Summary
För närvarande beror någon form av simblåsa sammansatta allotransplantation på lång-sikt-immunsuppression, svårt att ha stöd för icke-liv-kritiska indikationer. Vi presenterar en ny svin tibial VCA modell som kan användas för att studera ben VCA och demonstrera användningen av kirurgiska angiogenes att bibehålla ben lönsamhet utan behov av långsiktigt immun-modulering.
Abstract
Segmentell benförlust som följd av trauma, infektion malignitet och medfödd anomali fortfarande en stor rekonstruktiv utmaning. Aktuella behandlingsalternativ har betydande risk för misslyckande och betydande sjuklighet.
Användning av ben vaskulariserad sammansatta allotransplantation (VCA) skulle erbjuda både en nära match opererande ben storlek och form samt healing och remodeling potential av levande ben. För närvarande krävs livslång drog immunsuppression (IS). Organtoxicitet, opportunistisk infektion och tumör risker är oroande att behandla sådana icke-dödliga indikationer.
Vi har tidigare visat att skelett- och VCA livskraft kan upprätthållas i råttor och kaniner utan behov av lång-sikt-immunsuppression av implantation av mottagarens härledda fartyg inom VCA. Det genererar en autogen, neoangiogenic cirkulation med mätbara flöde och aktiva ben remodeling, kräver endast 2 veckor av IS. Eftersom små djur skiljer sig från man väsentligen i anatomi, ben fysiologi och immunologi, har vi utvecklat en svin ben VCA modell för att utvärdera denna teknik innan klinisk tillämpning utförs. Miniatyr svin används för närvarande för allotransplantation forskning, givit sin immunologiska, anatomiska, fysiologiska och storlek likheter till mannen. Här beskriver vi ett nytt svin ortotop tibial ben VCA modell att testa rollen som autogen kirurgiska angiogenes att upprätthålla VCA livskraft.
De modell rekonstruerar segmentell tibial ben defekter med hjälp av storlek och form-matchade allogen tibial ben segment, transplanteras över ett stort svin leukocyt antigen (SLA) obalans i Yucatan miniatyr svin. Näringsämne fartyget reparation och implantation av mottagarens härledda autogen fartyg in i medullär kanalen av allogena tibial ben segment utförs i kombination med samtidig kortsiktiga IS. Detta möjliggör en neoangiogenic autogen cirkulation utvecklas från implanterade vävnad, upprätthålla flödet genom allogena näringsämne fartyg för en kort tid. När upprättats underhåller nya autogen cirkulationen ben lönsamhet efter avslutad läkemedelsbehandling och efterföljande näringsämnen fartyget trombos.
Introduction
Stora segmentell bendefekter följd av trauma, infektion eller lem-sparing kirurgi efter malignitet. Aktuella rekonstruktiv alternativ såsom simblåsa autogena bengraft, ben transport, protetisk ersättning och nedfrysta nekrotisk organtransplantationer, ensamt eller i kombination, är förknippade med betydande sjuklighet och har hög komplikationer1,2,3.
Förekomsten av ett mikrovaskulära nätverk är viktigt för bildandet och homeostas av ben, stödja osteogent, chondrogenic och mesenkymala stamceller krävs för ben reparation4.
Transplantation av levande allogena ben, en form av simblåsa sammansatta vävnad allotransplantation (Ben VCA), utförs med mikrokirurgisk anastomos av dess näringsämnen BLOMSTJÄLK, kan utgöra en framtida rekonstruktiv alternativ. Som frysförvarade allogent ben ges omedelbar stabilitet genom att matcha ben defekt morfologi. Som autogen simblåsa transplantat, det ger förbättrad läkning och ombyggnad av levande benvävnad. Hindret i något allotransplant förfarande kvarstår behovet av lång-sikt-immunsuppression (IS). Problemet är mer akut i rörelseorganens vävnader, som kräver 2 - 3 gånger högre än organtransplantationer5läkemedel doser. Samtidig risker inklusive organtoxicitet, malignitet, infektion eller utveckling av graft - versus - host sjukdom är svår att motivera i dessa skadeförsäkring-kritiska-program6. Episoder av akut och kronisk avstötning är dock fortfarande en stor fråga med nuvarande långsiktiga IS7. Pågående arbete med att noggrant matcha histocompatibility antigener, framkalla givare-specifika tolerans eller förbättra drog immunterapi har inte ännu rutinmässigt lyckats tillåta kliniska drogfri vävnad överlevnad8,9.
