Um método para testar o efeito de sugestões ambientais no comportamento de acoplamento em<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Demonstramos um ensaio para analisar as pistas ambientais e genéticas que influenciam o comportamento de acasalamento na mosca da fruta Drosophila melanogaster .
Abstract
A movimentação sexual de um indivíduo é influenciada pelo genótipo, experiência e condições ambientais. A forma como esses fatores interagem para modular os comportamentos sexuais permanece mal compreendida. Em Drosophila melanogaster , as pistas ambientais, como a disponibilidade de alimentos, afetam a atividade de acasalamento oferecendo um sistema atraente para investigar os mecanismos que modulam o comportamento sexual. Em D. melanogaster , as sugestões ambientais são muitas vezes detectadas através dos sistemas gustativos e olfativos quimiossensíveis. Aqui, apresentamos um método para testar o efeito de pistas químicas ambientais sobre o comportamento de acasalamento. O ensaio consiste em uma pequena arena de acasalamento contendo meio alimentar e um casal de acasalamento. A frequência de acasalamento para cada casal é monitorada continuamente por 24 h. Aqui apresentamos a aplicabilidade deste ensaio para testar compostos ambientais de uma fonte externa através de um sistema de ar pressurizado, bem como a manipulação dos componentes ambientais diretamente na arena de acasalamento. VocêUm sistema de ar pressurizado é especialmente útil para testar o efeito de compostos muito voláteis, enquanto a manipulação de componentes diretamente na arena de acasalamento pode ser útil para determinar a presença de um composto. Este ensaio pode ser adaptado para responder a perguntas sobre a influência de pistas genéticas e ambientais sobre comportamento e fecundidade de acasalamento, bem como outros comportamentos reprodutivos masculinos e femininos.
Introduction
Os comportamentos reprodutivos tipicamente têm altos custos de energia, especialmente para as mulheres, que produzem gametas maiores do que os machos e devem escolher cuidadosamente as condições para elevar sua prole em desenvolvimento. Devido ao custo da energia, não é surpreendente que a reprodução esteja ligada a condições nutricionais. Isso é verdade na maioria, se não em todos, animais, incluindo mamíferos, cuja puberdade pode ser adiada pela desnutrição e cuja excitação sexual pode ser afetada negativamente pela restrição alimentar 1 .
A reprodução do organismo modelo genético Drosophila melanogaster também é afetada por condições nutricionais. Tribunal dos machos em nível superior na presença de voláteis alimentares 2 , e as mulheres são mais receptivas sexualmente na presença de fermento, um importante nutriente para a produção de ovos e a sobrevivência da prole 3 , 4 , 5 . esteA resposta reprodutiva reproduzida evolutiva aos alimentos oferece a oportunidade de estudar mecanismos que conectem a disponibilidade de alimentos ambientais à reprodução sexual em um organismo genéticamente atraente e eficiente em termos de tempo. Na verdade, o trabalho em D. melanogaster implicou a via da insulina como um importante regulador da conexão entre alimentação e comportamento de acasalamento 6 . Também mostrou que o ato de se acasalar altera a preferência alimentar das fêmeas, bem como os neurônios quimiossensíveis associados 7 , 8 , 9 .
É claro que as indicações alimentares afetam os comportamentos reprodutivos em D. melanogaster . Esses efeitos parecem afetar principalmente as fêmeas, especificamente aqueles que já se acasalaram 5 . No entanto, para testar esses efeitos agudos das condições ambientais, o ensaio clássico usado para o comportamento de acasalamento feminino podeNão seja muito adequado devido às longas interrupções entre os episódios de acasalamento. No clássico ensaio de rematamento, uma fêmea virgem primeiro mata com um macho e é imediatamente isolada e apresentou um novo macho 24 a 48 h depois. Este ensaio clássico tem sido usado com grande sucesso para identificar componentes da ejaculação masculina que modificam o comportamento feminino e a resposta feminina 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . O ensaio de acoplamento contínuo demonstrado aqui é, portanto, uma adição aos ensaios clássicos de acoplamento que podem ser usados para estudar o efeito agudo das condições ambientais nos comportamentos reprodutivos.
