This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.
Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.
दिल भ्रूण 1, 2 में विकसित करने के लिए पहले कार्यात्मक अंग है। संचार प्रणाली के साथ संयोजन के रूप में, यह ऑक्सीजन, पोषक तत्वों, और विकास के दौरान एक अपशिष्ट निपटान तंत्र आपूर्ति करती है। तीन हफ्ते निषेचन के बाद, मानव हृदय पहली बार के लिए धड़क रहा है और इसके समुचित नियमन cardiomyocytes (सीएम) द्वारा बनाए रखा है। इन विशेष कोशिकाओं के अपरिवर्तनीय नुकसान इसलिए मूलभूत मुद्दे प्रगतिशील दिल की विफलता अंतर्निहित है। ऐसे zebrafish और Xenopus के रूप में कुछ जीवों के हृदय उत्थान के लिए क्षमता है, वहीं वयस्क स्तनधारी दिल और अधिक सीमित 3, 5, 6 है। इस प्रकार, दिल का महत्वपूर्ण कार्य को देखते हुए यह नहीं आश्चर्यजनक है कि हृदय रोग दुनिया में मौत का प्रमुख कारण है, संयुक्त राज्य अमेरिका अकेले 7 में 600,000 से होने वाली मौतों के लिए लेखांकन।refore, सेल आधारित चिकित्सा कुशलता से मरम्मत या घायल मायोकार्डियम को बदलने के लिए महान नैदानिक रुचि के हैं।
यामानाका और उनके सहयोगियों 8 की मौलिक अध्ययन से पता चला है कि चार प्रतिलेखन कारक के लिए मजबूर अभिव्यक्ति स्टेम कोशिकाओं को पूरी तरह से विभेदित fibroblast कोशिकाओं में परिवर्तित करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, सभी स्टेम सेल रणनीतियों के tumorigenic क्षमता चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए उनके उपयोग में एक गंभीर चिंता का विषय रहा है। यह वैकल्पिक तरीकों कोशिकाओं transdifferentiate करने के लिए, जबकि एक pluripotent चरण परहेज खोज करने के लिए वैज्ञानिक क्षेत्र प्रेरित किया। हाल ही में, कई समूहों के प्रतिलेखन के अस्थानिक अभिव्यक्ति के साथ प्रेरित cardiomyocyte कोशिकाओं की तरह (iCLMs) करने के लिए माउस fibroblasts की प्रत्यक्ष रूपांतरण प्रदर्शित करके इस रणनीति की व्यवहार्यता का पता चला है कारकों Gata4, Mef2c, Tbx5, और बाद में, Hand2 (जीएमटी और GHMT , क्रमशः) 9, 10। furthermore, एक ही रणनीति विवो में और मानव व्युत्पन्न ऊतकों 9, 11, 12 में किया जा सकता है। हाल के अध्ययनों से अतिरिक्त कारकों या संकेत दे रास्ते कि आगे हृदय reprogramming दक्षता 13, 14, 15 में सुधार के लिए संग्राहक जा सकता है पर प्रकाश डाला है। साथ में ले ली, इन अध्ययनों पुनर्योजी उपचार के लिए निर्देशित transdifferentiation की क्षमता प्रदर्शित करता है। हालांकि, methodological मतभेद के कारण 16 मुख्यमंत्री reprogramming, अज्ञात आणविक तंत्र, असंगत reproducibility की कम क्षमता, और iCLMs की विषम प्रकृति unaddressed रहते हैं।
आदेश सीधे iCLM विविधता का मूल्यांकन करने के लिए हम sarcomere विकास और हृदय वंश specificatio की पहचान के लिए एक असतत और मजबूत एकल कोशिका परख के लिए बनाया गयाएन-दो कार्यात्मक cardiomyocytes के लिए आवश्यक विशेषताओं। आलिंद (एएम), निलय (वीएम) और पेसमेकर (प्रधानमंत्री) 17, 18, 19, 20: के रूप में उनके स्थान और अद्वितीय बिजली के गुणों से परिभाषित दिल में मुख्यमंत्री के कम से कम तीन प्रमुख प्रकार के होते हैं। एक करवाया संयोजन में, वे खून के समुचित पंप अनुमति देते हैं। दिल की चोट के दौरान, एक या सभी उपप्रकार को प्रभावित किया जा सकता है, और सेल थेरेपी के प्रकार के एक मामले दर मामले के आधार पर समाधान किए जाने की आवश्यकता होगी। वर्तमान में, सबसे रणनीतियों, cardiomyocytes के समग्र पीढ़ी पर ध्यान केंद्रित करते हुए छोटे से काम के आणविक तंत्र है कि उप प्रकार विनिर्देश का नियमन का अध्ययन करने के लिए किया जा रहा है।
निम्नलिखित अध्ययन विवरण कैसे ठीक से अच्छी तरह से संगठित sarcomeres यों और cardiomyocyte उपप्रकार की एक विविध सेट की पहचान। एक पेसमेकर (प्रधानमंत्री) विशिष्ट संवाददाता माउस का प्रयोग, हम एक मैं लागू करने में सक्षम हैंmmunocytochemical दृष्टिकोण प्रेरित आलिंद की तरह myocytes (आई ए एम), प्रेरित वेंट्रिकुलर-तरह myocytes (Ivm), और प्रेरित PM-तरह myocytes (IPMS) 21 भेद करने के लिए। हमारी टिप्पणियों के आधार पर, केवल कोशिकाओं है कि sarcomere संगठन का प्रदर्शन सहज पिटाई करने में सक्षम हैं। इस अनूठी reprogramming मंच भूमिका का आकलन करने के लिए अनुमति देता है एकल कोशिका संकल्प पर sarcomere संगठन, उप प्रकार विनिर्देश, और मुख्यमंत्री reprogramming की दक्षता में से कुछ मापदंडों।
वर्तमान अध्ययन हृदय प्रतिलेखन के रेट्रोवायरस की मध्यस्थता अभिव्यक्ति के माध्यम से हृदय उपप्रकार की एक विविध सेट में MEFs के रूपांतरण के लिए एक सीधा-reprogramming रणनीति प्रदान करता है Gata4, Mef2c, Tbx5, और Hand2 (GHMT) कारकों। एक …
The authors have nothing to disclose.
A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.
DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8um/mL |
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
BioCoat Fibronectin 12mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
100um cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
0.45um Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
6ml Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
Power Block 10X Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1X in H20 |
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH20 |
6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
15 ml Conical tubes | Corning | 4308 | |
50 ml Conical tubes | Corning | 4249 | |
0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |