Isolering af Intakt Mitokondrier fra Skeletal Muscle ved differentialcentrifugering for høj opløsning respirometri Målinger

Summary

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Abstract

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Introduction

Mitokondrie bioenergetik og respiratoriske kapacitet kan studeres ikke blot i permeabiliserede celler eller fibre, men også i isolerede mitokondrier. I den foreliggende undersøgelse beskriver vi en protokol til at isolere intakte skelet muskel mitokondrier bruger differential centrifugering i høj opløsning respirometri målinger.

For at isolere intakte mitokondrier for respirometri, vævet homogeniseres og mitokondrier isoleres ved en konventionel differential centrifugering metode. Den differentielle centrifugering Metoden er baseret på sekventielle centrifugeringer (i en serie af stigende hastighed) af vævshomogenisater blev først indført ved Pallade og medarbejdere næsten 70 år siden ^en. Vævet først hakket med en saks og homogeniseret mekanisk i en glashomogenisator med en løstsiddende pistil. Bagefter Homogenatet centrifugeres ved lav hastighed, og den resulterende pellet, der indeholder ubrudt væv, cellulæresnavs og kerner kasseres. Derefter supernatanten centrifugeret flere gange ved høj hastighed og det mitokondriske berigede fraktion opsamles. Fordelene ved differentialcentrifugering metode til isolering mitokondrier er, at: i) metoden er hurtig og mitokondrier kan isoleres inden 1-1,5 timer (bør udføres respiratoriske eksperimenter så hurtig som muligt); ii) den er billig; og iii) det er meget effektiv og de opnåede ved differential centrifugering mitokondrier er ren nok til respirometri analyser. Ulemperne ved differentialcentrifugering metode til at isolere mitokondrier er at i) mitokondrier kan blive beskadiget og frakoblet under homogenisering; ii) forurening af mitokondrier med andre cellulære bestanddele (kunne løses ved yderligere vask mitokondrie pellet med yderligere centrifugeringstrin); iii) muligheden for at vælge forskellige mitochondriale subpopulationer, f.eks under differentielle centrifugeringer trin, mitochondria med lavere tætte kan udelukkes ^7; og iv) det mitokondriske cellulær omgivende mangler, og kun den teoretiske maksimale respiration kan måles. En anden fremgangsmåde til isolering mitokondrier for respirometri assays er densitetsgradientcentrifugering ^2. Ved denne teknik er vævet ekstrakt overtrukket over en opløsning af saccharose eller en Percoll-gradient (med højere densitet ved bunden af ​​centrifugerør) og centrifugeres med en bestemt hastighed, forårsager mitokondrier, der skal isoleres fra andre cellulære komponenter i henhold til deres tætheder. Denne metode anvendes ofte til at isolere hjernens mitokondrier med meget lav forurening fra synaptosomer. Imidlertid er de rottelever mitokondrier isoleret ved densitetsgradientcentrifugering stærkt forurenet med andre cellulære organeller ^3. En af begrænsningerne ved denne fremgangsmåde er, at saccharosegradient stede i centrifugerør kan briste såmig mitokondrier (osmotisk chok).

Afhængigt af typen af ​​væv; der er nogle vigtige faktorer at overveje til isolering af intakt mitokondrier ved differential centrifugering. Den første nødvendighed er at homogenisere væv på en skånsom måde. Blødt væv, såsom nyre, hjerne og lever kræver forsigtig mekanisk kræfter, der påføres under homogenisering. Dette står i modsætning til hårde væv, såsom hjerte- og skeletmuskulatur, der kræver meget stærkere mekaniske kræfter. Det hakkede væv er normalt behandlet med proteinase forud for homogeniseringen at blødgøre vævet. Alle puffere anvendt under homogenisering og centrifugering bør være iskold og har en fysiologisk relevant pH med en ionisk og osmotisk styrke kompatibel med cytosol ^{4, 5.}

En af fordelene ved at studere isoleret mitokondrielle bioenergetik er, at cellulære plasmamembraner ikke behøver at være permeabilized med detergenter såsom digitonin eller saponin ^{4, 6,} som kan kompromittere den mitokondriske ydre membran integritet. En anden fordel af det isolerede mitokondrier er fraværet af andre cytosoliske faktorer, som kan forstyrre analysen af ​​de mitochondriale funktioner såsom iltforbrug. Ulemperne ved anvendelse af de isolerede mitokondrier er muligheden for at vælge bestemte mitokondriske populationer under centrifugeringstrin, skader på mitokondrier under homogenisering, og kravet om store mængder biologiske prøver for at opnå et godt udbytte af isolerede mitokondrier ^{7, 8.}

Efter isolation procedure, de respiratoriske satser for mitokondrie komplekser I-, II- og IV-afhængige (stater 2, 3 og 4) bestemmes ved hjælp af høj opløsning respirometri. For komplekse I-drevet respiration, glutamatog malat er tilsat efterfulgt af adenosindiphosphat (ADP). For komplekse II-drevet respiration, er succinat tilsat efterfulgt af ADP. For komplekse IV-drevet respiration, ascorbat og tetramethylphenylendiamine (TMPD) tilsættes efterfulgt af ADP ^{9, 10, 11, 12.} Tilstand 2 vedrører konsum oxygen i nærvær af substrater alene. Tilstand 3 henviser til iltforbruget i nærvær af substrater og ADP. State 4 henviser til iltforbrug efter ADP udtynding. Den respiratoriske kontrol ratio (RCR) er et indeks af kobling for iltforbrug ATP produktion og er beregnet som forholdet mellem stat 3 og stat 4 ^{13, 15.}

Sammenfattende beskriver vi en protokol til at isolere funktionelle og intakte skeletmuskulatur mitokondrier ved differential centrifugering og bruge disse isolerede mitochonDRIA for funktionelle og bioenergetic undersøgelser såsom høj opløsning respirometri.

Protocol

Quadriceps muskel biopsi er taget fra en bedøvet gris, hvorfra mitokondrier isoleres ved differentialcentrifugering. Grisen bliver brugt bagefter for et andet eksperiment. Undersøgelsen er udført i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr og med godkendelse af Animal Care udvalg af Canton Bern, Schweiz. 1. Skeletal Muscle Homogenisering og Mitokondriel Isolation Excise 5-10 g quadriceps muskel eksemplar f…

Representative Results

Kompleks I-afhængige respiration Isolerede mitokondrie komplekse I-afhængige respiratoriske satser (stater 2, 3 og 4) bestemmes ved hjælp af høj-opløsning respirometri (figur 1, en repræsentant diagram). Mitochondriale komplekse I substrater, glutamat og malat, tilsættes efterfulgt af tilsætningen af ​​ADP. State 2 henviser til iltforbruget i overværelse af alene substrater. Tilst…

Discussion

I nærværende undersøgelse beskriver vi en protokol til at isolere høj kvalitet, intakt og tæt koblede skeletmuskulatur mitokondrier ved differential centrifugering, som kan anvendes til funktionelle undersøgelser såsom høj opløsning respirometri.

For at isolere intakte og stramt koblede mitokondrier, er der nogle kritiske punkter, der skal overvejes inden for den nuværende protokol. Efter høst af knoglevæv, skal det straks nedsænket i iskold mitokondrie isolation puffer. Alle ce…

Materials

ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
ATP	Sigma	A 7699	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
EGTA	fluka	3779	Chemical
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)	Merck	1.06129	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial	Sigma	P 8038	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser	schuett-biotec GmbH	3.201 011	Tissue homogenizer
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical