Valutazione della vitalità neuronale utilizzando la fluoresceina diacetato-propidium ioduro a doppia colorazione nel granulo cerebrale Neuron Culture
Summary
Questo protocollo descrive come misurare con precisione la vitalità neuronale utilizzando la doppia colorazione di Fluorescein diacetato (FDA) e Propidium Iodide (PI) nei neuroni granulari cerebellari coltivati, una coltura neuronale primaria utilizzata come modello in vitro nella ricerca neuroscienza e neurofarmacologia.
Abstract
I neuroni granulari cerebrali coltivati primari (CGNs) sono stati ampiamente usati come un modello in vitro nella ricerca neuroscienze e neurofarmacologica. Tuttavia, la coesistenza di cellule gliali e neuroni nella cultura CGN potrebbe portare a pregiudizi nella valutazione accurata della vitalità neuronale. La misurazione della resistenza cellulare è stata utilizzata con la doppia acetato di fluoresceina (FDA) e Propidium Iodide (PI), valutando simultaneamente le cellule vitali e morte. Abbiamo utilizzato FDA-PI duplice macchia per migliorare le sensibilità dei test colorimetrici e per valutare la vitalità neuronale nei CGNs. Inoltre, abbiamo aggiunto macchie di DNA fluorescenti blu ( ad esempio, Hoechst) per migliorare l'accuratezza. Questo protocollo descrive come migliorare l'accuratezza della valutazione della vitalità neuronale utilizzando questi metodi nella cultura CGN. Utilizzando questo protocollo, il numero di cellule gliali può essere escluso utilizzando la microscopia a fluorescenza. Una strategia analoga può essere applicata per distinguere gli indesideratiAl cellule da neuroni in varie colture cellulari miste, come la coltura corticale primaria e la coltura ippocampale.
Introduction
I test di citotossicità colorimetrica, come il saggio di bromuro di 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazolium bromuro (MTT), sono comunemente usati per misurare la vitalità cellulare in vitro . I neuroni granulari cerebrali coltivati primari (CGNs) dai ratti sono sensibili a varie neurotossine, tra cui l'ione 1-metil-4-fenilpiridina, il perossido di idrogeno e il glutammato 1,2 . Pertanto, le culture CGN possono essere utilizzate come un modello in vitro nel campo della neuroscienza. Le colture CGN possono contenere una varietà di cellule, compresi i neuroni e le cellule gliali, che possono rappresentare circa l'1% delle cellule totali nella coltura CGN. Tuttavia, le cellule gliali rispondono in modo diverso alle neurotossine rispetto ai neuroni, portando ad una bias nella vitalità neuronale misurata dai test colorimetrici 3 .
Nelle cellule vitali, il fluorescein diacetato (FDA) può essere convertito in fluoresceina mediante esterasi.Propidio Ioduro (PI) può interagire con il DNA dopo penetrare le cellule morte e può essere utilizzato per indicare l'apoptosi all'interno della cultura. Pertanto, la duplice colorazione FDA-PI può contemporaneamente valutare le cellule vitali e le cellule morte, suggerendo che la vitalità delle cellule può essere misurata più accuratamente combinando entrambi i metodi colorimetrici. Inoltre, aggiungendo Hoechst, una macchia fluorescente blu per i nuclei, l'accuratezza della vitalità cellulare potrebbe essere ulteriormente migliorata. Il protocollo qui presentato descrive la duplice colorazione FDA-PI e la tripla colorazione FDA-PI-Hoechst, che può essere utilizzata per analizzare accuratamente la vitalità neuronale in CGN coltivate in primari.
Questo protocollo sfrutta la visualizzazione e la distinzione di CGN e cellule gliali per le loro diverse dimensioni e forme. Dopo la colorazione, i numeri di neuroni vitali e neuroni morti sono contati da immagini rappresentative prese da microscopia fluorescente. Le cellule gliali di grandi dimensioni sono escluse dal confronto di tipiche CGNs tAken in modalità fluorescente con quelli presi in modalità di contrasto di fase. Una strategia simile può essere eseguita per misurare la vitalità neuronale in colture cellulari miste contenenti neuroni e cellule gliali, come le colture corticali primarie e le colture ippocampali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è stato modificato da procedure precedentemente descritte 6 , 7 . I ricercatori hanno trascorso il tempo cercando di ridurre la crescita delle cellule non neuronali migliorando le condizioni di coltura dei neuroni primari in vitro 8 . Tuttavia, anche con condizioni di coltura migliorate, alcune cellule gliali rimangono. Inoltre, le cellule non neuronali sono necessarie nelle colture neuronali primarie perché a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione della Scienza Naturale della Provincia di Zhejiang (LY15H310007), del Progetto Applicato di Ricerca sulla Tecnologia Nonprofit della Provincia di Zhejiang (2016C37110), della National Science Foundation della Cina (U1503223, 81673407), della Ningbo International Science and Progetto di cooperazione tecnologica (2014D10019), Ningbo Municipal Innovation Team di Life Science and Health (2015C110026), del Guangdong Provincial International Cooperation Project di scienza e tecnologia (No. 2013B051000038), del programma di ricerca di base di Shenzhen (JCYJ20160331141459373), del Guangdong-Hong (GHP / 012 / 16GD), il Consiglio di Grants per Ricerche di Hong Kong (15101014), l'Università Politecnica di Hong Kong (G-YBGQ) e il fondo KC Wong Magna presso l'Università di Ningbo.
Materials
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Cytosine β-D-Arabinofuranoside | Sigma | C1768 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | high quality FBS is essential for culture |
| 100× glutamine | Gibco | 25030081 | |
| 100× anti-biotic | Gibco | 15240062 | |
| BME medium | Gibco | 21010046 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma | F7378 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| rabbit Anti-GAP43 antibody | Abcam | ab75810 | |
| mouse Anti-GFAP antibody | Cellsignaling | 3670 | |
| Bovine serum albumin | Sangon Biotech | A602440 | |
| Trypsin | Sigma | T4665 | |
| DNAse | Sigma | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pasteur pipette | Volac | Z310727 | burn the tip round before use |
| 12-well cell culture plates | TPP | Z707783 | |
| 6-well cell culture plates | TPP | Z707759 | high quality cell culture plate is essential for culture |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Pipet 5 ml | Excell Bio | CS017-0003 | |
| Pipet 10 ml | Excell Bio | CS017-0004 | |
| Dissect microscope | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 311 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | TI-S | |
| Fluorescence filter and emmision cubes | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
| Photo software | Nikon | NIS-Elements | |
| Graphics editor softeware | Adobe | Photoshop CS | |
| Image process softeware | NIH | ImageJ |
Referências
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