La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche
Summary
Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.
Abstract
La placenta è il primo organo di sviluppare durante l'embriogenesi ed è necessario per la sopravvivenza dell'embrione in via di sviluppo. La placenta comprende numerose cellule trofoblastiche che differenziano dalle cellule trophectoderm extra-embrionali di blastocisti preimpianto. Come tale, la nostra comprensione dei primi eventi di differenziazione della placenta umana è limitata a causa delle restrizioni etiche e legali su l'isolamento e la manipolazione di Embriologia Umana. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono un sistema robusto modello per lo studio dello sviluppo umano e possono anche essere differenziate in vitro in cellule trofoblastiche che esprimono i marcatori dei vari tipi di cellule trofoblasto. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per differenziare hPSCs in cellule trofoblastiche utilizzando morphogenic proteina ossea 4 e gli inibitori delle vie di segnalazione / nodali activin. Questo protocollo genera vari tipi di cellule trofoblastiche che possono essere transfettate con siRNAper indagare la perdita di funzione fenotipi o possono essere infettati da agenti patogeni. Inoltre, hPSCs possono essere modificati geneticamente e poi differenziate in progenitori trofoblasto per guadagno-di-funzione analizza. Questo vitro metodo di differenziazione per la generazione di trofoblasto umano a partire dalle hPSCs supera le limitazioni etiche e legali di lavorare con i primi embrioni umani, e questo sistema può essere utilizzato per una varietà di applicazioni, tra cui la scoperta di farmaci e ricerca sulle cellule staminali.
Introduction
La placenta è necessario per la crescita e la sopravvivenza del feto durante la gravidanza e facilita lo scambio di gas, sostanze nutritive, prodotti di scarto, e gli ormoni tra la circolazione materna e fetale. Il primo organo formato durante l'embriogenesi dei mammiferi è la placenta, che inizia lo sviluppo 6-7 giorni dopo il concepimento nell'uomo e 3,5-4,5 giorni nel topo 1, 2, 3, 4. cellule trofoblastiche sono le cellule più importanti della placenta, e queste cellule rappresentano uno dei primi eventi di differenziazione lignaggio dell'embrione di mammifero. Essi derivano dalle cellule trophectoderm extra-embrionali esterni della blastocisti preimpianto. La nostra conoscenza delle prime fasi di sviluppo placentare è limitata da restrizioni etiche e logistiche sulla modellazione precoce sviluppo umano.
Durante embrionali impianto, trofoblastoinvadono l'epitelio materna e differenziarsi in cellule progenitrici specializzate 5. Citotrofoblasti (CTBS) sono mononucleate, progenitori indifferenziati che si fondono e si differenziano in sinciziotrofoblasti (SYN) e trofoblasto invasive extravilloso (EVTS), che ancorano la placenta all'utero. SYN sono multinucleate, cellule terminalmente differenziate che sintetizzano gli ormoni necessari per sostenere la gravidanza. Gli eventi di differenziazione primi che generano EVTS e SYN sono essenziali per la formazione della placenta, come menomazioni in cellule trofoblastiche risultato in aborto spontaneo, pre-eclampsia e restrizione della crescita intrauterina 1. I tipi di linee cellulari umane trofoblasto che sono stati sviluppati includono immortalati CTBS e coriocarcinoma, che producono ormoni della placenta e di visualizzazione proprietà invasive 6. cellule trofoblastiche primari da placenta primo trimestre umani possono essere isolati, ma le cellule rapidamente differentiate e smettere di proliferare in vitro. È importante sottolineare che, trasformato e linee cellulari primarie avere diversi profili di espressione genica, indicando che le linee cellulari tumorali trofoblasto e immortalate potrebbero non rappresentare accuratamente trophoblasts primarie 7. Inoltre, queste linee sono improbabili per assomigliare placentare trofoblasto progenitori di cellule staminali, perché sono derivati da dopo-prima fase attraverso trimestre terzi.
Vi è la necessità di un robusto nel sistema di coltura in vitro di trofoblasto umano nella fase iniziale, al fine di studiare gli eventi precoci della formazione e della funzione placentare. le cellule staminali embrionali umane (hESC), che condividono gli oggetti con massa cellulare interna dell'embrione preimpianto, sono spesso utilizzati per modellare precoce sviluppo umano, compresa la formazione dei primi placenta. Entrambe le cellule indotte umane pluripotenti staminali (hiPSCs) e hESC possono essere differenziati in trofoblasto in vitro su Bone MorProtein phogenic 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Questa conversione di cellule pluripotenti cellule trofoblastiche utilizzando BMP4 è specifico per le cellule umane ed è ampiamente usato per studiare lo sviluppo dei primi placenta umana in quanto non richiede l'accesso a embrioni umani 9, 16. Recentemente, si è scoperto che l'aggiunta di inibitori A83-01 (A) e PD173074 (P), che bloccano le vie di segnalazione SMAD2 / 3 e MEK1 / 2, aumenta l'efficienza della differenziazione HPSC in progenitori trophectoderm simili, soprattutto SYNs e EVTS, senza la vasta generazione di mesoderma, endoderma, o cellule ectoderma 9, 17 </sup>. Utilizzando queste condizioni medie, hESC differenziato per 12 giorni hanno simili profili di espressione genica le cellule trophectoderm isolate da embrioni blastocisti-stadio umano e secernono vari ormoni della crescita specifici placentare, sostenere la validità di questo sistema modello in vitro 9, 11. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la differenziazione in vitro di hPSCs in progenitori trofoblasto umani utilizzando BMP4 / A / P terreno di coltura. Queste condizioni producono numero abbondante di cellule per un'ampia varietà di applicazioni, tra RNA sequenziamento, gene perturbazione utilizzando siRNAs, infezioni patogeni e modificazione genetica utilizzando trasfezione lipofezione-mediata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo presentato i passaggi fondamentali per differenziare hESC in progenitori trofoblasto. Questo protocollo è stato recentemente ottimizzato per differenziare rapidamente hESCs con l'aggiunta di inibitori Activin / segnalazione nodale, aumentando la differenziazione di cellule trofoblastiche ed evitando la generazione di progenitori mesoderma, tipicamente osservati con il solo trattamento BMP4. Il sistema modello BMP4 consente per l'esame delle prime fasi della specifica trofoblasto stirpe umana e di espans…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 um syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
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