Un metodo per testare l 'effetto dei segnali ambientali sul comportamento di accoppiamento in<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Noi dimostriamo un dosaggio per analizzare i suggerimenti ambientali e genetici che influenzano il comportamento di accoppiamento nella mosca di frutta Drosophila melanogaster .
Abstract
L'azionamento sessuale di un individuo è influenzato dal genotipo, dall'esperienza e dalle condizioni ambientali. Come questi fattori interagiscono per modulare i comportamenti sessuali rimane poco compreso. In Drosophila melanogaster , i segnali ambientali, come la disponibilità di cibo, influenzano l'attività di accoppiamento che offre un sistema tracciato per indagare i meccanismi che modulano il comportamento sessuale. In D. melanogaster , i segnali ambientali vengono spesso rilevati attraverso i sistemi gassosi e olfattivi chemosensoriali. Qui espostiamo un metodo per testare l'effetto dei segnali chimici ambientali sul comportamento dell'accoppiamento. Il dosaggio è costituito da una piccola arena di accoppiamento contenente un mezzo alimentare e una coppia di accoppiamenti. La frequenza di accoppiamento per ogni coppia viene monitorata continuamente per 24 ore. Qui esprimiamo l'applicabilità di questo test per testare i composti ambientali da una sorgente esterna attraverso un sistema di aria compressa e la manipolazione dei componenti ambientali direttamente nell'arena di accoppiamento. L'uSe di un sistema di aria compressa è particolarmente utile per testare l'effetto di composti molto volatili, mentre manipolazione di componenti direttamente nell'arena di accoppiamento può essere utile per accertare la presenza di un composto. Questo saggio può essere adattato per rispondere a domande sull'influenza delle indicazioni genetiche e ambientali sul comportamento e sulla fecondità di accoppiamento e su altri comportamenti riproduttivi maschi e femmine.
Introduction
I comportamenti riproduttivi hanno generalmente elevati costi energetici, soprattutto per le femmine, che producono gameti più grandi rispetto ai maschi e devono scegliere con cura le condizioni per aumentare la loro prole in via di sviluppo. A causa del costo energetico, non sorprende che la riproduzione sia connessa alle condizioni nutrizionali. Questo è vero nella maggior parte, se non in tutti, animali compresi i mammiferi, la cui pubertà può essere ritardata dalla malnutrizione e il cui comportamento sessuale può essere influenzato negativamente dalla restrizione alimentare 1 .
La riproduzione dell'organismo del modello genetico Drosophila melanogaster è anche influenzata da condizioni nutrizionali. La corte dei maschi a livello più elevato in presenza di volatili alimentari 2 e le femmine sono più ricettive sessualmente in presenza di lieviti, un importante nutrimento per la produzione di uova e la sopravvivenza dei figli 3 , 4 , 5 . QuestoLa risposta riproduttiva evoluzionistica riposta all'alimentazione offre l'opportunità di studiare meccanismi che connettono la disponibilità di cibo ambientale alla riproduzione sessuale in un organismo geneticamente tractable e time-efficient. Infatti, il lavoro in D. melanogaster ha implicato il percorso dell'insulina come un importante regolatore della connessione tra il comportamento alimentare e l'accoppiamento 6 . Ha anche dimostrato che l'atto di accoppiamento modifica la preferenza alimentare delle femmine nonché i neuroni chemiosensori associati 7 , 8 , 9 .
È chiaro che le indicazioni alimentari influenzano i comportamenti riproduttivi in D. melanogaster . Questi effetti sembrano interessare principalmente le femmine, in particolare quelle che hanno già maturato 5 . Tuttavia, per testare questi effetti acuti delle condizioni ambientali, il dosaggio classico utilizzato per il comportamento femminile di accoppiamento potrebbeNon essere molto adatto a causa delle lunghe interruzioni tra gli episodi di accoppiamento. Nel classico test di rimozione, una femmina vergine prima si collega con un maschio e viene immediatamente isolata e presentata con un nuovo maschio 24-48 h più tardi. Questo saggio classico è stato usato con grande successo per identificare componenti dell'eiaculato maschile che modificano il comportamento femminile e la risposta femminile 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Il test di accoppiamento continuo dimostrato qui è quindi un'aggiunta a saggi classici di accoppiamento che possono essere utilizzati per studiare l'effetto acuto delle condizioni ambientali sui comportamenti riproduttivi.
Utilizzando il dosaggio continuo per il comportamento di accoppiamento che viene spiegato qui, abbiamo precedentemente mostrato che una coppia di mosche esposte al lievito rimateràSempre in un periodo di osservazione di 24 ore 5 , 19 , 20 , 21 , mentre mosche non esposte al cibo rimarrà solo una volta 5 . Questa scoperta può essere sconcertante alla luce di una grande parte della letteratura D. melanogaster che indica che le femmine non si ritraggono per diversi giorni dopo un accoppiamento iniziale (riveduto nei riferimenti 10 , 11 ). Tuttavia, questa discrepanza può essere facilmente spiegata da condizioni di analisi, in cui una femmina è isolata per uno a diversi giorni prima di fornire una nuova opportunità di accoppiamento. Se la coppia non si accoppia in questo periodo di osservazione, la donna è caratterizzata come non ricettivo. Inoltre, la frequenza di accoppiamento elevato non dovrebbe sorprendere, dato che i dati provenienti da mosche selvatiche mostrano che le femmine contengono spermatozoi da 4 a 6 maschi nei loro organi di stoccaggio; Così inDicating che le femmine naturalmente rimane diverse volte 22 , 23 .
Qui dimostriamo l'uso di questo saggio di accoppiamento continuo per scoprire come le mosche raccolgono e combinano informazioni sulle condizioni ambientali per modulare la frequenza di accoppiamento. Questo test consente di testare un numero relativamente elevato di coppie di maternità per studi genetici e di verificare l'influenza dei segnali ambientali volatili e non volatili. Il dosaggio viene tipicamente eseguito per 24 h, ma può essere esteso a 48 h, consentendo la sperimentazione di segnali ambientali di ciclo come il ciclo scuro (LD). Ci dimostriamo questo test verificando l'influenza dei segnali volatili da una coltura di lieviti all'interno di un sistema di aria pressurata in combinazione con la disponibilità di nutrienti di lievito non volatili nel substrato alimentare.
L'impianto a pressione pressurizzata pompava continuamente segnali volatili in un'arena di accoppiamento che contengonoSubstrato alimentare e una coppia di test (il cui comportamento di accoppiamento è monitorato). Per determinare ulteriormente le specificità attraverso le quali il lievito influenza l'accoppiamento, si prova un importante composto volatile di lievito, cioè acido acetico 24 , in combinazione con un contenuto di amminoacidi che corrisponde a quello del lievito nel substrato alimentare, sotto forma di peptone (amino Acidi derivati dalla digestione enzimatica delle proteine animali). Insieme questi esperimenti dimostrano come l'effetto dei segnali ambientali sul comportamento di accoppiamento di D. melanogaster possa essere testato con questo saggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un test per verificare il comportamento di accoppiamento per 24 ore mentre controlla continuamente i segnali ambientali che una coppia di accoppiamenti è ipotizzata per utilizzare per determinare la frequenza di accoppiamento. È possibile aumentare la frequenza di accoppiamento in risposta all'aria del lievito erogata attraverso un sistema di aria compressa quando il mezzo contiene anche il lievito ( Figura 2B ). Inoltre, una risposta simile in frequenza di accoppiamento…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Bloomington Drosophila Stock Center per gli stock fly; C. Gahr, JT Alkema e S. van Hasselt per il loro primo tentativo di sviluppare il dosaggio dell'aria sotto pressione; Jasper Bosman per il consiglio sulla coltivazione del lievito; E Rezza Azanchi e Joel Levine per sviluppare in origine il monitoraggio del comportamento di accoppiamento Drosophila . JA Gorter è stato sostenuto da una borsa di studio della Neuroscience Research School di BCN / NWO. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dall'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) (riferimento: 821.02.020) a JC Billeter.
Materials
| Cabinet | |||
| Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
| White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
| Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
| Power timer | Alecto | TS-121 | |
| Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
| Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
| Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
| Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
| Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
| Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
| Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly rearing | |||
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Wild-type flies | Canton-S | ||
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
| Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
| Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
| Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
| Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast and pressurised air set-up | |||
| Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
| Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
| Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
| Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
| Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
| Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
| Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
| Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
| 15 ml tube | Falcon | ||
| Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
| Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
| Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
| Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
| Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Hot glue | Pattex | ||
| Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis | |||
| Statistics software | R | lme4 package |
Referências
- Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
- Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
- Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -. C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
- Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
- Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
- Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
- Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
- Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, 1-108 (2014).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
- Yapici, N., Kim, Y. -. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
- Yang, C. -. H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
- Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
- Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -. B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
- Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
- Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
- Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
- Krupp, J. J., Billeter, J. -. C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
- Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
- Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
- Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
- Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575 (2011).
- Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
- Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
- Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
- Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).
