في المختبر تمايز متعددة القدرات البشرية الخلايا الجذعية إلى خلايا الأرومة الغاذية

Summary

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Abstract

المشيمة هي الجهاز الأول لتطوير خلال مرحلة التطور الجنيني ومطلوب لبقاء الجنين النامي. وتتكون المشيمة من مختلف خلايا الأرومة الغاذية التي تميز من خلايا الأديم الظاهر الغاذي خارج الجنينية من الكيسة قبل الغرس. على هذا النحو، فهمنا للأحداث التمايز في وقت مبكر من المشيمة البشرية محدودة بسبب القيود الأخلاقية والقانونية على العزلة والتلاعب في مرحلة التطور الجنيني البشري. الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) هي نظام نموذجي قوي للتحقيق في التنمية البشرية، ويمكن أيضا أن تكون متباينة في المختبر إلى خلايا الأرومة الغاذية التي تعبر عن علامات لمختلف أنواع الخلايا الأرومة الغاذية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل للتمييز بين hPSCs إلى خلايا الأرومة الغاذية باستخدام بروتين morphogenic العظام (4) ومثبطات للActivin / مسارات الإشارات العقدية. هذا البروتوكول يولد مختلف أنواع الخلايا الأرومة الغاذية التي يمكن transfected مع الرناوات siRNAsللتحقيق في فقدان وظيفة من الظواهر أو يمكن أن تصاب مع مسببات الأمراض. بالإضافة إلى ذلك، hPSCs يمكن تعديلها وراثيا ثم متباينة إلى الأسلاف الأرومة الغاذية لتحقيق مكاسب من وظيفة ويحلل. هذا في المختبر طريقة التمايز لتوليد أرومة مغذية الإنسان بدءا من hPSCs يتغلب على القيود الأخلاقية والقانونية للعمل مع الأجنة البشرية في مراحلها المبكرة، وهذا النظام يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك اكتشاف المخدرات وأبحاث الخلايا الجذعية.

Introduction

مطلوب المشيمة لنمو وبقاء الجنين أثناء الحمل ويسهل تبادل الغازات والمواد الغذائية والفضلات، والهرمونات بين الدورة الدموية للأم والجنين. الجهاز الأول شكلت خلال مرحلة التطور الجنيني الثدييات هو المشيمة التي تبدأ تطوير 6-7 أيام بعد الحمل في البشر و3،5-4،5 أيام في الفئران ^{1، 2، 3، 4.} خلايا الأرومة الغاذية هي الخلايا أهم من المشيمة، وهذه الخلايا تمثل واحدة من أقرب الأحداث النسب تمايز الجنين الثدييات. أنها تنشأ من خلايا الأديم الظاهر الغاذي خارج الجنينية الخارجية للالكيسة قبل الغرس. معرفتنا المراحل الأولى من تطوير المشيمة محدودة بسبب القيود الأخلاقية واللوجستية على نمذجة التنمية البشرية في وقت مبكر.

خلال زرع الأجنة، أرومة مغذيةغزو ظهارة الأمهات والتمايز إلى خلايا السلف المتخصصة ^5. وmononucleated أرومة غاذية خلوية (CTBS)، الأسلاف غير متمايزة أن تندمج والتمايز إلى أرومة غاذية مخلوية (أن SYNs) وأرومة مغذية الغازية extravillous (EVTs)، التي مرساة المشيمة إلى الرحم. ومتعددة النوى أن SYNs، لا شفاء خلايا متمايزة أن توليف الهرمونات اللازمة للحفاظ على الحمل. الأحداث التمايز الأولى التي تولد EVTs وأن SYNs ضرورية لتكوين المشيمة، وضعف في خلايا الأرومة الغاذية تؤدي إلى الإجهاض، تسمم الحمل، ووزن الولادة ^1. وتشمل أنواع خطوط الخلايا الأرومة الغاذية الإنسان التي تم وضعها CTBS وchoriocarcinomas، والتي تنتج هرمونات المشيمة وعرض خصائص الغازية ⁶ خلد. خلايا الأرومة الغاذية الأولية من مشيمة في الثلث الأول الإنسان يمكن أن تكون معزولة، ولكن الخلايا DIF بسرعةferentiate ووقف تكاثر في المختبر. الأهم من ذلك، حولت وخطوط الخلايا الأولية لديها مختلف ملامح التعبير الجيني، مشيرا إلى أن خطوط الخلايا الأرومة الغاذية مكون للأورام وخلد قد لا تمثل بدقة أرومة مغذية أساسية ^7. بالإضافة إلى ذلك، هذه الخطوط من غير المحتمل أن تشبه الأرومة الغاذية المشيمة الأسلاف الخلايا الجذعية لأنها مستمدة من بعد المرحلة الأولى خلال الثلث الثالث.

وهناك حاجة إلى قوة في نظام الثقافة المختبر من أرومة مغذية الإنسان في مرحلة مبكرة من أجل دراسة الأحداث في وقت مبكر من تشكيل المشيمة وظيفة. الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs)، التي تشترك مع خصائص الكتلة الخلوية الداخلية من الجنين قبل الغرس، كثيرا ما تستخدم لنموذج التنمية البشرية في وقت مبكر، بما في ذلك تشكيل المشيمة المبكر. كل من الخلايا التي يسببها الإنسان الجذعية المحفزة (hiPSCs) وhESCs يمكن التفريق إلى أرومة مغذية في المختبر باستخدام العظام مورالبروتين phogenic 4 (BMP4) ^{8، 9، 10، 11، 12، 13، 14، 15.} هذا التحويل الخلايا المحفزة للخلايا الأرومة الغاذية استخدام BMP4 غير محددة للخلايا البشرية، ويستخدم على نطاق واسع لدراسة تطور المشيمة البشرية في وقت مبكر لأنها لا تتطلب الوصول إلى الأجنة البشرية في مراحلها المبكرة ^{9 و 16.} مؤخرا، تم اكتشاف أن إضافة مثبطات A83-01 (A) وPD173074 (P)، الذي منع SMAD2 / 3 و MEK1 / 2 مسارات الإشارات، ويزيد من كفاءة hPSC التمايز إلى الأسلاف مثل الأديم الظاهر الغاذي، لا سيما أن SYNs وEVTs، دون جيل واسع من الأديم المتوسط، الأديم، أو خلايا الأديم الظاهر ^{9، 17} </suص>. باستخدام هذه الشروط المتوسطة، hESCs متباينة لمدة 12 يوما لديها مماثلة ملامح التعبير الجيني من خلايا الأديم الظاهر الغاذي المعزولة من أجنة الكيسة المرحلة الإنسان وتفرز العديد من الهرمونات نمو المشيمة محددة، ودعم صحة هذا النظام نموذجا في المختبر ^{9 و 11.} هنا، نقدم بروتوكول مفصلة للالتمايز في المختبر من hPSCs إلى الأسلاف الأرومة الغاذية الإنسان باستخدام BMP4 / A / P مستنبت. هذه الشروط تنتج أعداد وفيرة من خلايا لمجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك التسلسل RNA، واختلال الجينات باستخدام الرناوات siRNAs والتهابات الممرض، والتعديل الوراثي باستخدام ترنسفكأيشن بوساطة lipofection.

Protocol

ملاحظة: للحصول على تمايز إما hESCs أو hiPSCs إلى الأسلاف الأرومة الغاذية، وانتقلت hPSCs نمت على الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFS) إلى المغذية خالية من الشروط لاثنين من الممرات قبل بدء التمايز مع BMP4 / A / P. هذه العملية يزيل التلوث MEF من الخلايا المتمايزة. هنا، نقدم بروتوكول للتمايز HESC، و?…

Representative Results

نظرة عامة على التمايز في المختبر من hPSCs يبدأ هذا البروتوكول التمايز في المختبر مع hESCs غير متمايزة نمت على MEFS التي يتم نقلها إلى المغذية خالية من الشروط اللازمة لمرور واحد (الشكل 1A).</s…

Discussion

قدمنا ​​الخطوات الأساسية للتمييز بين hESCs إلى الأسلاف الأرومة الغاذية. وقد تم مؤخرا الأمثل هذا البروتوكول للتمييز بسرعة hESCs مع إضافة Activin / العقدية يشير مثبطات، وزيادة التمايز إلى خلايا الأرومة الغاذية وتجنب جيل من الأسلاف الأديم المتوسط، والتي عادة ما لوحظ مع العلا?…

Materials

DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine	Invitrogen	10828-028
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
Collagenase Type IV	Invitrogen	17104-019
Rock inhibitor Y27632	Calbiochem	688000
Irradiated CF1 MEFs	GlobalStem	6001G	MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 um syringe filter	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator	Heracell/VWR	89187-192	Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4	R&D Systems	314-BP-01M
A 83-01	R&D Systems	2939/10
PD173074	R&D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.