Vi har tidigare visat medel för att bevara ben VCA lönsamhet och stärka ben remodeling i små djurmodeller vid befordran av en ny autogen omsättning inom transplanterade ben. Detta görs genom att ytterligare utnyttja kirurgiska angiogenes från implanterade autogen vävnad10,11,12. Allogent ben segment transplanteras microsurgically med anastomos av de näringsämnen ben segmentet BLOMSTJÄLK. Dessutom implanteras värd-derived fartyg i medullär kanalen för segmentet allogen simblåsa ben. Under denna 2-veckors process underhålls patency allogena näringsämne fartyget med drogen immunsuppression. Efter IS-uttag, det näringsämne BLOMSTJÄLK så småningom thrombose13. Nya kapillär sängen, baserat på värd-derived fartyg ger tillräcklig cirkulation för att upprätthålla vävnad livskraft. Ben healing och remodeling förstärks sedan osteogenesis och angiogenes är kopplat10,11,12. Det krävs inga ytterligare immunterapi och ben livskraft upprätthålls långsiktig trots en immunologiskt behöriga värd och avsaknad av givare-specifika tolerans.
Översättning av denna nya metod för ben allotransplantation i klinisk praxis bör bästa föregås av ytterligare en studie av helande, mekaniska egenskaper och immunologi i en stor djurmodell. Svin modellen är perfekt för sådana VCA forskning14,15,16. Miniatyr svin är jämförbara i storlek och anatomi mannen, så att skelett återuppbyggnad använder i huvudsak identiska kirurgiska implantat och tekniker. Svin immunologi är väl definierat, inklusive svin leukocyt antigen (SLA) haplotyper och blod typer, nödvändiga för transplantationskirurgin. Cellstudier härstamning är möjligt med sex-felaktigt transplantation, liksom detaljerade analyser av immunsvar17,18,19,20,21.
Här beskriver vi ett ben VCA allotransplantation modell i Yucatan miniatyr svin, lämplig för studie av segmentell benförlust och återuppbyggnad. Denna modell kan användas för att undersöka samspelet mellan kirurgiska angiogenes och kortsiktiga IS på ben VCA överlevnad och funktion, inklusive osteocyte härstamning, ben blodflödet, healing och remodeling kapacitet, alloresponsiveness och biomekanik samt att testa andra innovativa immun immunmodulerande strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien var godkänd av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) på Mayo Clinic Rochester. Yucatan miniatyr svin tjänade som både givare och mottagare under denna operationsmetod VCA. Hopkoppling av givare och mottagare var baserad på DNA sekvens svin leukocyt antigen (SLA) haplotyping att säkerställa en större obalans i den SLA 22,23. Djuren var ålder - och vikt-matchade och av identiska blodgrupp. Två kirurgiska team samtidigt skördas ett svin tibial ben segment med dess näringsämnen fartyget från givare och beredd att mottagaren kan ta emot segmentet orthopically placerade allogen tibial ben. Samtidigt med mikrovaskulära reparation av ben näringsämnen fartyget placerades en mottagare-derived arteriovenös bunt inom segmentet tibial för autogen angiogenes.
1. presurgical preparat
- Snabb Yucatan miniatyr svin dagen före ingreppet och väga dem för kontrollerad drug administration.
- Stillsam djur med xylazin (2 mg/kg) och kombinationen Tiletamin HCL och zolazepam HCL (5 mg/kg), subkutant.
- Placera en perifer kateter i ett öra ven för intravenös narkotika och saltlösning leverans och administrerar buprenorfin (0,18 mg/kg) och Profylaktisk antibiotika (1 g cefazoline intravenös och 5 mg/kg ceftiofur intramuskulär).
- Raka det högra bakbenet och vänster halsen som ska fungera som skörden webbplats för simblåsa tibial ben segment och plats för placering av den central venkateter, respektive.
- Kontrollera vitala tecken och nivån på sedering genom att testa uppmjukning av munnen muskler.
- Intubation djuret med en lämplig storlek endotrakealtub sternala koordinationsrubbning24.
- Överföra miniatyr svin till tabellen drift och ansluta till en ventilator maskin för underhåll av anestesi genom administrering av isofluran (1-3%).
- Bekräfta det anestetiska djupet genom att testa palpebrala, pupilldeformitet ljus och korneal reflexer.
- Övervaka syremättnad med en pulse oximeter överföring sond kopplad till örat. Använda en blodtryck manschett och temperatur sond för intraoperativ vitala tecken övervakning.
- Placera Yucatan miniatyr svin i ryggläge på en värmande pad. Dessutom använda en Tvingad-air värmande filt under operationen för att förhindra hypotermi.
- Använda vet salva på ögon för att förhindra torrhet under anestesi.
2. skörden av en simblåsa Tibial ben Segment
- Tvätta det högra benet av varje miniatyr svin med povidon-jodlösning. Torka huden med en steril handduk och drapera extremiteten i en steril mode. Omsluta och isolera lem med en jod impregnerade självhäftande snitt drapera att minimera risken för kontaminering.
- Utföra ett snitt med en skalpell anterolaterally i det bakbenet, med början i knäleden, sträcker sig distalt längs främre åsen av skenbenet tibiotalar gemensamma.
- Dissekera huden och subkutana vävnaden med sax och dra tillbaka de främre facket musklerna från skenbenet sidled.
Obs: Release av tibialis anterior muskler ursprung underlättar exponering. Interosseous membranet utsätts nu. - Identifiera den kraniala tibial artären och ven (för att användas senare som den arteriovenösa bunten för den kirurgiska angiogenes).
Obs: Den kraniala tibial artär och ven ligga på den främre ytan av interosseous membranet. - Att förbättra det operativa synfältet, släppa en del från tibialis anterior muskler från dess införande och ta bort en del av tibial åsen med en oscillerande såg.
- Skydda de kraniala tibial fartyg, incisionsfilm interosseous membranet början på nivån för den tibial knöl med en sax.
- Visualisera de kaudala tibial fartyg, kör distalt under membranet.
Obs: De gren från de kraniala tibial fartyg och ge upphov till de näringsämnen BLOMSTJÄLK av den tibial diaphysis precis distalt knöl. Det är nu möjligt att visualisera de näringsämnen foramen och fartyg som anlöper skenbenet på dess bakre laterala ytan precis distalt till den tibial tuberkel. - Tagga den näringsämnen BLOMSTJÄLK med en microclamp. Inte lossa den vaskulär BLOMSTJÄLK.
- Identifiera en muskel gren i tibialis anterior facket nära näringsämnen foramen; Detta kan användas för anastomos till simblåsa ben allotransplant näringsämnen fartyget. Markera den muskel grenen med en microclamp.
-
Skörd av ett 3,5 cm tibial ben segment inklusive den vaskulär BLOMSTJÄLK.
- Använd en skärande Jigg för att säkerställa en exakt och reproducerbar ben resektion. Position och fixa styckning jigg på den mediala ytan av skenbenet att inkludera näringsämnen foramen och fartyg.
- Guidad av jiggen, utföra parallella ben nedskärningar med en oscillerande såg att ta bort ett 3,5 cm tibial segment. Använd samma positionering och Jigg för både givare och mottagare djur för att maximera storlek - och form-match.
- Använd en skärande Jigg för att säkerställa en exakt och reproducerbar ben resektion. Position och fixa styckning jigg på den mediala ytan av skenbenet att inkludera näringsämnen foramen och fartyg.
- När båda nedskärningarna har gjorts med oscillerande såg, rotera segmentet tibial ben för att visualisera den näringsämnen BLOMSTJÄLK på den bakre ytan. Dela upp de näringsämnen BLOMSTJÄLK på sitt ursprung från den kraniala tibial artären med sax. Dissekera och gratis tibial segmentet med sax, lämnar en tunn mudd periostet och muskler på dess yta.
- Tillbaka segmentet tibial ben och höja segmentet tibial ben med dess vaskulär BLOMSTJÄLK med en kraftig klämma, lämnar den kraniala tibial artären på plats.
Obs: Segmentet simblåsa ben är nu klar för mikrovaskulära överföring och en 3,5 cm tibial ben defekt har skapats i varje Yucatan miniatyr svin. - Ligera kraniala tibial fartyg vid vristen med resorberbara polyglactin 3-0 suturer, frigöra dem med en manschett av perivaskulär vävnad för att skapa ett arteriovenösa (AV)-bundle. Lämna de suturer minst 5 cm lång att underlätta implantation i segmentet tibial ben.
3. ortotop Tibial benrekonstruktion VCA i kombination med kirurgisk angiogenes
-
Utbyta segmenten skördade tibial ben med dess näringsämnen pediklarna mellan de två djur att använda dem som ben VCAs.
- För att tillåta passage av kraniala tibial arteriovenösa (AV) bunt i segmentet tibial ben, ta bort V-formade segment från proximala junction sajten med den oscillerande såg.
- Borra ett hål i den distala delen av Tibia benet defekten och in i medullär kanalen för segmentet tibial ben diameter på 0,5 cm och införa mottagaren AV paketet som har varit sammanskrivna distalt, in i intramedullary kanalen att främja efterföljande autogen nytt blod leverans.
-
Placera de simblåsa tibial ben segmentet orthotopically i mottagarens defekten.
- Anastomose de näringsämnen BLOMSTJÄLK för segmentet tibial ben till beredda muskel grenen av det tibial främre facket i ett slutet-till slutet sätt använder den enkla avbrutna sutur tekniken och 9-0 suturer25.
- Bekräfta patency av mikrovaskulära anastomos med mjölkning test26.
-
Uppnå osteosyntes med en 9-håls 3,5 mm låsa pläterar.
- Plats 9-håls plattan på den tibia anteromedially. Fäst plattan med tre bicortical skruvar över och under segmentet tibial ben. Dessutom placera unicortical skruvarna i segmentet tibial ben för intern fixation. Bekräfta rätt positionering av ben VCA och plattan, använda anteroposterior och laterala röntgenbilder.
- Utföra fascian och lager hud stängning med avbrutna 3-0 och 2-0 resorberbara suturer. Slutligen försegla såret med en transparent täckförbandet.
4. central venkateter placering i Jugular yttre ven
-
För postoperative drug administration och immunosuppressiva (IS) drog övervakning, placera en venkateter i yttre halsvenen med öppen teknik. Utföra placering vid avslutningen av förfarandet allotransplantation under anestesi (se avsnitt 1).
- Utföra ett anterolateralt snitt i halsen med en skalpell. Dissekera den subkutana vävnaden med sax och exponera den vänstra halsvenen.
- Placera en Hickman kateter i halsvenen genom ett litet hål i den yttre halsvenen och fäst det med icke-resorberbara suturer. Exteriorize katetern i ryggen av tunneling subkutant.
- Säkra katetern på plats på huden och nära nacken i lager med hjälp av avbrutna 3-0 och 2-0 resorberbara suturer.
- Placera ocklusiva bandage över snittet. Använd ett Nätstrumpor bandage för att hålla bandage och katetern på plats.
5. postoperativ behandling och uppföljning
- Genast efter operationen, behandla Yucatan miniatyr svin med en intramuskulär injektion av karprofen (4 mg/kg) för postoperativ smärtlindring. Administrera buprenorfin (0,18 mg/kg) för att behandla smärta av hög intensitet som behövs.
- Låt grisen att återhämta sig för 60 min och sedan återvända grisen till en särskild intensivvårdsavdelning pan och övervaka noga tills fullständig återhämtning.
- Flytta de Yucatan miniatyr svin en normal bur och ge ad libitum tillgång till vatten och mat.
- Administrera takrolimus (0,8-1,5 mg/kg/dag) och mykofenolatmofetil (MMF) (50-70 mg/kg/dag) oralt och metylprednisolon natrium succinat intravenöst (start med 500 mg/dag) under två veckor.
- Justera dagliga doser av Immunosuppressiva läkemedel enligt tråg i blodet, siktar på 5.0-30,0 ng/mLför takrolimus och 1,0-3,5 µg/mL för MMF, respektive. Minska dosen av metylprednisolon gradvis tills underhållsdosen av 50 mg per dag uppnås.
- Administrera Profylaktisk antibiotika gentamicin (3 mg/kg intravenöst) och ceftiofur (5 mg/kg intramuskulärt) i två veckor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrivna tekniken utfördes framgångsrikt i fyra SLA stora inkompatibla Yucatan miniatyr svin och segmentell tibial defekter rekonstrueras med hjälp av storlek-matchade tibial VCA. Samtidiga näringsämnen fartyget reparation av den ben allotransplant och implantation av en AV bunt från mottagarens djur inom allotransplant medullär kanalen tillåts både omedelbar ben omsättning och utveckling av en ny autologt blod leverans över tid (figur 1). På 16 veckor hade en neoangiogenic omsättning upprättats inom allt tibial VCAs, visualiseras av mikro-beräknas tomografiska (mikro-CT) angiografi efter injektion av en röntgentät angiografiska polymer (125 ml) till femorala fartyg och Avkalkning av tibial VCA (figur 2).
Figur 1 : Ortotop tibial ben VCA förfarande. Diagrammet visar det kirurgiska ingreppet. (A) givare förfarande: skörd av ett tibial ben segment med dess näringsämnen BLOMSTJÄLK. (B) utbyte av segmenten tibial ben mellan stora SLA omaka svin. (C) förfarandet för mottagaren: arteriovenös bunt implantation: kraniala tibial fartyg förs försiktigt in medullär kanalen. (D) mikrovaskulära anastomos av de näringsämnen BLOMSTJÄLK till muskel grenen av den främre tibial fack och plattan osteosyntes av den tibial diaphysis. Används med tillstånd av Mayo stiftelse för medicinsk utbildning och forskning. Alla rättigheter reserverade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativ 3D mikro-CT angiografisk bild av ett urkalkade tibial VCA segment. Neongiogenic cirkulationen (gul pil) är avbildad efter perfusion med en röntgentät kisel lösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Miniatyr svin visade inga tecken på ångest eller självstympning. Alla sår läkt utan infektion och djur ambulated normalt, i slutändan kunna bära hela tyngden på den opererade höger lem från den första postoperativa dagen på. I studien slutpunkten vid 16th veckor alla Yucatan miniatyr svin hade vunnit över 150% av deras ursprungliga kroppsvikt (pretransplant: 56,0 ± 6.1 kontra 16 veckor signifikant: 84,5 ± 6.0).
