figur 5: Knogle helbredende progression over 16 uger. Hvis du vil definere knoglen healing progression en ikke-lineær regressionsmodel blev brugt. Værdien R2 blev brugt til at definere fit model til data. Ved hjælp af et pointsystem baseret på anteroposterior og lateral røntgenbilleder osseointegration af knoglen VCA i segmental knogle defekten blev scoret med en maksimal værdi af 25 point på andet tidspunkt peger over studieperioden (2, 4, 6, 10 og 16 uger) med to uafhængigt og blindet observatører30,31. Den ikke-lineære regressionsmodel skildrer median og interkvartil interval for knogle heling værdier over studieperioden (R2 = 0.931) viser en kontinuerlig knogle heling progression tilnærme værdien af 25 på 16 uger. Fejllinjer betegne det interkvartil område. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Tre-dimensionelle genopbygning af de svin tibial diaphysis efter mikro-beregnet tomografisk evaluering. Repræsentant tredimensionale beregnet billede af den rekonstruerede tibia med indre plade fiksering på 2 x faktiske størrelse. På 16 uger komplet union efter tibial ben VCAs med kirurgisk angiogenese er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Histologiske analyse på hæmatoxylin-eosin undecalcified farves sektioner, ved hjælp af en tidligere beskrevet skala grading afvisning (ingen, mild, moderat og svær) viste ingen tegn på svær afvisning, hvorved mild og moderat tegn på afvisning kunne være demonstreret i tre grise (figur 7)29.
Figur 7: Repræsentative billede af en vandret hæmatoxylin-eosin farves afsnit fra en tibial VCA. Røntgenfast silicium løsning-fyldt fartøjer er vises brown (stjerne). Mild knoglens endosteale infiltration og reaktion (tyk pil) er set med over to tredjedele af lacunas fyldt med osteocytes (lille pil) i henhold til levedygtig knogle. 10 X forstørrelse. Skalalinjen = 300 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transplantation af vaskulariserede allogene knogle (bone VCA) kan udgøre en fremtidig rekonstruktiv mulighed for store segmental ossøse defekter. Brug af lang-sigt-immunosuppression (IS) og dens væsentlige bivirkninger kræves for knogle VCA overlevelse er imidlertid vanskeligt at berettige i disse ordning-kritisk-programmer6.
Selvom indavlede stammer af laboratorium rotte har været udbredt i allotransplantation forskning til at afprøve forskellige tilgange til undgåelse af lang sigt immunosuppression, kan svin modeller give betydelige fordele8,9 . Den Yucatan mini gris er ideel til undersøgelse af den komplekse proces af knogle VCA afvisning. Fysiologisk, den ny knogle dannelse sats er sammenlignelig med mand (svin 1,2-1,5 µm per dag; mennesker 1,0-1,5 µm per dag henholdsvis)32. Anatomiske ligheder aktiverer brugen af orthotopic knogle genopbygning ved hjælp af identisk kirurgiske implantater og teknikker. Måske vigtigst af alt, de veldefinerede svin alloresponse-gjort muligt ved fremskridt i svin cytokin opdagelse og udvikling af anti-svin klynge af differentiering antistoffer-gør dette og andre VCA undersøgelser strengere33.
Som i ethvert lignende kliniske anvendelse, metoden for svin tibial ben defekt genopbygning ved hjælp af knogle VCA teknisk krævende, der kræver en to hold tilgang med tilstrækkelig kirurgisk ekspertise i mikrovaskulære kirurgi og knogle genopbygning for at opnå reproducerbare resultater. Strenge vedligeholdelse i sterile intraoperativ forhold og perioperative antibiotika profylakse er obligatorisk at nedsætte risikoen for infektiøse komplikationer.
I tidligere undersøgelser med rotter og kaniner vedligeholdt kortsigtede er levedygtighed vaskulariserede knogle allotransplants i de første 2 uger gennem perfusion af knogle VCA gennem sin allogene næringsstof fartøj. Efter immunosuppression tilbagetrækning modtageren afledt fartøjer inden for forudsat medullær kanalen neovascularization tillader langsigtede VCA knogleheling og levedygtighed10,11,12. Ved undersøgelsen slutpunkt, kunne væsentlig allotransplant kimærisme være opdaget34,35,36. Vi har flyttet frem og anvendt vores rotte og kanin veletableret metode på modellens svin. Denne model er det muligt at teste et nyt middel til at opretholde væv levedygtighed uden langsigtede IS i knoglen VCA forskning, ved hjælp af kirurgiske angiogenese fra implanterede autogen fartøjer kombineret med kortsigtede er, effektivt skifte ben omsætning fra allogen autogen fartøjer.
En stor fordel ved denne model over andre eksisterende svin knogle indeholdende VCA modeller er dens orthotopic design gør det muligt for funktionel evaluering af vægtbærende og vurdering af mekaniske egenskaber, data, som er specielt sparsomme14, 37. den komplekse mekanisme af lokal og systemisk knogle VCA afvisning kan nemt overvåges via radiologiske og histologisk vurdering af allotransplanted tibial ben segment samt Molekylær biologiske analyse af de perifere blod. I sidste ende giver lav morbiditet forretningsorden VCA kirurgisk knogle langsigtede knogle VCA overlevelse og analyse.
Stabil intern fiksering, ordentlig allogene tibial ben segment anbringelsen og lemmer justering er afgørende at tillade ambulation af svinene på den første postoperative dag og kræver omhyggelig presurgical planlægning. Metoden har vi udvalgt ved hjælp af en speciel designet skæring jig for nøjagtige og reproducerbare knogle resektion kombineret med plade osteosyntese er tilstrækkeligt stabile for at tillade stive fiksering i allotransplants, selv i dem med minimal størrelse uoverensstemmelser.
En begrænsning af præsenteres teknik er, at det ikke tillader vurdering af forskellige væv komponenter som hud og muskel udover komponenten vaskulariserede knogle. Mens en sammensat klap, herunder forskellige væv komponenter er muligt, er denne model designet til at studere eksklusive knogle allotransplantation som immunogenicitet af forskellige VCA væv compontents varierer38.
Til sidst, indeholder denne artikel oplysninger til oprettelse af en reproducerbar store dyremodel med definerede genetik for knogle VCA forskning. Denne model kan tjene som grundlag for fremtidige studier undersøger kirurgisk angiogenese indflydelse på knogle blodgennemstrømningen og knogle remodellering og kan eliminere behovet for langvarig immunsuppression. Det kan desuden bruges til at afgrænse den komplekse proces af knogle VCA afvisning og teste andre innovative immun modulerende strategier. Definerede SLA-haplotypes og kvantificering af SRY-gener i sex-uoverensstemmende svin kan tillade bestemmelse af omfanget af kimærisme allotransplant og perifert blod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke den Division af medier Support Services, Mayo Clinic Rochester, MN til videoproduktion samt Georgios Kotsougianis til redigering af video. Den fremragende illustrationer blev gennemført af Jim Postier, Rochester, MN. Derudover, forfatterne vil gerne takke den tyske Forskningsfonds (Deutsche Forschungsgemeinschaft) for at yde løn support for Dr. Dimitra Kotsougiani (DFG grant: KO 4903/1-1). Dette arbejde blev støttet af en generøs gave fra Tarek E. Obaid. Dette arbejde blev udført i mikrovaskulære forskningslaboratorium, Institut for ortopædisk kirurgi Mayo Clinic Rochester, MN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine | VetTek, Bluesprings, MO | N/A | 2mg/kg |
| Telazol | Pfizer Inc., NY, NY | 2103 | 5mg/kg |
| Buprenorphine | Zoo Pharm, Windsor, CO | N/A | 0.18mg/kg |
| Cefazoline | Hospira, Lake Forest, IL | RL-4539 | 1g |
| Ethilon sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | BV 130-5 | 9-0 |
| Locking plate | DePuy Synthes Vet, West Chester, PA | VP4041.09 | 9-hole 3.5mm locking plate |
| Vicryl sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | J808T | 2-0, 3-0 |
| Tegaderm | 3M Health Care, St. Paul, MN | 16006 | 15x10cm |
| Hickman catheter | Bard Access System Inc., Salt Lake City, UT | 600560 | 9.6 French |
| Carprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | 1760R-60-06-759 | 4mg/kg |
| Tacrolimus | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 973975 | (0.8-1.5mg/kg/day) |
| Mycophenolate Mofetil | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 772212 | (50-70mg/kg/day) |
| Methylprednisolone sodium succinate | Pfizer Inc., NY, NY | 2375-03-0 | 500 mg |
| Gentamicin | Sparhawk Laboratories, Lenexa, KS | 1405-41-0 | 3mg/kg |
| Dermabond Prineo | Ethicon, San Lorenzo, Puerto Rico | 6510-01-6140050 | |
| Isoflurane 99.9% 250 ml | Abbott Animal Health | 05260-5 | |
| Lactated Ringer's 1L | Baxter Corporation | JB1064 | |
| Saline 0.9%, 1 L | Baxter Corporation | 60208 | |
| Ceftiofur | Pfizer Canada Inc. | 11103 | 5mg/kg |
| Microfil | Flow Tech Inc, Carver, MA | MV-122 | 125 ml |
| Decalcifying Solution | Thermo Fisher Scientific, Chesire, WA, UK | 8340-1 |
References
- Ham, S. J., et al. Limb salvage surgery for primary bone sarcoma of the lower extremities: long-term consequences of endoprosthetic reconstructions. Ann Surg Oncol. 5, 423-436 (1998).
- Niimi, R., et al. Usefulness of limb salvage surgery for bone and soft tissue sarcomas of the distal lower leg. J Cancer Res Clin Oncol. 134, 1087-1095 (2008).
- Tukiainen, E., Asko-Seljavaara, S. Use of the Ilizarov technique after a free microvascular muscle flap transplantation in massive trauma of the lower leg. Clin Orthop Relat Res. , 129-134 (1993).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24, 1347-1353 (2009).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plast Reconstr Surg. 47, 425-431 (1971).
- Ravindra, K. V., Wu, S., McKinney, M., Xu, H., Ildstad, S. T. Composite tissue allotransplantation: current challenges. Transplant Proc. 41, 3519-3528 (2009).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388, 1398-1407 (2016).
- Brent, L. B. Tolerance and its clinical significance. World J Surg. 24, 787-792 (2000).
- Utsugi, R., et al. Induction of transplantation tolerance with a short course of tacrolimus (FK506): I. Rapid and stable tolerance to two-haplotype fully mhc-mismatched kidney allografts in miniature swine. Transplantation. 71, 1368-1379 (2001).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived neoangiogenesis with short-term immunosuppression allows incorporation and remodeling of vascularized diaphyseal allogeneic rabbit femur transplants. J Orthopaedic Res. 27, 763-770 (2009).
- Kremer, T., et al. Surgical angiogenesis with short-term immunosuppression maintains bone viability in rabbit allogenic knee joint transplantation. Plast Reconstr Surg. 131, 148e-157e (2013).
- Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. A modified vascularized whole knee joint allotransplantation model in the rat. Microsurgery. 30, 557-564 (2010).
- Ohno, T., Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived angiogenesis maintains bone blood flow after withdrawal of immunosuppression. Microsurgery. 27, 657-663 (2007).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
- Solla, F., et al. Composite tissue allotransplantation in newborns: a swine model. J Surg Res. 179, e235-e243 (2013).
- Ustuner, E. T., et al. Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies. Microsurgery. 20, 400-406 (2000).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Anim Genet. 41, 428-432 (2010).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Anim Genet. 40, 468-478 (2009).
