Avaliação da Viabilidade Neuronal Utilizando Coloração Dupla de Iodeto de Diacetate-Propidium de Fluoresceína em Cultura de Neurônio de Granulado Cerebelar
Summary
Este protocolo descreve como medir com precisão a viabilidade neuronal usando fluoresceína diacetato (FDA) e Propidium Iodide (PI) dupla coloração em neurônios cultivados cerebrais grânulo, uma cultura primária neuronal utilizado como um modelo in vitro em neurociência e neuropharmacology investigação.
Abstract
Os neurónios de grãos cerebelosos cultivados primários (CGNs) têm sido amplamente utilizados como um modelo in vitro em neurociência e investigação neurofarmacologia. No entanto, a coexistência de células gliais e neurônios na cultura CGN pode levar a viés na avaliação precisa da viabilidade neuronal. O diacetato de fluoresceína (FDA) e a coloração dupla de iodeto de propídio (PI) foram utilizados para medir a viabilidade celular ao avaliar simultaneamente as células viáveis e mortas. Utilizou-se coloração dupla FDA-PI para melhorar a sensibilidade dos ensaios colorimétricos e avaliar a viabilidade neuronal em CGNs. Além disso, adicionamos manchas azuis fluorescentes de DNA ( por exemplo, Hoechst) para melhorar a precisão. Este protocolo descreve como melhorar a precisão da avaliação da viabilidade neuronal utilizando estes métodos na cultura CGN. Utilizando este protocolo, o número de células gliais pode ser excluído utilizando microscopia de fluorescência. Uma estratégia semelhante pode ser aplicada para distinguir os gli indesejadosAl de neurónios em várias culturas de células misturadas, tais como cultura cortical primária e cultura de hipocampo.
Introduction
Os ensaios de citotoxicidade colorimétrica, tais como o ensaio de brometo de 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2-H-tetrazólio (MTT), são comummente utilizados para medir a viabilidade celular in vitro . Os neurónios de grânulos cerebelosos (CGNs) cultivados primários de ratos são sensíveis a várias neurotoxinas, incluindo ião 1-metil-4-fenilpiridinio, peróxido de hidrogénio e glutamato 1 , 2 . Portanto, as culturas CGN podem ser usadas como um modelo in vitro no campo da neurociência. As culturas CGN podem conter uma variedade de células, incluindo neurónios e células gliais, que podem representar cerca de 1% das células totais na cultura CGN. No entanto, as células gliais respondem de forma diferente às neurotoxinas em comparação com os neurónios, levando a um viés na viabilidade neuronal medida por ensaios colorimétricos 3 .
Em células viáveis, o diacetato de fluoresceína (FDA) pode ser convertido em fluoresceína por esterase.O iodeto de propídio (PI) pode interagir com o DNA após a penetração de células mortas e pode ser usado para indicar apoptose dentro da cultura. Por conseguinte, a coloração dupla FDA-PI pode simultaneamente avaliar células viáveis e células mortas, sugerindo que a viabilidade celular pode ser medida com maior precisão pela combinação de ambos os métodos colorimétricos. Além disso, adicionando Hoechst, uma mancha fluorescente azul para núcleos, a precisão da viabilidade celular poderia ser melhorada. O protocolo aqui apresentado descreve a coloração dupla de FDA-PI e a coloração tripla FDA-PI-Hoechst, que pode ser utilizada para analisar com precisão a viabilidade neuronal em CGNs de cultura primária.
Este protocolo aproveita-se de visualizar e distinguir CGNs e células gliais por seus diferentes tamanhos e formas. Após a coloração, o número de neurônios viáveis e neurônios mortos são contados a partir de imagens representativas tomadas por microscopia fluorescente. As células gliais de tamanho grande são excluídas pela comparação de CGNs típicos tEm modo fluorescente com as tomadas em modo de contraste de fase. Uma estratégia semelhante pode ser realizada para medir a viabilidade neuronal em culturas de células misturadas contendo neurónios e células gliais, tais como culturas corticais primárias e culturas de hipocampo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo foi modificado a partir de procedimentos que foram descritos anteriormente 6 , 7 . Os pesquisadores passaram tempo tentando reduzir o crescimento de células não-neuronais melhorando as condições quando cultivando neurônios primários in vitro 8 . Contudo, mesmo com condições de cultura melhoradas, permanecem algumas células gliais. Além disso, células não-neuronais são necessárias em culturas neuronais…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi suportado por concessões da fundação natural da ciência da província de Zhejiang (LY15H310007), o projeto aplicado da pesquisa na tecnologia sem fins lucrativos da província de Zhejiang (2016C37110), a fundação nacional da ciência natural de China (U1503223, 81673407) (2014D10019), a equipe de inovação municipal de Ningbo da ciência e da saúde de vida (2015C110026), o projeto provincial da cooperação internacional de Guangdong da ciência e da tecnologia (No. 2013B051000038), Shenzhen o programa básico da pesquisa (JCYJ20160331141459373), Guangdong-Hong (GHP / 012 / 16GD), o Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong (15101014), a Universidade Politécnica de Hong Kong (G-YBGQ) e o Fundo KC Wong Magna da Universidade de Ningbo.
Materials
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Cytosine β-D-Arabinofuranoside | Sigma | C1768 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | high quality FBS is essential for culture |
| 100× glutamine | Gibco | 25030081 | |
| 100× anti-biotic | Gibco | 15240062 | |
| BME medium | Gibco | 21010046 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma | F7378 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| rabbit Anti-GAP43 antibody | Abcam | ab75810 | |
| mouse Anti-GFAP antibody | Cellsignaling | 3670 | |
| Bovine serum albumin | Sangon Biotech | A602440 | |
| Trypsin | Sigma | T4665 | |
| DNAse | Sigma | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pasteur pipette | Volac | Z310727 | burn the tip round before use |
| 12-well cell culture plates | TPP | Z707783 | |
| 6-well cell culture plates | TPP | Z707759 | high quality cell culture plate is essential for culture |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Pipet 5 ml | Excell Bio | CS017-0003 | |
| Pipet 10 ml | Excell Bio | CS017-0004 | |
| Dissect microscope | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 311 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | TI-S | |
| Fluorescence filter and emmision cubes | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
| Photo software | Nikon | NIS-Elements | |
| Graphics editor softeware | Adobe | Photoshop CS | |
| Image process softeware | NIH | ImageJ |
Referências
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