Två veckor av immunsuppression, bestående av takrolimus, användes mykofenolatmofetil (MMF) och metylprednisolon succinat att bibehålla blodflödet genom de näringsämnen BLOMSTJÄLK tills en ny autologt blod leverans hade upprättats inom det allogena Ben allotransplant. Under 2 veckan togs immunsuppression regelbundna blodprov från jugular katetern att bedöma drogen i blodet. Doserna justerades för att bibehålla tråg blodet på 5-30 ng/ml för takrolimus och 1-3,5 µg/ml för MMF (tabell 1). Inga läkemedelsrelaterade komplikationer inträffade och siktat dalvärdena för takrolimus och mykofenolatmofetil kan uppnås (figur 3 och figur 4).
| Immunsuppressivt medel | Initiala dosen | Dalvärden | Underhållsdos |
| Takrolimus | 0,8-1,5 mg/kg/dag | 5-30 ng/ml | |
| Mykofenolatmofetil | 50-70 mg/kg/dag | 1-3 µg/ml | |
| Metylprednisolon natrium succinat | 500 mg | 50 mg |
Tabell 1: kort sikt immunsuppression protokollet. Skildras är immunosuppressiva protokollet för de första två veckorna efter transplantation med startdosen för takrolimus, mykofenolatmofetil och prednisolon. Dessutom syftar dalvärdena för takrolimus och Mycophenolate mofetil och underhållsdosen av prednisolon visas.
Figur 3 : Blod dalvärdena för takrolimus. Den median och interkvartilintervall av de uppnådda dalvärdena för takrolimus över första 2 veckor efter transplantation är avbildade. Felstaplar betecknar interkvartilintervall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Blod dalvärden för mykofenolatmofetil. De median och interkvartilintervall tråg av i blodet mykofenolatmofetil under kortsiktiga immunosupression 2 veckor visas. Felstaplar betecknar interkvartilintervall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Trots upphörande av immunsuppression efter två veckor, periodiska radiologiska bedömning vid olika tidpunkter (2, 4, 6, 10 och 16 veckor) av de opererade höger bakbenen med röntgen visade progressiva ben healing över studien perioden 16 veckor när betygsätts av två oberoende och blindad observatörer (figur 5)27,28. Micro-CT analys på 16th veckor har använts för att kvantifiera både volym och täthet av förhårdnader samt överbrygga benbildning vid värd och ben VCA korsningar och ben VCA allotransplant utseende27. Underhåll av intern fixation utan förlust minskning eller Mister främjas av nya autogen blodtillförseln, kunde vara visat28. Bendefekter unionen uppnåddes alla förbenade (figur 6).
Figur 5: Ben helande progression under 16 veckor. Om du vill definiera benet healing progression en icke-linjär regressionsmodell användes. Den värde R2 användes för att definiera passformen av modellen till data. Använder ett poängsystem, baserat på anteroposterior och laterala röntgenbilder osseointegration av ben VCA i segmentell ben felet gjorde var med ett högsta värde på 25 poäng på olika tid pekar över studieperioden (2, 4, 6, 10 och 16 veckor) med två oberoende, blindad observatörer30,31. Icke-linjära regressionsmodellen skildrar median och interkvartilintervall för benet healing värden över studieperioden (R2 = 0.931) visar en kontinuerlig ben healing progression tillnärma värdet av 25 på 16 veckor. Felstaplar betecknar interkvartilintervall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Tredimensionell rekonstruktion av det svin tibial diaphysis efter mikro-beräknas tomografiska utvärdering. Representant tredimensionella beräknas bilden av rekonstruerade skenbenet med inre platta fixering vid 2 x faktiska storlek. 16 veckors komplett unionen efter tibial ben VCAs med kirurgisk angiogenes visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Histologisk analys på hematoxylin-eosin undecalcified målat sektioner, med en tidigare beskrivna skala gradering avstötning (ingen, mild, måttlig och svår) visade inga tecken på svår rejektion, whereby mild och måttlig tecken på rejektion kan vara påvisats i tre grisar (diagram 7)29.
Figur 7: Representativ bild av en horisontell hematoxylin-eosin målat avsnitt från en tibial VCA. Röntgentät kisel lösning-fyllda fartyg är visas brown (asterisk). Mild endosteala infiltration och reaktion (tjock pil) ses med över två tredjedelar av de lacunas fylld med osteocyter (liten pil) i enlighet med hållbara ben. 10 X förstoring. Skalstapeln = 300 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transplantation av simblåsa allogent ben (Ben VCA) kan utgöra en framtida rekonstruktiv alternativet för stora segmentell bendefekter. Men är behovet av lång-sikt-immunsuppression (IS) och dess betydande biverkningar som krävs för ben VCA överlevnad svårt att motivera dessa skadeförsäkring-kritiska-program6.
Även om inavlade stammar av laboratoriet råtta har använts flitigt i allotransplantation forskning för att testa olika metoder för att undvika lång-sikt-immunsuppression, kan svin modeller ge betydande fördelar8,9 . Yucatan mini grisen är idealisk för studiet av den komplexa processen att Ben VCA avvisande. Fysiologiskt, nya ben bildandet är jämförbar med mannen (svin 1,2-1,5 µm per dag; människor 1,0-1,5 µm per dag respektive)32. Anatomiska likheter möjliggöra användning av ortotop benrekonstruktion använder i huvudsak identiska kirurgiska implantat och tekniker. Kanske viktigast av allt, de väldefinierade svin alloresponse-gjorde möjligheten av framsteg på svin cytokin upptäckt och utveckling av anti svin kluster av differentiering antikroppar-gör detta och andra VCA studier mer rigorösa33.
Som i alla liknande klinisk tillämpning, metoden för svin tibial defekt benrekonstruktion använder ben VCA är tekniskt krävande, som kräver två teamarbete med tillräcklig kirurgisk expertis i mikrovaskulära kirurgi och ben återuppbyggnad för att reproducerbara resultat. Strikt upprätthållande av sterila intraoperativ förhållanden och perioperativ antibiotikaprofylax är obligatoriskt att minska risken för infektiösa komplikationer.
I tidigare studier med råttor och kaniner underhålls kortsiktiga IS livskraft simblåsa ben allotransplants under de första 2 veckorna genom perfusion av ben VCA genom dess allogena näringsämne fartyget. Efter immunsuppression uttag mottagaren härstammar fartyg inom som medullär kanalen kärlnybildning som möjliggör långsiktiga benläkning VCA och livskraft10,11,12. Vid studiens endpoint hade kunde betydande allotransplant chimärism vara upptäckta34,35,36. Vi har flyttat fram och tillämpas vår råtta och kanin väletablerade metodik på svin modellen. Denna modell är möjligt att testa ett nytt sätt att upprätthålla vävnad lönsamhet utan långsiktiga IS i ben VCA forskning, med kirurgisk angiogenes från implanterade autogen fiskefartyg kombinerat med kortsiktiga IS, effektivt växla ben cirkulationen från allogena autogen fartyg.
En stor fördel med denna modell över andra befintliga svin ben som innehåller VCA modeller är dess ortotop design möjliggör Funktionsutvärdering av viktbärande och bedömning av mekaniska egenskaper, uppgifter som är särskilt glesa14, 37. den komplex mekanismen för lokala och systemiska ben VCA avslag kan enkelt övervakas genom radiologiska och histologisk utvärdering av segmentet allotransplanterad tibial ben samt molekylär biologisk analys av perifert blod. Ytterst möjliggör låg dödligheten i kirurgiska ben VCA förfarandet långsiktiga ben VCA överlevnad och analys.
Stabil intern fixation, ordentlig allogen tibial ben segmentet apposition och lem justering är avgörande för att tillåta förflyttningar av svin den första postoperativa dagen och kräver noggrann presurgical planering. Den metod vi har valt med hjälp av en speciellt utformad skärande Jigg för exakt och reproducerbar ben resektion kombinerat med plattan osteosyntes är tillräckligt stabil för att tillåta stel fixering i allotransplants, även i de med minimal storlek mismatches.
En begränsning av presenterade tekniken är att den inte tillåter bedömning av olika vävnad komponenter som hud och muskel förutom komponenten simblåsa ben. Även en komposit lock inklusive olika vävnad komponenter är möjligt, har denna modell utformats för att studera exklusiva ben allotransplantation immunogeniciteten hos olika VCA vävnad compontents varierar38.