Usando o ensaio contínuo para comportamento de acasalamento que é explicado aqui, anteriormente mostramos que um par de moscas expostas à fermento irá remeter sSempre em um período de observação de 24 h 5 , 19 , 20 , 21 , enquanto as moscas não expostas aos alimentos só serão rematadas uma vez 5 . Esta descoberta pode ser intrigante à luz de uma grande parte da literatura de D. melanogaster , indicando que as fêmeas não remontam por vários dias após um acasalamento inicial (revisado nas referências 10 , 11 ). No entanto, esta discrepância pode ser facilmente explicada por condições de ensaio, onde uma fêmea é isolada por um a vários dias antes de uma nova oportunidade de acasalamento ser fornecida. Se o par não se acasalar nesse período de observação de uma hora, a fêmea é caracterizada como não receptiva. Além disso, a alta freqüência de acasalamento não deve ser surpreendente, dado que os dados de moscas selvagens mostram que as fêmeas contêm esperma de 4 a 6 machos em seus órgãos de armazenamento; Assim, emDicionando que as fêmeas naturalmente remontam várias vezes 22 , 23 .
Aqui, demonstramos o uso deste ensaio de acoplamento contínuo para desvendar como as moscas se reúnem e combinam informações sobre condições ambientais para modular a freqüência de acasalamento. Este ensaio permite testar um número relativamente grande de casais de acasalamento para estudos genéticos e testar a influência de pistas ambientais voláteis e não voláteis. O ensaio normalmente é executado por 24 h, mas pode ser prolongado para 48 h, permitindo o teste de pistas ambientais de ciclagem, como o ciclo luz-escuro (LD). Demonstramos este ensaio testando a influência das pistas voláteis de uma cultura de fermento dentro de um sistema de ar pressurizado em combinação com a disponibilidade de nutrientes de fermento não volátil no substrato alimentar.
O sistema de ar pressurizado bombeia continuamente sinais voláteis para uma arena de acasalamento que contémUm substrato alimentar e um casal teste (cujo comportamento de acasalamento é monitorado). Para determinar ainda mais as especificidades através das quais a levedura influencia o acasalamento, testamos um grande composto volátil de fermento, a saber, ácido acético 24 , em combinação com um teor de aminoácidos que corresponde ao de fermento no substrato alimentar, na forma de peptona (amino Ácidos derivados da digestão enzimática de proteínas animais). Juntos, essas experiências demonstram como o efeito de pistas ambientais sobre o comportamento de acoplamento de D. melanogaster pode ser testado com este ensaio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um ensaio para testar o comportamento de acasalamento ao longo de 24 h, enquanto controla continuamente as pistas ambientais que um casal de acasalamento tem a hipótese de usar para determinar a freqüência de acasalamento. É possível aumentar a frequência de acasalamento em resposta ao ar de fermento entregue através de um sistema de ar pressurizado quando o meio também contém levedura ( Figura 2B ). Além disso, uma resposta semelhante na freqüência de acoplamento pod…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Bloomington Drosophila Stock Center pelas ações da mosca; C. Gahr, JT Alkema e S. van Hasselt por sua tentativa inicial de desenvolver o ensaio de ar pressurizado; Jasper Bosman, pelo conselho sobre o cultivo de fermento; E Rezza Azanchi e Joel Levine por desenvolverem originalmente o monitoramento do lapso de tempo do comportamento de acoplamento de Drosophila . A JA Gorter foi apoiada por uma bolsa do Programa de Pós-Graduação da Escola de Pesquisa de Neurociências BCN / NWO. Este trabalho foi apoiado em parte pela organização holandesa de pesquisa científica (NWO) (referência: 821.02.020) a JC Billeter.
Materials
| Cabinet | |||
| Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
| White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
| Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
| Power timer | Alecto | TS-121 | |
| Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
| Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
| Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
| Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
| Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
| Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
| Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly rearing | |||
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Wild-type flies | Canton-S | ||
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
| Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
| Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
| Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
| Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast and pressurised air set-up | |||
| Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
| Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
| Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
| Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
| Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
| Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
| Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
| Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
| 15 ml tube | Falcon | ||
| Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
| Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
| Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
| Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
| Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Hot glue | Pattex | ||
| Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis | |||
| Statistics software | R | lme4 package |
Referências
- Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
- Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
- Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -. C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
- Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
- Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
- Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
- Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
- Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, 1-108 (2014).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
- Yapici, N., Kim, Y. -. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
- Yang, C. -. H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
- Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
- Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -. B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
- Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
- Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
- Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
- Krupp, J. J., Billeter, J. -. C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
- Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
- Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
- Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
- Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575 (2011).
- Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
- Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
- Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
- Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).
