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Avaliação da Viabilidade Neuronal Utilizando Coloração Dupla de Iodeto de Diacetate-Propidium de Fluoresceína em Cultura de Neurônio de Granulado Cerebelar

DOI:

10.3791/55442

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May 10th, 2017

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1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, 3Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, 4International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong

In This Article

Summary

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Este protocolo descreve como medir com precisão a viabilidade neuronal usando fluoresceína diacetato (FDA) e Propidium Iodide (PI) dupla coloração em neurônios cultivados cerebrais grânulo, uma cultura primária neuronal utilizado como um modelo in vitro em neurociência e neuropharmacology investigação.

Abstract

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Os neurónios de grãos cerebelosos cultivados primários (CGNs) têm sido amplamente utilizados como um modelo in vitro em neurociência e investigação neurofarmacologia. No entanto, a coexistência de células gliais e neurônios na cultura CGN pode levar a viés na avaliação precisa da viabilidade neuronal. O diacetato de fluoresceína (FDA) e a coloração dupla de iodeto de propídio (PI) foram utilizados para medir a viabilidade celular ao avaliar simultaneamente as células viáveis ​​e mortas. Utilizou-se coloração dupla FDA-PI para melhorar a sensibilidade dos ensaios colorimétricos e avaliar a viabilidade neuronal em CGNs. Além disso, adicionamos manchas azuis fluorescentes de DNA ( por exemplo, Hoechst) para melhorar a precisão. Este protocolo descreve como melhorar a precisão da avaliação da viabilidade neuronal utilizando estes métodos na cultura CGN. Utilizando este protocolo, o número de células gliais pode ser excluído utilizando microscopia de fluorescência. Uma estratégia semelhante pode ser aplicada para distinguir os gli indesejadosAl de neurónios em várias culturas de células misturadas, tais como cultura cortical primária e cultura de hipocampo.

Introduction

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Os ensaios de citotoxicidade colorimétrica, tais como o ensaio de brometo de 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2-H-tetrazólio (MTT), são comummente utilizados para medir a viabilidade celular in vitro . Os neurónios de grânulos cerebelosos (CGNs) cultivados primários de ratos são sensíveis a várias neurotoxinas, incluindo ião 1-metil-4-fenilpiridinio, peróxido de hidrogénio e glutamato 1 , 2 . Portanto, as culturas CGN podem ser usadas como um modelo in vitro no campo da neurociência. As culturas CGN podem conter uma variedade de células, incluindo neurónios e células gliais, que po....

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Protocol

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Todos os procedimentos seguiram o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Publicações NIH No. 80-23, revisado em 1996) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na Universidade de Ningbo ( SYXK-2008-0110).

1. Preparação de soluções e meios de cultura

Nota: Reagentes e estoques precisam ser preparados em condições estéreis. Esterilizar por filtração utilizando um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm.

  1. Preparar solução-mãe de poli-L-lisina (PLL) adicionando 5 mg de PLL a 10 mL de água duplamente destilada (d....

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Results

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A imunocoloração dupla de GAP43 (vermelho) e GFAP (verde) foi utilizada para analisar a forma dos neurônios e células gliais, respectivamente 2 , 5 . Tanto os neurónios como as células gliais estão presentes na cultura CGN. As células gliais GFAP-positivas são grandes e de forma irregular, como indicado pelas setas nas imagens ( Figura 1 ). Os ensaios tradicionais para a vitalidade celular não podem distinguir cé.......

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Discussion

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Este protocolo foi modificado a partir de procedimentos que foram descritos anteriormente 6 , 7 . Os pesquisadores passaram tempo tentando reduzir o crescimento de células não-neuronais melhorando as condições quando cultivando neurônios primários in vitro 8 . Contudo, mesmo com condições de cultura melhoradas, permanecem algumas células gliais. Além disso, células não-neuronais são necessárias em culturas neuronais primárias, po.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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Este trabalho foi suportado por concessões da fundação natural da ciência da província de Zhejiang (LY15H310007), o projeto aplicado da pesquisa na tecnologia sem fins lucrativos da província de Zhejiang (2016C37110), a fundação nacional da ciência natural de China (U1503223, 81673407) (2014D10019), a equipe de inovação municipal de Ningbo da ciência e da saúde de vida (2015C110026), o projeto provincial da cooperação internacional de Guangdong da ciência e da tecnologia (No. 2013B051000038), Shenzhen o programa básico da pesquisa (JCYJ20160331141459373), Guangdong-Hong (GHP / 012 / 16GD), o Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong (15101014), a Universidade Polit....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Poli-L-lisina (PLL)SigmaP2636
D-glicoseSigmaG8270
Citosina β -D-ArabinofuranosídeoSigmaC1768
Soro bovino fetal (FBS)Gibco10099141FBS de alta qualidade é essencial para a cultura
100x glutaminaGibco25030081
100x antibióticosGibco15240062
Basal Medium Eagle (BME)Gibco21010046
Diacetato de fluoresceína (FDA)SigmaF7378
Iodeto de propídio (PI)SigmaP4170
Hoechst 33342Yesen40731ES10
coelho Anticorpo anti-GAP43Abcamab75810
anticorpo anti-GFAP de camundongoCellsignaling3670
Albumina de soro bovino (BSA)Sangon BiotechA602440
tripsinaSigmaT4665
DNAseSigmaD5025
Inibidor de tripsina de sojaSigmaT9003
Pipeta PasteurVolac Z310727queimar a ponta antes use
placas de cultura de células de 12 poçosTPPZ707783
placas de cultura de células de 6 poçosTPPZ707759placa de cultura de células de alta qualidade é essencial para a cultura
FiltroMilliporeSLGP033RB
Pipet 5 mLExcell BioCS017-0003
Pipet 10 mLExcell BioCS017-0004
Dissecção microscópioShanghai CaikangXTL2400
CO2 IncubadoraThermo Scientific311
Microscópio de fluorescênciaNikonTI-S
Filtro de fluorescência e cubos de emissãoNikonB-2A, G-2A, UV-2A
Software fotográficoNikonNIS-Elements
Software do editor gráficoAdobePhotoshop CS
Software de processamento de imagemNIHImageJ

References

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  1. Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
  2. Cui, W., et al.

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Neuronal Viability AssessmentFluorescein Diacetate StainingPropidium Iodide StainingCerebellar Granule Neuron CultureGlial Cell ExclusionFluorescence MicroscopyFDA PI Double StainingHoechst DNA StainingCell Viability MeasurementPrimary Neuronal Culture

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