Avslutningsvis ger denna artikel information för att upprätta en reproducerbar stora djurmodell med definierade genetik för ben VCA forskning. Denna modell kan utgöra grund för framtida studier som undersöker påverkan av kirurgiska angiogenes på ben blodflödet och benremodellering och kan eliminera behovet av långsiktiga immunsuppression. Det kan dessutom användas för att avgränsa den komplexa processen att Ben VCA avvisande och testa andra innovativa immun immunmodulerande strategier. Definierade SLA-haplotyper och kvantifiering av SRY-gener i sex-felaktigt svin får tillåta fastställande av omfattningen av chimärism allotransplant och perifert blod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka de Division of Media Support Services, Mayo Clinic Rochester, MN för videoproduktion samt Georgios Kotsougianis för redigering av video. Den utmärkta teckningen genomfördes av Jim Postier, Rochester, MN. Dessutom författarna vill tacka den tyska forskningsfondens (Deutsche Forschungsgemeinschafts) för att ge lön stöd för Dr. Dimitra Kotsougiani (DFG grant: KO 4903/1-1). Detta arbete stöds av en generös gåva från Tarek E. Obaid. Detta arbete utfördes i mikrovaskulära forskningslaboratorium, Institutionen för ortopedisk kirurgi Mayo Clinic Rochester, MN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine | VetTek, Bluesprings, MO | N/A | 2mg/kg |
| Telazol | Pfizer Inc., NY, NY | 2103 | 5mg/kg |
| Buprenorphine | Zoo Pharm, Windsor, CO | N/A | 0.18mg/kg |
| Cefazoline | Hospira, Lake Forest, IL | RL-4539 | 1g |
| Ethilon sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | BV 130-5 | 9-0 |
| Locking plate | DePuy Synthes Vet, West Chester, PA | VP4041.09 | 9-hole 3.5mm locking plate |
| Vicryl sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | J808T | 2-0, 3-0 |
| Tegaderm | 3M Health Care, St. Paul, MN | 16006 | 15x10cm |
| Hickman catheter | Bard Access System Inc., Salt Lake City, UT | 600560 | 9.6 French |
| Carprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | 1760R-60-06-759 | 4mg/kg |
| Tacrolimus | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 973975 | (0.8-1.5mg/kg/day) |
| Mycophenolate Mofetil | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 772212 | (50-70mg/kg/day) |
| Methylprednisolone sodium succinate | Pfizer Inc., NY, NY | 2375-03-0 | 500 mg |
| Gentamicin | Sparhawk Laboratories, Lenexa, KS | 1405-41-0 | 3mg/kg |
| Dermabond Prineo | Ethicon, San Lorenzo, Puerto Rico | 6510-01-6140050 | |
| Isoflurane 99.9% 250 ml | Abbott Animal Health | 05260-5 | |
| Lactated Ringer's 1L | Baxter Corporation | JB1064 | |
| Saline 0.9%, 1 L | Baxter Corporation | 60208 | |
| Ceftiofur | Pfizer Canada Inc. | 11103 | 5mg/kg |
| Microfil | Flow Tech Inc, Carver, MA | MV-122 | 125 ml |
| Decalcifying Solution | Thermo Fisher Scientific, Chesire, WA, UK | 8340-1 |
References
- Ham, S. J., et al. Limb salvage surgery for primary bone sarcoma of the lower extremities: long-term consequences of endoprosthetic reconstructions. Ann Surg Oncol. 5, 423-436 (1998).
- Niimi, R., et al. Usefulness of limb salvage surgery for bone and soft tissue sarcomas of the distal lower leg. J Cancer Res Clin Oncol. 134, 1087-1095 (2008).
- Tukiainen, E., Asko-Seljavaara, S. Use of the Ilizarov technique after a free microvascular muscle flap transplantation in massive trauma of the lower leg. Clin Orthop Relat Res. , 129-134 (1993).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24, 1347-1353 (2009).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plast Reconstr Surg. 47, 425-431 (1971).
- Ravindra, K. V., Wu, S., McKinney, M., Xu, H., Ildstad, S. T. Composite tissue allotransplantation: current challenges. Transplant Proc. 41, 3519-3528 (2009).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388, 1398-1407 (2016).
- Brent, L. B. Tolerance and its clinical significance. World J Surg. 24, 787-792 (2000).
- Utsugi, R., et al. Induction of transplantation tolerance with a short course of tacrolimus (FK506): I. Rapid and stable tolerance to two-haplotype fully mhc-mismatched kidney allografts in miniature swine. Transplantation. 71, 1368-1379 (2001).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived neoangiogenesis with short-term immunosuppression allows incorporation and remodeling of vascularized diaphyseal allogeneic rabbit femur transplants. J Orthopaedic Res. 27, 763-770 (2009).
- Kremer, T., et al. Surgical angiogenesis with short-term immunosuppression maintains bone viability in rabbit allogenic knee joint transplantation. Plast Reconstr Surg. 131, 148e-157e (2013).
- Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. A modified vascularized whole knee joint allotransplantation model in the rat. Microsurgery. 30, 557-564 (2010).
- Ohno, T., Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived angiogenesis maintains bone blood flow after withdrawal of immunosuppression. Microsurgery. 27, 657-663 (2007).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
- Solla, F., et al. Composite tissue allotransplantation in newborns: a swine model. J Surg Res. 179, e235-e243 (2013).
- Ustuner, E. T., et al. Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies. Microsurgery. 20, 400-406 (2000).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Anim Genet. 41, 428-432 (2010).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Anim Genet. 40, 468-478 (2009).
- Morin, N., Metrakos, P., Berman, K., Shen, Y., Lipman, M. L. Quantification of donor microchimerism in sex-mismatched porcine allotransplantation by competitive PCR. BioTechniques. 37, 74-76 (2004).
- van Dekken, H., Hagenbeek, A., Bauman, J. G. Detection of host cells following sex-mismatched bone marrow transplantation by fluorescent in situ hybridization with a Y-chromosome specific probe. Leukemia. 3, 724-728 (1989).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. Am J Transplant. 14, 343-355 (2014).
- Smith, D. M., Martens, G. W., Ho, C. S., Asbury, J. M. DNA sequence based typing of swine leukocyte antigens in Yucatan miniature pigs. Xenotransplantation. 12, 481-488 (2005).
- Ho, C. S., et al. Nomenclature for factors of the SLA system, update 2008. Tissue Antigens. 73, 307-315 (2009).
- Kaiser, G. M., Heuer, M. M., Fruhauf, N. R., Kuhne, C. A., Broelsch, C. E. General handling and anesthesia for experimental surgery in pigs. J Surg Res. 130, 73-79 (2006).
- Alghoul, M. S., et al. From simple interrupted to complex spiral: a systematic review of various suture techniques for microvascular anastomoses. Microsurgery. 31, 72-80 (2011).
- Acland, R. Signs of patency in small vessel anastomosis. Surgery. 72, 744-748 (1972).
- Kotsougiani, D., et al. Recipient-derived angiogenesis with short term immunosuppression increases bone remodeling in bone vascularized composite allotransplantation: A pilot study in a swine tibial defect model. J Orthopaedic Res. , (2016).
- Riegger, C., et al. Quantitative assessment of bone defect healing by multidetector CT in a pig model. Skeletal Radiol. 41, 531-537 (2012).
- Buttemeyer, R., Jones, N. F., Min, Z., Rao, U. Rejection of the component tissues of limb allografts in rats immunosuppressed with FK-506 and cyclosporine. Plast Reconstr Surg. 97, 149-151 (1996).
- Taira, H., Moreno, J., Ripalda, P., Forriol, F. Radiological and histological analysis of cortical allografts: an experimental study in sheep femora. Arch Orthop Trauma Surg. 124, 320-325 (2004).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Transplantation of a vascularized rabbit femoral diaphyseal segment: mechanical and histologic properties of a new living bone transplantation model. Microsurgery. 28, 291-299 (2008).
- Laiblin, C., Jaeschke, G. Clinical chemistry examinations of bone and muscle metabolism under stress in the Gottingen miniature pig--an experimental study. Berliner und Munchener tierarztliche Wochenschrift. 92, 124-128 (1979).
- Saalmuller, A. Characterization of swine leukocyte differentiation antigens. Immunol Today. 17, 352-354 (1996).
- Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Aleff, R. A., Bishop, A. T. Repopulation of vascularized bone allotransplants with recipient-derived cells: detection by laser capture microdissection and real-time PCR. J Orthopaedic Res. 27, 1514-1520 (2009).
- Muramatsu, K., Kurokawa, Y., Kuriyama, R., Taguchi, T., Bishop, A. T. Gradual graft-cell repopulation with recipient cells following vascularized bone and limb allotransplantation. Microsurgery. 25, 599-605 (2005).
- Muramatsu, K., Bishop, A. T., Sunagawa, T., Valenzuela, R. G. Fate of donor cells in vascularized bone grafts: identification of systemic chimerism by the polymerase chain reaction. Plastic and reconstructive surgery. 111, 763-777 (2003).
- Vossen, M., et al. Bone quality and healing in a swine vascularized bone allotransplantation model using cyclosporine-based immunosuppression therapy. Plast Reconstr Surg. 115, 529-538 (2005).
- Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast Reconstr Surg. 87, 401-411 (1991).