- Morin, N., Metrakos, P., Berman, K., Shen, Y., Lipman, M. L. Quantification of donor microchimerism in sex-mismatched porcine allotransplantation by competitive PCR. BioTechniques. 37, 74-76 (2004).
- van Dekken, H., Hagenbeek, A., Bauman, J. G. Detection of host cells following sex-mismatched bone marrow transplantation by fluorescent in situ hybridization with a Y-chromosome specific probe. Leukemia. 3, 724-728 (1989).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. Am J Transplant. 14, 343-355 (2014).
- Smith, D. M., Martens, G. W., Ho, C. S., Asbury, J. M. DNA sequence based typing of swine leukocyte antigens in Yucatan miniature pigs. Xenotransplantation. 12, 481-488 (2005).
- Ho, C. S., et al. Nomenclature for factors of the SLA system, update 2008. Tissue Antigens. 73, 307-315 (2009).
- Kaiser, G. M., Heuer, M. M., Fruhauf, N. R., Kuhne, C. A., Broelsch, C. E. General handling and anesthesia for experimental surgery in pigs. J Surg Res. 130, 73-79 (2006).
- Alghoul, M. S., et al. From simple interrupted to complex spiral: a systematic review of various suture techniques for microvascular anastomoses. Microsurgery. 31, 72-80 (2011).
- Acland, R. Signs of patency in small vessel anastomosis. Surgery. 72, 744-748 (1972).
- Kotsougiani, D., et al. Recipient-derived angiogenesis with short term immunosuppression increases bone remodeling in bone vascularized composite allotransplantation: A pilot study in a swine tibial defect model. J Orthopaedic Res. , (2016).
- Riegger, C., et al. Quantitative assessment of bone defect healing by multidetector CT in a pig model. Skeletal Radiol. 41, 531-537 (2012).
- Buttemeyer, R., Jones, N. F., Min, Z., Rao, U. Rejection of the component tissues of limb allografts in rats immunosuppressed with FK-506 and cyclosporine. Plast Reconstr Surg. 97, 149-151 (1996).
- Taira, H., Moreno, J., Ripalda, P., Forriol, F. Radiological and histological analysis of cortical allografts: an experimental study in sheep femora. Arch Orthop Trauma Surg. 124, 320-325 (2004).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Transplantation of a vascularized rabbit femoral diaphyseal segment: mechanical and histologic properties of a new living bone transplantation model. Microsurgery. 28, 291-299 (2008).
- Laiblin, C., Jaeschke, G. Clinical chemistry examinations of bone and muscle metabolism under stress in the Gottingen miniature pig--an experimental study. Berliner und Munchener tierarztliche Wochenschrift. 92, 124-128 (1979).
- Saalmuller, A. Characterization of swine leukocyte differentiation antigens. Immunol Today. 17, 352-354 (1996).
- Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Aleff, R. A., Bishop, A. T. Repopulation of vascularized bone allotransplants with recipient-derived cells: detection by laser capture microdissection and real-time PCR. J Orthopaedic Res. 27, 1514-1520 (2009).
- Muramatsu, K., Kurokawa, Y., Kuriyama, R., Taguchi, T., Bishop, A. T. Gradual graft-cell repopulation with recipient cells following vascularized bone and limb allotransplantation. Microsurgery. 25, 599-605 (2005).
- Muramatsu, K., Bishop, A. T., Sunagawa, T., Valenzuela, R. G. Fate of donor cells in vascularized bone grafts: identification of systemic chimerism by the polymerase chain reaction. Plastic and reconstructive surgery. 111, 763-777 (2003).
- Vossen, M., et al. Bone quality and healing in a swine vascularized bone allotransplantation model using cyclosporine-based immunosuppression therapy. Plast Reconstr Surg. 115, 529-538 (2005).
- Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast Reconstr Surg. 87, 401-411 (1991).
