L'isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

Summary

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Abstract

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Introduction

bioenergetica mitocondriale e le capacità respiratorie possono essere studiate non solo nelle cellule o fibre permeabilizzate ma anche nei mitocondri isolati. Nel presente studio, si descrive un protocollo per isolare intatte mitocondri dei muscoli scheletrici con centrifugazione differenziale per misure respirometria ad alta risoluzione.

Per isolare mitocondri intatti per respirometria, il tessuto è omogeneizzata e mitocondri sono isolati mediante un metodo differenziale centrifugazione convenzionale. Il metodo differenziale centrifugazione si basa su centrifugazioni sequenziali (in una serie di aumentare la velocità) di omogenati di tessuti è stato introdotto da Pallade e collaboratori quasi 70 anni fa ^1. Il tessuto viene prima tritata con le forbici e omogeneizzato meccanicamente in un omogeneizzatore di vetro con un pestello larghi. Successivamente l'omogenato viene centrifugato a bassa velocità e il pellet risultante che contiene tessuto ininterrotta, cellulardetriti e nuclei viene scartato. Poi, il surnatante viene centrifugato più volte ad alta velocità e la frazione arricchita mitocondriale viene raccolta. I vantaggi del metodo differenziale centrifugazione per isolare i mitocondri sono che: i) il metodo è veloce e mitocondri può essere isolato all'interno 1-1,5 h (esperimenti respiratorie devono essere eseguite più velocemente possibile); ii) è poco costoso; e iii) è molto efficiente e mitocondri ottenuti mediante centrifugazione differenziale sono abbastanza puro per analisi respirometria. Gli svantaggi di metodo centrifugazione differenziale per isolare i mitocondri sono che i) i mitocondri possano venire danneggiati e sganciato durante l'omogeneizzazione; ii) la contaminazione dei mitocondri con altri componenti cellulari (potrebbe essere risolto ulteriore lavaggio del pellet mitocondriale con fasi di centrifugazione accessorie); iii) la possibilità di selezionare differenti sottopopolazioni mitocondriali, per esempio, durante centrifugazioni differenziali gradini, mitochondria con denso inferiore può essere esclusa ^7; e iv) l'mitocondriale circostante cellulare è mancante e solo la respirazione massimo teorico può essere misurata. Un altro metodo per isolare mitocondri per i saggi respirometria è il gradiente di centrifugazione densità ^2. In questa tecnica, l'estratto tissutale è stratificato su una soluzione di saccarosio o un gradiente Percoll (con densità maggiore nella parte inferiore del tubo di centrifugazione) e centrifugati a una certa velocità, causando i mitocondri essere isolati da altri componenti cellulari secondo la loro densità. Questo metodo viene spesso utilizzato per isolare i mitocondri cerebrali con molto bassa contaminazione da sinaptosomi. Tuttavia, i mitocondri di fegato di ratto isolati dal gradiente di densità centrifugazione sono altamente contaminati con altri organelli cellulari ^3. Uno dei limiti di questo metodo è che il gradiente di saccarosio presente nel tubo di centrifugazione può rompersi cosìMi mitocondri (shock osmotico).

A seconda del tipo di tessuto; ci sono alcuni fattori importanti da considerare per l'isolamento dei mitocondri intatti mediante centrifugazione differenziale. La prima necessità è di omogeneizzare i tessuti in un modo delicato. I tessuti molli come il rene, cervello e fegato richiedono forze meccaniche dolci applicate durante l'omogeneizzazione. Questo contrasta con i tessuti duri come il muscolo cardiaco e scheletrico che richiedono forze meccaniche molto più forti. Il tessuto tritato è di solito trattato con proteinasi prima della omogeneizzazione per ammorbidire i tessuti. Tutti i buffer utilizzati durante l'omogeneizzazione e centrifugazione devono essere ghiacciata e avere un pH fisiologico rilevante con una forza ionica e osmotica compatibile con citosol ^{4, 5.}

Uno dei vantaggi di studiare isolato bioenergetica mitocondriale è che le membrane plasmatiche cellulari non devono essere permeabilitàzato con detergenti quali digitonina o saponina ^{4, 6,} che potrebbero compromettere l'integrità della membrana mitocondriale esterna. Un altro vantaggio del mitocondri isolati è l'assenza di altri fattori citosolici, che possono interferire con l'analisi delle funzioni mitocondriali quali il consumo di ossigeno. Gli svantaggi di usare mitocondri isolati sono possibili selezione di alcune popolazioni mitocondriali durante le fasi di centrifugazione, danni ai mitocondri durante l'omogeneizzazione, e la necessità di elevate quantità di campioni biologici per ottenere una buona resa di mitocondri isolati ^{7, 8.}

Dopo la procedura di isolamento, la frequenza respiratoria dei complessi mitocondriali I-, II- e IV-dipendenti (stati 2, 3 e 4) sono determinati utilizzando ad alta risoluzione respirometria. Per complesso I-guidato la respirazione, il glutammatoe malato sono aggiunti seguito da adenosina difosfato (ADP). Per complesso respirazione II-driven, succinato è aggiunto seguito da ADP. Per complesso IV-driven respirazione, ascorbato e tetramethylphenylendiamine (TMPD) sono aggiunti seguiti da ADP ^{9, 10, 11, 12.} Stato 2 si riferisce al consumo di ossigeno in presenza dei soli substrati. Stato 3 si riferisce al consumo di ossigeno in presenza di substrati e ADP. Stato 4 si riferisce al consumo di ossigeno dopo l'esaurimento ADP. Il rapporto di controllo respiratorio (RCR) è un indice di accoppiamento della produzione di ATP consumo di ossigeno e viene calcolato come rapporto tra stato 3 e 4 dello stato ^{13, 15.}

In sintesi, si descrive un protocollo per isolare i mitocondri dei muscoli scheletrici e funzionali intatti per centrifugazione differenziale e utilizzare questi isolati mitochondria per studi funzionali e bioenergetici, come ad alta risoluzione respirometria.

Protocol

La biopsia muscolo quadricipite viene prelevata da un suino anestetizzato, da cui i mitocondri sono isolate mediante centrifugazione differenziale. Il maiale viene utilizzata in seguito per un altro esperimento. Lo studio è effettuata in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute per la cura e l'uso di animali da esperimento e con l'approvazione del Comitato cura degli animali del Canton Berna, Svizzera. 1. Omogeneizzazione muscolo scheletrico e isolamento mitoco…

Representative Results

Complesso I-dipendente respirazione Isolati tassi mitocondriali complessi I dipendenti delle vie respiratorie (stati 2, 3 e 4) sono determinati utilizzando ad alta risoluzione respirometria (figura 1, un diagramma rappresentante). Mitocondriali substrati del complesso I, glutammato e malato, vengono aggiunti seguiti con l'aggiunta di ADP. Stato 2 si riferisce al consumo di ossigeno in pres…

Discussion

Nel presente studio si descrive un protocollo per isolare alta qualità, intatta e strettamente accoppiati mitocondri muscolari scheletriche mediante centrifugazione differenziale che possono essere utilizzati per gli studi funzionali come ad alta risoluzione respirometria.

Per isolare mitocondri intatti e strettamente accoppiati, ci sono alcuni punti critici da considerare all'interno del presente protocollo. Dopo la raccolta del tessuto scheletrico, va subito immerso in tampone isolame…

Materials

ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
ATP	Sigma	A 7699	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
EGTA	fluka	3779	Chemical
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)	Merck	1.06129	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial	Sigma	P 8038	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser	schuett-biotec GmbH	3.201 011	Tissue homogenizer
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical