Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

Summary

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Abstract

A placenta é o primeiro órgão a desenvolver-se durante a embriogénese e é necessária para a sobrevivência do embrião em desenvolvimento. A placenta é composto por várias células trofoblásticas que diferenciam a partir de células trofectoderma extra-embrionárias do blastocisto de pré-implantação. Como tal, a nossa compreensão dos eventos diferenciação precoce da placenta humana é limitada por causa das restrições éticas e legais sobre o isolamento e manipulação de embriogênese humana. As células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) são um sistema modelo robusto para investigar o desenvolvimento humano e também podem ser diferenciadas in vitro em células trofoblásticas que expressam marcadores de vários tipos de células trofoblásticas. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar hPSCs em células trofoblásticas usando proteína morfogénica do osso 4 e inibidores das vias de sinalização / nodais Activina. Este protocolo gera vários tipos de células de trofoblasto que podem ser transfectadas com ARNsipara investigar fenótipos de perda de função ou podem ser infectados com patógenos. Além disso, hPSCs pode ser geneticamente modificado e, em seguida, diferenciaram em progenitores trofoblásticas de ganho-de-função análises. Este método in vitro de diferenciação para geração de trofoblastos humanos a partir de hPSCs supera as restrições éticas e legais de trabalhar com embriões humanos, e este sistema pode ser usado para uma variedade de aplicações, incluindo a descoberta da droga e pesquisa da célula estaminal.

Introduction

A placenta é necessário para o crescimento e sobrevivência do feto durante a gravidez e facilita a troca de gases, nutrientes, produtos residuais e hormônios entre a circulação materna e fetal. O primeiro órgão formado durante a embriogênese dos mamíferos é a placenta, que começa a desenvolver 6-7 dias pós-concepção em humanos e 3,5-4,5 dias em ratos ^{1, 2, 3, 4.} células trofoblásticas são as células mais importantes da placenta, e estas células representam um dos primeiros eventos de diferenciação linhagem de embrião de mamífero. Eles surgem a partir de células trofectoderma extra-embrionárias exteriores do blastocisto de pré-implantação. Nosso conhecimento dos estágios iniciais do desenvolvimento da placenta é limitado por restrições éticas e logísticas sobre a modelagem de desenvolvimento humano precoce.

Durante implantação embrionária, trofoblastosinvadem o epitélio materno e diferenciam-se em células progenitoras especializados ^5. Citotrofoblastos (CTBS) são mononucleated, progenitores indiferenciadas que se fundem e se diferenciam em sinciciotrofoblastos (SYNs) e trofoblastos invasivos extravilosas (EVTS), que escora a placenta ao útero. SYNs são multinucleadas, células terminalmente diferenciadas que sintetizam os hormônios necessários para sustentar a gravidez. Os eventos diferenciação precoce que geram TEVs e SYNs são essenciais para a formação da placenta, como deficiências em células trofoblásticas resultar em aborto espontâneo, pré-eclampsia, e intra-uterino restrição de crescimento ^1. Os tipos de linhas de células trofoblásticas humanas que foram desenvolvidas incluem imortalizado CTBs e Coriocarcinomas, que produzem hormônios da placenta e exibição propriedades invasivas ^6. As células trofoblásticas primárias de placentas primeiro trimestre humanos podem ser isolados, mas as células rapidamente DIFferentiate e parar de proliferar in vitro. Importante, transformada e linhas de células primárias têm diferentes perfis de expressão genética, indicando que linhas de células trofoblásticas tumorigênicos e imortalizadas podem não representar fielmente trofoblastos primários ^7. Além disso, essas linhas não são susceptíveis de se assemelham a células progenitoras de células-tronco do trofoblasto da placenta, porque eles são derivados a partir de fases ulteriores primeiro através terceiro trimestres.

Existe uma necessidade de um sistema robusto em cultura in vitro em fase inicial de trofoblastos humanos, a fim de estudar os eventos iniciais da formação e função da placenta. células estaminais embrionárias humanas (hESCs), que compartilham propriedades, com a massa celular interna do embrião pré-implantação, são frequentemente usados ​​para modelar o desenvolvimento humano precoce, incluindo a formação do início placenta. Ambas as células humanas pluripotentes induzidas estaminais (hiPSCs) e hESCs podem ser diferenciados em trofoblastos in vitro utilizando osso MorProteína phogenic 4 (BMP4) ^{8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.} Esta conversão de células pluripotentes para células trofoblásticas usando BMP4 é específico para células humanas e é amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento da placenta humana cedo porque não exige o acesso a embriões humanos ^{9, 16.} Recentemente, descobriu-se que a adição dos inibidores A83-01 (A) e PD173074 (P), que bloqueiam as vias de sinalização Smad2 / 3 e MEK1 / 2, aumenta a eficiência da diferenciação em células progenitoras HPSC trofectoderma-like, principalmente SYNs e TEVs, sem a ampla geração de mesoderme, endoderme, ou células ectoderma ^{9, 17} </sup>. Usando estas condições médias, hESCs diferenciados por 12 dias têm perfis de expressão gênica similares como células trofectoderma isoladas de embriões blastocisto em estágio humanos e secretam vários hormônios de crescimento específico da placenta, apoiando a validade deste sistema modelo in vitro ^{9, 11.} Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a diferenciação in vitro de hPSCs em progenitores trofoblastos humanos utilizando meio de cultura BMP4 / A / P. Estas condições produzem número abundante de células de uma ampla variedade de aplicações, incluindo a sequência de ARN, interrupção de genes utilizando os siRNAs, infecções de agentes patogénicos, e a modificação genética utilizando transfecção mediada por lipofecção.

Protocol

NOTA: Para a diferenciação de qualquer hESCs ou hiPSCs em progenitores trofoblásticas, hPSCs cultivadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) são a transição para Alimentador livre condições para duas passagens antes de iniciar a diferenciação com BMP4 / A / P. Este processo elimina a contaminação FAE de células diferenciadas. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a diferenciação de células estaminais embrionárias humanas, e o mesmo protocolo pode ser aplicado a hiPSCs. 1. Cultura e Rec…

Representative Results

Visão geral de diferenciação in vitro de hPSCs Este protocolo de diferenciação in vitro começa com hESCs indiferenciadas cultivadas em MEFs que estão a transição para Alimentador livre condições para uma passagem (Figura 1A). Enquanto nós descrevemos a diferenciação de hESCs neste protocolo, usamos esse protocolo para diferenciar com sucesso hiPSCs em células trofoblásticas. A tr…

Discussion

Nós apresentamos os passos básicos para a diferenciação de hESCs em progenitores trofoblastos. Este protocolo foi optimizado recentemente para diferenciar rapidamente hESCs com a adição de inibidores da Activina / Nodal sinalização, aumentar a diferenciação de células trofoblásticas e evitando a geração de células progenitoras da mesoderme, que são tipicamente observadas com o tratamento BMP4 sozinho. O sistema modelo BMP4 permite a análise das primeiras fases de especificação trophoblast linhagem hum…

Materials

DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine	Invitrogen	10828-028
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
Collagenase Type IV	Invitrogen	17104-019
Rock inhibitor Y27632	Calbiochem	688000
Irradiated CF1 MEFs	GlobalStem	6001G	MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 um syringe filter	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator	Heracell/VWR	89187-192	Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4	R&D Systems	314-BP-01M
A 83-01	R&D Systems	2939/10
PD173074	R&D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.