Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución

Summary

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Abstract

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Introduction

bioenergética mitocondrial y capacidades respiratorias pueden ser estudiados no sólo en las células permeabilizadas o fibras, sino también en las mitocondrias aisladas. En el presente estudio, se describe un protocolo para aislar las mitocondrias del músculo esquelético intactas utilizando centrifugación diferencial para las mediciones de respirometría de alta resolución.

Para aislar las mitocondrias intactas para respirometría, el tejido se homogeneiza y mitocondrias están aislados por un método de centrifugación diferencial convencional. El método de centrifugación diferencial se basa en centrifugaciones secuenciales (en una serie de aumentar la velocidad) del tejido homogeneizado fue introducido por primera vez por Pallade y compañeros de trabajo hace casi 70 años ^1. El tejido se pica primero con unas tijeras y se homogeneiza mecánicamente en un homogeneizador de vidrio con una mano de mortero holgada. Después, el homogeneizado se centrifugó a baja velocidad y el sedimento resultante que contiene tejido ininterrumpida, celularescombros y los núcleos se desecha. Entonces, el sobrenadante se centrifugó varias veces a alta velocidad y se recoge la fracción enriquecida mitocondrial. Las ventajas del método de centrifugación diferencial para aislar las mitocondrias son que: i) el método es rápido y mitocondrias se puede aislar dentro de 1-1,5 h (experimentos respiratorias deben realizarse lo más rápido posible); ii) que es barato; y iii) es muy eficiente y las mitocondrias obtenidos por centrifugación diferencial son lo suficientemente puro para los ensayos de respirometría. Las desventajas de método de centrifugación diferencial para aislar las mitocondrias son que: i) las mitocondrias podrían dañarse y desacoplado durante la homogeneización; ii) la contaminación de las mitocondrias con otros componentes celulares (se podría solucionar por lavado adicional el sedimento mitocondrial con etapas de centrifugación adicionales); iii) la posibilidad de seleccionar diferentes subpoblaciones mitocondriales, por ejemplo, durante centrifugaciones diferenciales pasos, mitochondria con menor densidad se puede excluir ^7; y iv) la mitocondrial circundante celular que falta y sólo la respiración máxima teórica se puede medir. Otro método para aislar las mitocondrias para los ensayos de respirometría es el gradiente de densidad de centrifugación ^2. En esta técnica, el extracto de tejido se coloca en capas sobre una solución de sacarosa o un gradiente de Percoll (con una mayor densidad en la parte inferior del tubo de centrifugación) y se centrifugó a una velocidad determinada, haciendo que las mitocondrias que ser aislado de otros componentes celulares de acuerdo con su densidades. Este método se utiliza a menudo para aislar las mitocondrias del cerebro con muy baja contaminación de sinaptosomas. Sin embargo, las mitocondrias de hígado de rata aislados por centrifugación en gradiente de densidad están altamente contaminados con otros orgánulos celulares ^3. Una de las limitaciones de este método es que el gradiente de sacarosa presente en el tubo de centrifugación podría romperse tanMe mitocondrias (choque osmótico).

Dependiendo del tipo de tejido; hay algunos factores importantes a considerar para el aislamiento de las mitocondrias intactas por centrifugación diferencial. La primera necesidad es para homogeneizar los tejidos de una manera suave. Los tejidos blandos tales como riñón, hígado y cerebro requieren fuerzas mecánicas suaves aplicadas durante la homogeneización. Esto contrasta con los tejidos duros, tales como el músculo cardíaco y esquelético que requieren fuerzas mecánicas mucho más fuerte. El tejido picado se trata generalmente con proteinasa antes de la homogeneización para suavizar el tejido. Todos los tampones utilizados durante la homogeneización y centrifugación debe ser enfriado en hielo y tienen un pH pertinente fisiológico con una fuerza iónica y osmótica compatible con citosol ^{4, 5.}

Una de las ventajas de estudiar aislados bioenergética mitocondrial es que las membranas de plasma celular no necesitan ser permeabilized con detergentes tales como digitonina o saponina ^{4, 6,} que podrían comprometer la integridad de la membrana externa mitocondrial. Otra ventaja de la mitocondrias aisladas es la ausencia de otros factores citosólicos, que pueden interferir con el análisis de las funciones mitocondriales tales como el consumo de oxígeno. Las desventajas de utilizar la mitocondria aisladas son la posible selección de ciertas poblaciones mitocondriales durante los pasos de centrifugación, el daño a la mitocondria durante la homogeneización, y el requisito de grandes cantidades de muestras biológicas con el fin de obtener un buen rendimiento de mitocondrias aisladas ^{7, 8.}

Después de que el procedimiento de aislamiento, las tasas respiratorias de los complejos mitocondriales I, II- y IV-dependientes (estados 2, 3 y 4) se determinan mediante respirometría de alta resolución. Por complejo impulsado I respiración, glutamatoy malato se añaden seguido por difosfato de adenosina (ADP). Para la respiración complejo II-conducido, succinato es seguido de la ADP. Para el complejo IV impulsada por la respiración, ascorbato y tetramethylphenylendiamine (DPMT) se añaden seguido por ADP ^{9, 10, 11, 12.} Estado 2 se refiere a consumo de oxígeno en la presencia de sustratos solo. Estado 3 se refiere a consumo de oxígeno en la presencia de sustratos y ADP. Estado 4 se refiere al consumo de oxígeno después de la depleción de ADP. La relación del control respiratorio (RCR) es un índice de acoplamiento de la producción de ATP consumo de oxígeno y se calcula como la relación entre el estado 3 y el estado 4 ^{13, 15.}

En resumen, se describe un protocolo para aislar las mitocondrias del músculo esquelético y funcionales intactas por centrifugación diferencial y utilizar estos mitochon aisladodría para los estudios funcionales y bioenergéticos como respirometría de alta resolución.

Protocol

La biopsia del músculo cuádriceps se ha tomado de un cerdo anestesiado, a partir del cual las mitocondrias se aíslan mediante centrifugación diferencial. El cerdo se utiliza después para otro experimento. El estudio se realizó de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el cuidado y uso de animales de experimentación y con la aprobación del Comité de Cuidado de Animales del cantón de Berna, Suiza. 1. La homogeneización del músculo esquelético y aislamiento m…

Representative Results

Complejo I-dependiente de la respiración Aislado tasas mitocondriales complejos I dependiente de las vías respiratorias (estados 2, 3 y 4) se determinan usando respirometría de alta resolución (Figura 1, un diagrama representativo). sustratos complejo I mitocondrial, glutamato y malato, se añaden seguidos por la adición de ADP. Estado 2 se refiere a consumo de oxígeno en presencia de lo…

Discussion

En el presente estudio se describe un protocolo para aislar de alta calidad, intactos y bien acoplados mitocondrias de músculo esquelético por centrifugación diferencial que pueden ser utilizados para estudios funcionales tales como de alta resolución respirometría.

Con el fin de aislar las mitocondrias intactas y bien acoplados, hay algunos puntos críticos que deben ser considerados en el presente protocolo. Después de cosechar el tejido esquelético, debe ser sumergido inmediatament…

Materials

ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
ATP	Sigma	A 7699	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
EGTA	fluka	3779	Chemical
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)	Merck	1.06129	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial	Sigma	P 8038	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser	schuett-biotec GmbH	3.201 011	Tissue homogenizer
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical