Summary
Deze procedure beschrijft hoe snel neurieten georganiseerd in microfluïdische kamers kunnen initiëren, verlengen en verbinden met behulp van poly-D-lysine beklede kralen die zijn bevestigd aan micropipetten die leiden tot neuriet verlenging.
Abstract
Brain en ruggenmerg letsel kan leiden tot blijvende invaliditeit en dood, omdat het nog steeds niet mogelijk is om neuronen te regenereren over lange afstanden en ze nauwkeurig opnieuw te verbinden met een geschikt doelwit. Hier wordt een procedure beschreven om snel te initiëren, verlengen en nauwkeurig nieuwe functionele neuronale circuits over lange afstanden aan te sluiten. De toegevoerde uitbreidingssnelheden bereiken meer dan 1,2 mm / u, 30-60 keer sneller dan de in vivo- snelheden van de snelst groeiende axonen van het perifere zenuwstelsel (0,02 tot 0,04 mm / u) 28 en 10 keer sneller dan eerder gemeld voor hetzelfde Neuronale type in een vroeger stadium van ontwikkeling 4 . Ten eerste worden geïsoleerde populaties van rathippocampale neuronen gedurende 2-3 weken in microfluïdische inrichtingen geteeld om de cellen nauwkeurig te positioneren, waardoor gemakkelijke micromanipulatie en experimentele reproduceerbaarheid mogelijk zijn. Vervolgens worden kralen bedekt met poly-D-lysine (PDL) op neurieten geplaatst om lijmconstructie te vormenDaden en pipette micromanipulatie wordt gebruikt om het resulterende kraal-neurietcomplex te verplaatsen. Naarmate de kraal wordt verplaatst, trekt het een nieuwe neuriet uit die over honderden micrometers kan worden verlengd en functioneel in een doelcel in minder dan 1 uur verbonden is. Dit proces maakt experimentele reproduceerbaarheid en gemak van manipulatie mogelijk, terwijl langzamere chemische strategieën worden omzeild om neurietgroei te stimuleren. Voorlopige metingen die hier worden gepresenteerd, tonen een neuronale groeitempo ver boven fysiologische Door deze innovaties te combineren staat de precieze vestiging van neuronale netwerken in cultuur met een ongekende mate van controle mogelijk. Het is een nieuwe methode die de deur opent voor een overvloed aan informatie en inzichten in signaaloverdracht en communicatie binnen het neuronale netwerk, alsook een speeltuin om de grenzen van neuronale groei te verkennen. De mogelijke toepassingen en experimenten zijn wijdverspreid met directe implicaties voor therapieën die gericht zijn op het opnieuw aansluiten van neuronaL circuits na trauma of in neurodegeneratieve ziekten.
Introduction
Schade aan het volwassen centrale zenuwstelsel (CNS) kan leiden tot blijvende handicap door meerdere mechanismen die axonale hergroei beperken 1 . Na aanleiding van het letsel vormen veel CNS-axons geen nieuwe groeikegel en worden er geen effectieve regeneratieve respons opgebouwd 2 . Bovendien, schade en littekenweefsel rondom CNS laesies belemmeren axonale groei 1 , 2 , 3 significant. Huidige therapieën ter bevordering van CNS-regeneratie na verwonding hebben gericht op het vergroten van het intrinsieke groeipotentieel van de gewonde neuron en op het maskeren van de remmers van de axonale verlenging geassocieerd met myeline puin en de glialarc 1 , 3 . Desondanks blijft de mogelijkheid om lange axonen te verteren naar verre doelen en om passende functionele synaptes te vormen, sterk beperkt 4 , 5 , 6 , 7 .
In het huidige werk worden microbeads, pipette micromanipulation en microfluidische apparaten gebruikt om snel nieuwe initiatieven te verlengen, verlengen en nauwkeurig nieuwe, functionele neuronale circuits over lange afstanden aan te sluiten. Vorige werk heeft aangetoond dat poly-D-lysine-beklede kralen (PDL-kralen) membraanhechting veroorzaken, gevolgd door de clustering van synaptische vesikelcomplexen en de vorming van functionele presynaptische boutons 8 . Het werd ook gebleken dat wanneer de PDL-kraal mechanisch weggetrokken wordt na de presynaptische differentiatie, de synaptische eiwitcluster volgt op de kraal, waarbij een nieuwe neuriet wordt geïnitieerd 9 . De volgende procedure exploiteert dit feit samen met het vermogen om embryonale hippocampale neuronen van ratten te culturen in georganiseerde gebieden op een deklaag met gebruikmaking van polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische inrichtingen om een neuronalecircuit.
Deze PDMS microfluidische apparaten zijn niet-giftig, optisch transparant en bestaan uit twee kamers verbonden door een systeem van microkanalen. Eenmaal op een deklaag gemonteerd, dient elk apparaat als een vorm om neuronale groei te leiden en gezonde neuronale culturen op nauwkeurige patronen langer dan 4 weken in vitro te handhaven .
Hier wordt een kader voorgesteld om de grenzen van uitbreiding en functionaliteit van de nieuwe neuriet te onderzoeken. Nieuwe, functionele neurieten worden gecreëerd en gepositioneerd voor controllable (re) wire neuronale netwerken. De toegevoerde uitbreidingssnelheden zijn sneller dan 20 μm / min over afstanden van millimeters en functionele verbindingen worden vastgesteld. Deze resultaten tonen onverwacht dat de intrinsieke capaciteit van deze neurieten voor verlenging veel sneller is dan eerder gedacht. Deze voorgestelde mechanische aanpak omzeilt langzame chemische strategieën en zorgt voor een gecontroleerde verbinding met een specifiek doel. thIs techniek opent nieuwe mogelijkheden voor de in vitro studie van nieuwe therapieën om neuronale connectiviteit na herstel te herstellen. Het maakt ook het manipuleren en herbinnen van neuronale netwerken in staat om fundamentele aspecten van neuronale signaalverwerking en neuronale functie in vitro te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hieronder beschreven procedures werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van McGill University en conform de richtlijnen van de Canadese Raad van Dierensorg.
1. Normalisatie van neuronale culturen met behulp van microfluïdische apparaten: Apparaatmontage
- Selecteer een geschikt microfluïdisch apparaat voor het gewenste experiment. Om neuronen in dezelfde populatie te verbinden, gebruik de Neuro Devices ( Figuur 1 ) en verbind neuronen in verschillende populaties met behulp van de Co-Culture Devices ( Figuur 6 ).
- Reinig en berei het gewenste aantal steriele deklagen of glazen bodemschotels op. Voor de beste resultaten op plastic oppervlakken gebruik 35 mm afwas, op glazen gebruik 25 mm dekglazen, of 35 mm glazen bodemschotels. Selecteer de glasdikte op basis van het beeldsysteem, bijvoorbeeld 0,15 mm.
- Bedek de afwas of deklijsten met 0,5-1 ml 100 μg / ml PDL gedurende 2 uur of overnacht bij kamertemperatuurAard.
Opmerking: Protocol kan hier worden onderbroken en indien gewenst hervat de volgende dag. Bovendien kunnen de schalen worden bekleed met boraatbuffer verdunde PDL, Poly-L-Lysine (PLL), laminine of enig ander celadhesiemolecuul. - Was de afwas tweemaal met water (gebruik geen fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), aangezien zoutkristallen de kanalen kunnen blokkeren), verwijder alle vloeistof en laat het drogen in een steriele omgeving, zoals een biosafetykastje gedurende 5-10 minuten of tot Het oppervlak is helemaal droog.
Opmerking: Zorg ervoor dat de deklagen absoluut droog zijn, aangezien elke overblijvende vloeistof de microfluïdische systemen in acht zal nemen. - Plaats microfluïdische apparaten met patronen onder UV-licht in een steriele omgeving (biosafety-kast) gedurende 10 minuten. Zorg ervoor dat u steriele procedures volgen bij het werken in de biosafety-kast 10 .
- Gebruik een pincet met een microfluïdisch apparaat met patroon naar beneden gericht in contact met de schone doekjesip / schotel. Gebruik de pincet om het apparaat zacht te drukken zodat het aan het glas vasthoudt.
Opmerking: De doorzichtigheid van het vastgelegde gebied zal zichtbaar zijn wanneer u naar het licht kijkt. Zorg ervoor dat alle hoeken contact opnemen met het glas. Doe dit aan alle microfluidische apparaten. Zie figuur 1a . - Om het enkele populatie apparaat met medium te vullen, wijs de pipet naar de kanalen en voeg 50 μL compleet celmedium toe dat met serumvrije B-27 (volumeverhouding 1:50) en 500 μg / ml penicilline / streptomycine / glutamine (collectief Genaamd NBM) naar de rechter bovenste put, en voeg nog eens 50 μL toe aan de bril die diagonaal daar ligt. Doe dit voor alle apparaten, zorg ervoor dat het medium tussen de putjes stroomt. Voeg daarna 50 μL medium toe aan de overige 2 putjes. Zie figuur 2a .
- Om het meervoudige populatie apparaat met medium te vullen, wijs de pipet naar de kanalen en voeg 30 μL toeVan de volledige NBM naar de rechter putten, zie figuur 6a . Doe dit voor alle apparaten, zorg ervoor dat het medium tussen de putjes stroomt. Voeg vervolgens 50 μl medium toe aan de overige 4 putjes.
- Plaats de apparaten in een grotere plaat met een open schotel met geautoclaaf water (natte kamer) en plaats gedurende 1-2 uur in de incubator (37 ° C, 5% CO 2 en 95% vochtigheid) tijdens het bereiden van de celcultuur. Zie figuur 2b .
2. Plating Neuronen in Microfluidische Systemen
- Volgend het protocol beschreven in Ref. 8 , ontleende hippocampale of corticale neuronen van Sprague Dawley rat embryo's (ofwel geslacht) verkrijgen.
- Resuspende embryonale neuronen in NBM bij een concentratie van 1-2 miljoen neuronen / ml. Controleer de celconcentraties in de microscoop met behulp van een hemocytometer en de volgende referentie 8 . Pas de celconcentratie overeenG naar de gewenste celdichtheid. Om de kansen te vergroten om enkele hippocampale axonen per kanaal te verkrijgen, plaatst u 10.000 neuronen per apparaat. Om meerdere axonen in hetzelfde kanaal te hebben, plaat 60.000 neuronen per apparaat.
Opmerking: Deze cijfers variëren afhankelijk van het gebruikte neuronale type. - Verwijder het medium uit de microfluïdische toestellen zonder de putjes leeg te maken. Laat ongeveer 5 μL in elk.
- Om cellen in het enkele bevolkingsapparaat te platen, voeg 50 μL NBM aan de rechteronderkant toe. Op dit moment stroomt het medium op zich om de andere onderste put te vullen. Voeg 20 μL van de concentraatceloplossing toe in de rechter bovenkant van de microfluïdische inrichting, zoals aangegeven in figuur 1b .
- Om cellen in het meervoudige populatie-apparaat te platen, voeg 20 μL van de concentraatceloplossing toe in elk van de juiste putten in figuur 6a .
- Controleer in de microscoop als cellenBevinden zich in de kamers en plaats de apparaten in de incubator gedurende 15-30 minuten om celbevestiging aan het substraat te bevorderen.
- Controleer in de microscoop als er genoeg cellen in de kamers zijn. Als meer nodig zijn, herhaal stap 2.4 en 2.5.
- Voeg 50 μL NBM toe aan de 2 topputten van het enkele populatie-apparaat en 20 μL NBM in dezelfde put als de cellen werden geïnjecteerd in het meervoudige populatie-apparaat. De media steken licht uit om een positieve meniscus te vormen waardoor de putjes een muffin top aspect geven. Nogmaals, zie figuur 2a .
- Bewaar de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
3. Onderhoud van de neuronale culturen
- Verwijder NBM (ongeveer 30 μL met een pipet) van de cellen en pas de nieuwe voorverwarmde NBM toe op de dag na de introductie van de apparaten (dat is 1 d na stap 2).
- Controleer elke 2 dagen als er voldoende medium is in elk kanaal. Als de muffin tOp is laag, voeg gewoon meer medium toe aan de bovenste putjes.
- Cultuurcellen voor ten minste 7 d voor verwijdering van de microfluïdische inrichtingen. De cellen kunnen gedurende meerdere weken in deze apparaten overleven. Verwijder de apparaten 1-2 dagen voordat experimenten op monsters worden uitgevoerd.
4. Verwijdering van microfluïdische apparaten
- 1 - 2 d voor het verwijderen van microfluïdische apparaten, voeg 2 ml NBM bij 37 ° C bij elke monsterschotel toe, overstroom de kamers en houd de apparaten in de incubator.
- Gebruik steriele tweezers en een tip om de microfluidische apparaten uit de deklips te verwijderen, waardoor een patroonconfiguratie van neuronen wordt verlaten. Gebruik de tip om de deksel op zijn plaats te houden en de pincet om de rand van het apparaat in de onderste linkerhoek van de put te klampen. Scherp torsie aanbrengen, verhoging van het apparaat met de pincet zodat het de dekglijbaan afschilt. Zie figuur 2c - 2d .
- Elke 2-3 dagen vervang haAls de NBM tot het monster wordt gebruikt voor experimenten.
- Voordat u de rewiring experimenten op het monster uitvoert, controleer dan dat neurieten in de kanalen van het enkele bevolkingsapparaat en de neuronale populaties in het meervoudige populatie-apparaat worden geïsoleerd door de gaten tussen hen in de microscoop te onderzoeken om ervoor te zorgen dat er geen filamenten die neuronale populaties koppelen.
5. Voorbereiding van PDL-gecoate kralen
- Voeg 2 x 50 μL druppels van 4, 10 of 20 μm polystyreen kralen toe, verdund in water (1: 500) tot 1 ml PDL (100 μg / ml). Laat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: Protocol kan hier worden onderbroken en hervat de volgende dag. - Centrifugeer de oplossing bij 8.820 xg gedurende 1 minuut. Verwijder de supernatant zorgvuldig zonder de kralen die op de bodem van de container zijn opgeslagen te storen.
- Was de kralen tweemaal met 1 ml steriele 10 mM HEPES pH 8,4 oplossing.
- Resuspendeer de PDL-gecoate kralen in 200 ml 10 mM HEPES pH 8,4oplossing.
6. Micropipetten voorbereiden
- Bereid pipetten uit glazen capillaire buizen (1 mm binnendiameter, 1,5 mm buitendiameter) met behulp van een horizontale elektrode trekker. Pas de instellingen aan zodat de buitenste punt van de getrokken micropipette ~ 2-5 μm is. Zorg ervoor dat de glazen buizen schoon zijn alvorens te trekken.
- Bevestig pipetten aan glazen glijbanen voor opslag en zorg ervoor dat de punt niet aan het oppervlak van de glijbaan komt, aangezien het uiteinde breekbaar is. Bewaar bij kamertemperatuur in een overdekte container om van stof te beschermen. Gebruik de pipetten dezelfde dag als ze getrokken worden.
7. PDL-kraal Adhesion to Neurons
- Voeg 40-60 μL PDL-beklede kralen toe die bereid zijn in stap 5 tot een celkweek die in stap 4 is bereid. Breng de pipettip over de neuronen, die flauw zichtbaar zijn op de deklaag, en voeg de kralen toe (zie figuur 3 ).
- Keer het monster gedurende 1 uur terug naar de incubator om de vorming van sy te bevorderenNaptische contacten 8 , 9 .
- Na de incubatie, verwijder eventuele niet-gehechte kralen door de cultuur voorzichtig te wassen met vooraf verwarmde NBM.
8. Voorbereiding van de fysiologische zoutoplossing (voor ruimtemperatuur experimenten)
- Bereid fysiologische zoutoplossing op door de ingrediënten die in de verwijzingen 7 , 8 zijn samengevoegd te combineren. Dit is om de celomgeving buiten de incubator te regelen.
- Verifieer osmolariteit en pH niveaus zoals aangegeven in referenties 7 , 8 .
- Continu oplossen met O 2 om de pH-schommelingen te minimaliseren, terwijl u experimenten uitvoert.
- Verhit tot kamertemperatuur.
- Stel het perfusiesysteem in door één uiteinde van een plastic buis (optionele afmetingen) in O2-geïnfundeerde fysiologische oplossing te plaatsen en de andere e te bevestigen.En een naald in de monsterhouder geplaatst. Plaats de buis en de oplossing hoger dan het monster (zie afbeelding 4 ).
- Koppel de buis van de naald los en sluit deze aan op een spuit. Gebruik de spuit om druk uit te oefenen en vloeibaar te maken, de buis te vullen. Zegel met een rolklem en sluit de naald weer aan.
9. Bead Micromanipulation
- Installeer het monster in een experimentele opstelling, zodat bovenstaande cellen via twee micropipetten in micromanipulatoren kunnen worden geopend en optisch onderaan worden geopend, bijvoorbeeld met de 40x-fase-doelstelling (numerieke diafragma van 0,6) van een omgekeerde optische microscoop. Monteer in deze configuratie een CCD-camera voor beeldopname op de zijpoort van de microscoop. Verbind elke pipet met 1 ml spuiten via plastic buis. In deze stap vervangt NBM met fysiologische zoutoplossing (1-2 ml) (zie figuur 4 ).
