Выделение неповрежденном Митохондрии из скелетных мышц с помощью дифференциального центрифугирования для измерения респирометрии высокого разрешения
Summary
Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.
Abstract
Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.
Introduction
Митохондриальные биоэнергетика и дыхательные способности могут быть изучены не только в проницаемыми клеток или волокон, но и в изолированных митохондриях. В настоящем исследовании мы опишем протокол, чтобы изолировать неповрежденных скелетных мышц митохондрии с помощью дифференциального центрифугирования для измерения респирометрии с высокой разрешающей способностью.
Чтобы изолировать интактные митохондрии для респирометрии, ткань гомогенизируют и митохондрии изолированы с помощью обычного метода дифференциального центрифугирования. Метод дифференциального центрифугирования основан на последовательном центрифугировани (в серии увеличения скорости) тканевых гомогенатах впервые был введен Pallade и сотрудниками почти 70 лет назад 1. Ткань сначала фарша с помощью ножниц и гомогенизируют механически в стеклянном гомогенизаторе с рыхлой облегающие пестиком. Затем гомогенат центрифугируют при низкой скорости и образующийс осадок, который содержит сплошную ткань, клеточныймусора и ядер отбрасывают. Затем надосадочную жидкость центрифугируют несколько раз на высокой скорости и митохондриальные обогащенную фракцию собирают. Преимущества метода дифференциального центрифугирования, чтобы изолировать митохондрии, что: I) метод быстр и митохондрии, могут быть выделены в течение 1-1,5 ч (дыхательные эксперименты должны быть выполнены как можно быстрее); б) это недорого; и III) она является очень эффективным и митохондрии, полученные с помощью дифференциального центрифугирования достаточно чистым для использования респирометрии анализов. К недостаткам метода дифференциального центрифугирования, чтобы изолировать митохондрии, что я) митохондрии могут быть повреждены и отсоединен во время гомогенизации; б) загрязнение митохондрий с другими клеточными компонентами (может быть решена путем дальнейшей промывки митохондриальная гранул с дополнительными шагами центрифугирование); III) возможность выбора различных митохондриальных субпопуляции, например, во время дифференциальные центрифугировани шагов, митochondria с более низкой плотной могут быть исключены 7; и IV) митохондриальный сотовой окружающих отсутствует, и только теоретическое максимальное дыхание может быть измерено. Другой метод , чтобы изолировать митохондрии для респирометрии анализов градиент плотности Центрифугирование 2. В этой технике, экстракт ткани наслаивается над раствором сахарозы или градиентом Percoll (с более высокой плотностью в нижней части центрифугирование трубки) и центрифугировали при определенной скорости, в результате чего митохондрии быть изолированы от других клеточных компонентов в соответствии с их плотности. Этот метод часто используется, чтобы изолировать митохондрии мозга с очень низким загрязнения от синаптосомах. Тем не менее, митохондрии печени крысы , выделенные центрифугирования в градиенте плотности сильно загрязнены с другими клеточных органелл 3. Одним из недостатков этого метода является то, что градиент сахарозы присутствует в центрифужную пробирку может треснуть такменя митохондрии (осмотический шок).
В зависимости от типа ткани; Есть некоторые важные факторы, которые необходимо учитывать для выделения неповрежденной митохондрий методом дифференциального центрифугирования. Первой необходимости является гомогенизация тканей в мягкой форме. Мягкие ткани, такие как почки, мозг и печень требуют нежные механические силы, применяемые в процессе гомогенизации. Это контрастирует с твердыми тканями, такими как сердца и скелетных мышц, которые требуют гораздо более сильные механические силы. Измельченной ткани, как правило, обрабатывают протеиназой до гомогенизации, чтобы размягчить ткани. Все буферы , используемые в процессе гомогенизации и центрифугирования должны быть ледяная и имеют физиологическую соответствующий рН с ионной и осмотической силы , совместимой с цитозоле 4, 5.
Одним из преимуществ изучения изоляции митохондриальные биоэнергетика является то, что клеточная плазматические мембраны не должны быть permeabiтрализованную с моющими средствами , такими как дигитонина или сапонина 4, 6, которые могут привести к нарушению целостности митохондриальной наружной мембраны. Еще одно преимущество изолированного митохондрий является отсутствие других цитозольных факторов, которые могут препятствовать анализу митохондриальных функций, таких как потребление кислорода. Недостатки использования выделенных митохондрии возможный выбор некоторых митохондриальных популяций во время стадий центрифугирование, повреждение митохондрий в процессе гомогенизации, а также потребность в больших количеств биологических образцов, чтобы получить хороший выход изолированных митохондрий 7, 8.
После процедуры изоляции, частота дыхания митохондриальных комплексов I-, II- и IV-зависимые состояния (2, 3 и 4) определяются с использованием высокого разрешения респирометрии. Для сложных I управляемых дыхания, глутамати малат добавляют с последующим аденозиндифосфатом (ДПА). Для получения сложного дыхания II приводом, сукцинат с последующим добавлением АДФ. Для комплексного IV управляемых дыхания, аскорбат и tetramethylphenylendiamine (ТМФД) добавляют с последующим АДФ 9, 10, 11, 12. Состояние 2 относится к потреблению кислорода в присутствии одних субстратов. Состояние 3 относится к потреблению кислорода в присутствии субстратов и АДФ. Состояние 4 относится к потреблению кислорода после истощения АДФ. Дыхательный коэффициент (RCR) является индексом сцепления производства АТФ потребления кислорода и рассчитывается как отношение между состоянием 3 и состояние 4 13, 15.
В заключение, мы опишем протокол для выделения функциональных и неповрежденные скелетных мышц митохондрии с помощью дифференциального центрифугирования и использовать эти изолированные mitochonDria функциональных и биоэнергетических исследований, таких как высокого разрешения респирометрии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем исследовании мы опишем протокол для изоляции высокого качества, нетронутыми и тесно связанных скелетных мышц митохондрии с помощью дифференциального центрифугирования, которые могут быть использованы для функциональных исследований, таких как высокого разрешения респи…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).
Materials
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
Referências
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).
- Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics. 3, (2002).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).
- Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).
- Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
- Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).
