마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가
Summary
This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.
Abstract
Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.
Introduction
핵심은 배아 (1), (2)에서 개발 한 최초의 기능 기관이다. 순환계와 함께에서는 산소, 영양분, 개발시의 폐기물 처리 장치에 공급한다. 3 주 후, 수정, 인간 심장 처음 박동 및 적절한 조절은 심근 (CMS)에 의해 유지된다. 이들 특화된 세포의 비가역적인 손실 따라서 진보적 심부전의 기초가되는 기본적인 문제이다. 이러한 제브라 피쉬 제노와 같은 일부 유기체는 심장 재생 잠재력을 가지고 있지만, 성인 포유류 심장 3, 5, 6 개의 제한된다. 따라서, 심장의 중요한 기능을 제공, 심장 질환 혼자 7 미국에서 60 만 명이 사망를 차지, 세계에서 사망의 주요 원인이다 놀라운되지 않습니다. 그만큼효율적으로 복구하거나 손상된 심근을 대체 할 refore, 세포 기반 치료는 큰 임상 적 관심이다.
야마나카 동료 8 정액 연구는 네 개의 전사 인자 강제 발현이 다 능성 줄기 세포로 완전히 분화 된 섬유 아세포를 변환하기에 충분한 것으로 나타났다. 그러나, 모든 다 능성 줄기 세포의 종양 전략 용량은 치료 목적의 사용에 중요한 문제였다. 이것은 능성 단계를 피하면서 다른 방법은 세포를 transdifferentiate하는 검색 할 과학 분야 동기를 부여. 최근, 여러 그룹이 전사의 자궁외 식으로 유도 된 심근 유사 세포 (iCLMs)에 마우스 섬유 아세포의 직접 변환을 표시하여이 전략의 가능성을 보여 주었다 Gata4, Mef2c, Tbx5, 나중에, Hand2 (GMT 및 GHMT 요인 각각) 9,10. 작고에hermore 동일한 전략은 생체 내에서 인간 유래 조직 9, 11, 12에서 수행 될 수있다. 최근 연구에 추가적인 요소 또는 심부전 리 프로그래밍 효율을 13, 14, 15을 향상시키는 변조 될 수있는 신호 전달 경로를 강조하고있다. 함께 찍은, 이러한 연구는 재생 요법에 대한 감독 분화의 가능성을 보여줍니다. 그러나, 방법 론적 차이 16 CM 리 프로그래밍, 미지의 분자 메커니즘 일관성 재현성의 저 효율성 및 iCLMs의 이질적인 성질은 어드레싱 남아있다.
직접 iCLM 얼룩을 평가하기 위해, 우리는 근절 개발 및 심장 계통 specificatio의 식별 이산 견고한 단일 세포 분석 설계N-이 기능 심근의 필요한 특성. 심방 (AM), 심실 (VM)와 조정기 (PM) 17, 18, 19, 20의 위치와 고유의 전기적 특성에 의해 정의되는 심장 CM의 적어도 세 가지의 유형이있다. 조율 된 조합, 그들은 혈액의 적절한 펌핑을 할 수 있습니다. 심장 손상 중에, 하나 또는 모든 아형의 영향을 야기 할 수 있으며 세포 치료의 유형은 경우에 따라 해결해야 할 것이다. 작은 일이 부속 명세서를 조절하는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 수행되는 동안 현재 대부분의 전략은 심근 세포의 전체적인 생성에 초점을 맞춘다.
다음 연구는 제대로 잘 조직 된 근섬유 분절을 정량화 및 심근 서브 타입의 다양한 세트를 식별하는 방법을 자세히 설명합니다. 페이스 메이커 (PM) – 특정 기자 마우스를 사용하여, 우리는 난을 적용 할 수 있습니다mmunocytochemical 접근 방식은 유도 심방 같은 근육 세포 (IAM), 유도 심실 같은 근육 세포 (IVM)과 유도 PM-같은 근육 세포 (IPMS) (21)를 구별한다. 우리의 관찰에 기초하여, 전용 근절 조직을 나타내는 세포는 자율 박동 할 수있다. 이 독특한 프로그래밍 플랫폼 역할을 평가하기 위해 허용 단일 셀 해상도 근절 조직, 하위 사양 및 CM의 재 프로그래밍의 효율성의 특정 매개 변수를 설정합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구는 심장 전사의 레트로 바이러스 – 매개 발현을 통해 심장 서브 타입의 다양한 세트로 MEFs에의 변환을위한 직접 프로그래밍 전략을 제공하는 Gata4, Mef2c, Tbx5 및 Hand2 (GHMT) 요인. PM 특정 리포터 마우스와 함께 면역 다중화 방식을 사용하여, 우리는 단일 세포 해상도에서 IAM,이 iVMS 및 IPMS를 식별 할 수있다. 이러한 분석은 하위 유형의 다양성과 근절 개발에 대한 개별 전사 인자의 기여를 분리 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.
Materials
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8um/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100um cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45um Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6ml Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10X Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1X in H20 |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH20 |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 ml Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 ml Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
Referências
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
- Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
- Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
- Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
- Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
- Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
- Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Conner, D. A. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
- Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).