- Tijdens experiMiddelen, continue perfusiecellen met de fysiologische zoutoplossing bereid in stap 8 met een snelheid van 0,5-1 ml / min.
- Selecteer een PDL-kraal die niet in een oogpunt van een neuron is verbonden. Zet de kraal uit met een micropipetpunt door op de kraal te richten tot op de micropipette. Breng de tip zo dicht mogelijk bij de kraal door het door de microscoop te controleren.
- Breng negatieve druk aan met de 1 ml spuit die op de pipet is aangesloten om de kraal op te halen. Onderhoud negatieve druk gedurende het experiment.
10. Neurieten trekken
- Selecteer een PDL-kraal bevestigd aan een neuron in het gezichtsveld en bevestig het aan de tweede micropipette met behulp van zuigkracht zoals beschreven in stappen 9.3-9.4.
- Trek het PDL-kraal-neuroncomplex langzaam (~ 0,5 μm / min) door ofwel de micromanipulator of de monsterstadium met 1 μm te verplaatsen en pauze gedurende 5 minuten om neurietinitiatie mogelijk te maken.
- Herhaal stap 10.2 tweemaal.
Opmerking: de eerste 3 &# 181; m moet erg langzaam getrokken worden om experimenteel succes te waarborgen, dat meer dan 95% van de tijd voordoet. - Trek het PDL-kraal-neuroncomplex langzaam (~ 0,5 μm / min) door ofwel de micromanipulator of de monstertrap met 2 μm te verplaatsen en pauze gedurende 5 minuten om de verlenging van de neuriet toe te staan.
- Na een succesvolle initiatie en neurietuitbreiding voor de eerste 5 μm trekt u de neuriet bij 20 μm / min over de afstanden van millimeters.
Opmerking: Het trekken kan continu of in stappen en tegen verschillende tarieven worden uitgevoerd. Zie figuur 5b -5c .
11. Neuronen aansluiten
- Selecteer een regio dat rijk is aan neurieten en verlaag het PDL-kraal-neuriet complex zodat het fysiek contact maakt. Gebruik andere kralen om de tiphoogte boven de deklaag te meten. Zie figuur 5d .
- Laat het PDL-kraal-neurietcomplex in contact komen met de doel-neuriet terwijl u de tweede micropi manipuleertPette. Verlaag de tweede pipet met de tweede PDL-kraal bovenop de nieuw gevormde neuriet ongeveer 20 μm van de eerste kraal. Gebruik de tweede PDL-kraal om het nieuwe neurietfilament naar de doelcel te duwen.
- Houd beide kralen op zijn plaats gedurende minstens 1 uur. Controleer de afwezigheid van focale zwelling, een verdikking van de neurieten die de kraal contacteren, met de microscoop 16 .
- Gebruik gedurende deze periode perfusie om het medium van het monster langzaam te veranderen van fysiologische zoutoplossing naar voorverwarmd, CO 2 -qualibrated NBM.
- Laat de kraal los van de tweede pipet door zuigkracht los te maken. Als de nieuwe neuriet vast blijft, laat u ook de eerste kraal los. Zie figuur 5e .
- Verwijder zoutoplossing voorzichtig en vervang met NBM (~ 2 ml).
- Plaats het monster voorzichtig terug in de incubator om de neuronale verbinding voor toekomstige experimenten te versterken. Deze verbinding is stabiel voor> 24 uur 7
12. Verificatie van de functionaliteit van de nieuwe verbinding via de opnamepakketten met volledige celpaarden
- Volg de referenties 7 , 18 , 19 . Een elektrofysiologie opbouwen.
- Volg de referenties 7 . Voorbereiding van de pre- en postsynaptische elektroden.
- Verzamel patchclamp data, opnieuw volgend op referenties 18 , 19 .
- Vergelijk de resultaten met natuurlijk voorkomende signalen 7 om het verbindings type te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hippocampale neuronen van embryonale ratten worden gekweekt in microfluïdische inrichtingen om precieze positionering van cellen, PDL-kralen en micromanipulatoren mogelijk te maken. De eerste stap is om het microfluïdische apparaat op een glazen deksel of op de schaal te monteren. Het is van essentieel belang dat het microfluïdische apparaat goed vastzit aan het substraat om te voorkomen dat cellen de kamers verlaat en onder de delen van het apparaat gaan dat verzegeld moet worden ( Figuur 1a ). Om gedurende meerdere weken gezonde culturen te behouden, is het belangrijk om middelmatige verdamping te voorkomen door het celmedium elke 2-3 dagen te controleren en een positieve meniscus van medium te behouden ( figuur 2a ). Middellange verdamping wordt ook vermeden door zowel de cellen als een open schaal water in een grotere plaat te houden ( figuur 2b ). De microfluïdische apparaten kunnen op elk moment verwijderd worden. Voor optimale resultaten moet NBM aan de cel-de worden toegevoegdVice-systeem tenminste 1 d voor het verwijderen van het apparaat. Dit minimaliseert cellulaire stress, aangezien de neuronen in contact komen met medium bij ideale temperatuur en pH wanneer de apparaten verwijderd worden. Wanneer de microfluïdische apparaten langzaam van de schotel afgeschild worden ( figuur 2c En 2d ) cellen blijven in de patroonpositie ( Figuur 3 en Figuur 5a ).
Er worden twee soorten microfluidische apparaten gebruikt: Neuro Device en Co-Culture Device. De eerste maakt het gemakkelijk mogelijk om axonen, dendrieten en cellichamen te identificeren. De soma blijft in de bovenste soma kamer, terwijl axonen en dendrieten langs de microfluïdische kanalen groeien ( Figuur 5a ) naar de axonale kamer.
Het wordt aanbevolen dat PDL-kralen worden toegevoegd aan cellen in een verhouding van 10: 1 en dat de meeste kralen die haNiet voldaan aan de cultuur worden verwijderd door de cellen eenmaal te wassen met NBM na de 1 u incubatie ( Figuur 3 ). Na aanhechting van de PDL-kraal aan neurieten wordt het PDL-kraal-neurietcomplex getrokken en over grote afstanden verlengd. De nieuw gevormde neuriet kan nauwkeurig verbonden zijn met neurieten of soma millimeter weg ( Figuur 5b -5e ). De succesfrequentie voor het trekken van een nieuwe neuriet voor de eerste 3 μm bij snelheden lager dan 1 μm / min is> 95% (n = 206). De succesfrequentie voor het verbinden van de nieuwe neuriet naar een andere cel is 70% (n = 30). De verbinding is erg broos in de eerste 18 uur, vooral omdat de nieuwe neuriet een filament is met een diameter van minder dan 1 μm verankerd door een 10 μm PDL-kraal. Als de schotel snel wordt bewogen tijdens de eerste minuten van contact, kan de resulterende turbulentie van het medium ervoor zorgen dat de kraal rolt en derhalve de adhesie verloren gaat. Echter, als het monster niet sha isKen, in 30 minuten hecht de kraal aan de neurieten op de schotel en de nieuwe verbinding blijft minstens 48 uur. Zie figuur 4 voor een schematische weergave van de opstelling.
De positie van de PDL-kraal op de cultuur kan ook gebruikt worden om de locatie van de verbonden neuriet gemakkelijk te identificeren ( figuren 6d-6e ). Na initiëring wordt de uitbreiding en de verbinding van een nieuwe neuriet, een tweede, niet-aanhechtende PDL-kraal, opgehaald via de micromanipulator, gebruikt om een tweede hechtingsplaats te creëren tussen de geïnitieerde neuriet en de tweede neuronale populatie. De tweede PDL-kraal wordt bovenop de nieuwe neuriet geplaatst, zodat het nieuwe neuriet alleen de tweede neuronale populatie contacteert 11 . Dit bevordert adhesie met de tweede neuronale populatie ( Figuur 5f ).
Het meerdere populatie apparaat enabLees de groei van 4 geïsoleerde neuronale populaties op dezelfde schotel. Elke neuronale populatie is beperkt tot een 4 x 7 mm rechthoek, gescheiden van andere neuronale populaties met 100 of 200 μm gapingen ( Figuur 6a ). Gezonde neuronen kunnen gedurende enkele weken in de apparaten groeien. Meestal blijven de neuronale populaties tot 48 uur geïsoleerd na verwijdering van het apparaat. Na deze 48 uur periode hebben neuronen de neiging om te groeien naar naburige neuronale populaties en vormen natuurlijke verbindingen. Alvorens twee geïsoleerde populaties te verbinden, moet worden gecontroleerd dat de populaties inderdaad echt geïsoleerd zijn door de gehele kloof met de microscoop te onderzoeken om vast te stellen dat er geen verband bestaat tussen de twee neuronale populaties ( Figuur 6b ).
