환경에서 신호의 결합 효과에 미치는 영향을 시험하는 방법<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
우리는 초파리 Drosophila melanogaster 에서 짝짓기 행동에 영향을 미치는 환경 및 유전 신호를 분석하는 분석법을 시연합니다.
Abstract
개인의 성행위는 유전자형, 경험 및 환경 조건의 영향을받습니다. 이러한 요인들이 어떻게 상호 작용하여 성적 행동을 조절하는지는 여전히 잘 알려져 있지 않습니다. Drosophila melanogaster 에서는 식량 가용성과 같은 환경 적 단서가 성적 행동을 조절하는 메커니즘을 조사 할 수있는 다루기 쉬운 시스템을 제공하는 교미 활동에 영향을 미칩니다. D. melanogaster에서 , 환경 단서는 종종 화학 감각 기관과 후각 시스템을 통해 감지됩니다. 여기에서는 짝짓기 행동에 환경 화학 신호의 영향을 테스트하는 방법을 제시합니다. 이 분석법은 식품 매체와 짝짓기 커플을 포함하는 작은 짝짓기 경기장으로 구성됩니다. 각 커플의 교미 빈도는 24 시간 동안 지속적으로 모니터링됩니다. 여기서 우리는 가청 공기 시스템을 통해 외부 소스로부터 환경 화합물을 시험 할뿐만 아니라 짝짓기 경기장에서 환경 성분을 직접 조작하는이 분석의 적용 가능성을 제시합니다. 너는가압 에어 시스템은 매우 휘발성 인 화합물의 효과를 테스트하는 데 특히 유용하며, 상대방의 구성 요소를 직접 조작하는 것은 화합물의 존재를 확인하는 데 가치가 있습니다. 이 분석은 유전 적 및 환경 적 단서가 짝짓기 행동과 생식력 및 기타 남성과 여성의 생식 행동에 미치는 영향에 대한 질문에 대답 할 수 있습니다.
Introduction
생식 행동은 일반적으로 남성보다 큰 배우자를 생산하고 개발하는 자손을 키우기위한 조건을 신중하게 선택해야하는 여성에게 특히 높은 에너지 비용을 초래합니다. 에너지 비용 때문에 재생산이 영양 상태와 관련이 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 이것은 포유류를 포함한 대부분의 동물에서 마찬가지입니다. 포유 동물은 영양 부족으로 사춘기가 늦어 질 수 있으며 성행위가 식량 제한으로 인해 부정적인 영향을받을 수 있습니다 1 .
유전 모델 유기체 Drosophila melanogaster 의 번식은 영양 상태에 의해서도 영향을받습니다. 식품 휘발성이의 존재에 높은 수준의 남성 코트, 그리고 여성보다 성적 효모, 계란 생산 및 자손의 생존 3, 4, 5의 주요 영양소의 존재에 수용된다. 이진화 보존 된 식품에 대한 생식 적 반응은 환경 친화적 인 식품 이용 가능성을 유 전적으로 다루기 쉽고 시간이 절약되는 유기체에서 성 생식에 연결시키는 메커니즘을 연구 할 기회를 제공합니다. 실제로 D. melanogaster 에서의 연구는 인슐린 경로가 음식과 교미 행동 사이의 연관성에 대한 중요한 조절 자라는 것을 의미합니다 6 . 또한 자체를 정합하는 단계는 암컷의 음식 선호도뿐만 아니라 관련된 화학 감각 뉴런 7, 8, 9를 변경하는 것으로 나타났다.
D. melanogaster 에서 음식 단서가 생식 행동에 영향을주는 것은 분명합니다. 이러한 효과는 주로 여성, 특히 이미 5를 짝 지어 준 여성에게 영향을 미치는 것으로 보입니다. 그러나 환경 조건의 급성 영향을 시험하기 위해 여성의 행동에 고전적으로 사용되는 분석법이짝짓기 에피소드 간의 오랜 중단으로 인해 적합하지 않습니다. 클래식 remating 분석에서 처녀 여성 먼저 남성과 짝짓기, 즉시 격리하고 새로운 남성과 함께 24 ~ 48 시간 후에 제공됩니다. 이 고전적 분석법은 여성의 행동과 여성 반응을 수정하는 남성 사정의 구성 요소를 확인하는 데 큰 성공을 거두었습니다 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . 따라서 여기에서 입증 된 연속 교미 분석은 재생산 행동에 대한 환경 조건의 급성 효과를 연구하는 데 사용할 수있는 고전적 교미 분석법에 추가 된 것입니다.
여기에 설명 된 짝짓기 행동에 대한 연속 분석법을 사용하여 이전에 효모에 노출 된 한 쌍의 파리가24 시간 관찰 기간 5, 19, 20, 21 배 이상 everal, 파리만이 remate 한번 음식 (5)에 노출되지 않는 상태. 이 발견은 D. melanogaster 문헌의 많은 부분에 비추어 수수께끼 일 수 있습니다 . 암컷은 초기 교미 후 며칠 동안 remate하지 않는다는 것을 나타냅니다 (참고 문헌 10 , 11 에서 검토 됨). 그러나 이러한 불일치는 새로운 교미 기회가 제공되기 전에 암컷이 1 일에서 며칠 동안 격리 된 분석 조건에 의해 쉽게 설명 될 수 있습니다. 쌍이이 1 시간의 관측 기간에 짝짓기하지 않으면 암컷은 감수성이없는 것으로 특징 지어진다. 더욱이, 야생 잡힌 파리의 자료에 따르면 암컷에 저장 기관에 4 ~ 6 마리의 수컷이 들어있는 정자가 있다는 것을 감안할 때, 높은 교미 빈도는 놀랄만 한 일이 아니어야한다. 따라서여성 자연스럽게, 23 차례 (22) remate 것을 dicating.
여기에서 우리는 파리가 어떻게 모여지고 환경 조건에 대한 정보를 결합하여 짝짓기 빈도를 조절하는지에 대한이 연속 교배 분석법의 사용을 입증합니다. 이 분석을 통해 유전자 연구를 위해 비교적 많은 수의 교미 부부를 시험하고 휘발성 및 비 휘발성 환경 단서의 영향을 시험 할 수 있습니다. 이 분석은 일반적으로 24 시간 동안 실행되지만 48 시간까지 연장 될 수있어 명암주기 (light-dark, LD)주기와 같은 사이클링 환경 큐를 테스트 할 수 있습니다. 우리는 식품 기질에서 비 휘발성 효모 영양소의 가용성과 함께 가압 공기 시스템 내에서 효모 배양으로부터 휘발성 신호의 영향을 시험함으로써이 분석을 입증합니다.
가압 공기 시스템은 지속적으로 휘발성 큐를식품 기질 및 시험 커플 (그의 교미 행동이 모니터 됨). 효모가 짝짓기에 영향을주는 세부 사항을 더 결정하기 위해, 우리는 효모의 주요 휘발성 화합물, 즉 아세트산 24 를 펩톤 (아미노산)의 형태로 식품 기질의 효모에 상응하는 아미노산 함량과 함께 시험한다 동물성 단백질의 효소 소화에서 유래 된 산). 이 실험들은 함께 D. melanogaster 의 교미 작용에 대한 환경 신호의 영향이이 분석법으로 시험 될 수 있음을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 짝짓기 커플이 짝짓기 빈도를 결정하는 데 사용하도록 가정 된 환경 신호를 지속적으로 제어하면서 24 시간 동안 짝짓기 행위를 테스트하는 분석을 설명합니다. 배지에 효모가 들어있을 때 가압 공기 시스템을 통해 전달되는 효모 공기에 반응하여 결합 빈도를 높일 수 있습니다 ( 그림 2B ). 또한 짝짓기 빈도의 비슷한 반응은 배지에서 한천, 펩톤 및 아세트산 냄새만을 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 비행 주식에 대한 블루밍턴 Drosophila 주식 센터 감사드립니다; C. Gahr, JT Alkema 및 S. van Hasselt가 가압 공기 분석법 개발 초기 시도 재스퍼 보스 만 (Jasper Bosman) : 효모 배양에 대한 조언; 원래는 Drosophila 교배 행동의 저속 모니터링을 개발 한 Rezza Azanchi와 Joel Levine입니다. JA Gorter는 Neuroscience Research School BCN / NWO 대학원 프로그램 지원금으로 지원되었습니다. 이 작업은 JC Billeter에 대한 네덜란드 연구 기관 (NWO) (참고 : 821.02.020)이 부분적으로 지원했습니다.
Materials
| Cabinet | |||
| Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
| White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
| Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
| Power timer | Alecto | TS-121 | |
| Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
| Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
| Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
| Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
| Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
| Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
| Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly rearing | |||
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Wild-type flies | Canton-S | ||
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
| Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
| Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
| Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
| Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast and pressurised air set-up | |||
| Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
| Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
| Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
| Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
| Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
| Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
| Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
| Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
| 15 ml tube | Falcon | ||
| Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
| Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
| Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
| Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
| Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Hot glue | Pattex | ||
| Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis | |||
| Statistics software | R | lme4 package |
Referências
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