Na verbinding werden monsters gedurende 24 uur geïncubeerd en werden elektrisch gehele cel-gepaarde patchclamp opnames uitgevoerd om te onderzoeken of de nieuwGevormde neuriet die gebruikt werd om twee geïsoleerde neuronale populaties te verbinden was functioneel en in staat om elektrische signalen over te dragen. Een neuron in populatie één, die minder dan 100 μm radius bevond van de plaats waar de geïnduceerde neuriet werd geïnitieerd, werd geselecteerd om presynaptische actiepotenties (PAP's) op te nemen. Deze neuron werd beschouwd als de presynaptische cel. Postsynaptische excitatoire of remmende activiteit werd geregistreerd van een neuron in populatie twee, aan de andere kant van de kloof, gelegen in minder dan 100 μm straal van de micromanipuleerde verbinding ( Figuur 7a- 7c ). Opnames afgeleid van de mechanisch geïnduceerde verbindingen werden geanalyseerd en vergeleken met die van natuurlijk verbonden neuronale populaties en niet-verbonden populaties ( Figuur 7 ). De elektrische responsen na PAP die zijn opgenomen van neuronen die natuurlijk en door micromanipulatie zijn verbonden, zijn significant hoger en tijdelijk correleren met de presynaptischeActiviteit ( figuur 7 ).
Figuur 1: Normalisatie van neuronale culturen met behulp van microfluïdische apparaten 7 . (A) Apparaatsamenstelling: wanneer de microfluïdische inrichtingen op een droog oppervlak correct zijn gemonteerd, zijn alle kamers zichtbaar. ( B ) Cellplating: plaat de cellen op de rechterbovenkant en cellen moeten naar de linker put verplaatsen. ( C ) Celldichtheid: Controleer na de plating de microscoop als de concentratie van cellen voldoende is. ( D ) Na 1 d in de cultuur worden hippocampale neuronen goed gehecht aan de microkanalen en beginnen neurieten te vormen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken Versie van deze figuur.
Figuur 2 : Onderhoud van gezonde neuronale culturen gedurende een aantal weken 7 . (A) Voeg medium elke 2-3 d toe en houd een positieve meniscus in de bovenste putjes van de microfluidische kamers, zodat cellen een constante voedingskosten hebben. ( B ) Bewaar cellen in een grotere plaat met een schaal dat water bevat om de middelverdamping te verminderen. ( C ) Gebruik steriele punt en pincet om ( d ) de microdevices gemakkelijk af te plakken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
P_upload / 55697 / 55697fig3.jpg "/>
Figuur 3 : Plaatsing van Pipetten Deponeren Kralen in Culturen. Zodra het microfluïdische apparaat is verwijderd, zijn neuronen zichtbaar op de deklaag. Plaats de pipetpunt zodanig dat het in het midden van de cellen ligt wanneer u kralen plaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Schematisch van een typische Neurite-pulling Set-up. Het monster ligt op een (piëzo-geactiveerde) fase en kan vanaf boven worden bereikt door 2 micropipetten in micromanipulatoren en verbonden met 1 ml injectiespuiten via plastic buis. Het monster wordt hiernaast optisch geopend door een objectief verbonden met een CCD-camera die verstuurtS beelden naar een CPU. Een inlaatbuis voedt zuurstofgezette fysiologische zoutoplossing aan het monster, dat er onder ligt en een uitlaatbuis die is verbonden met een spuit, maakt het mogelijk om de oplossing te onttrekken bij overstroming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5 : Adhesie van de PDL-kraal aan neuronen en pipette Micromanipulatie 7 . (A) Neuronen blijven in patronen georganiseerd na verwijdering van microfluïdische kamers waardoor het gemakkelijk is om soma en neurieten te identificeren. ( B ) Micromanipulatie van PDL-kralen die aan neurieten worden gehecht maakt het mogelijk om neurietinitiatie, verlenging ( c ) en verbinding ( d ),Gevolgd door vrijgave van de PDL-kraal uit de pipet ( e ). ( F ) Na het contact met twee geïsoleerde neuronale populaties (onderpijl) wordt een tweede PDL-kraal en pipette micromanipulator (bovenpijl) gebruikt om een tweede hechtingspunt vast te stellen, een paar honderden micron van elkaar uit het eerste contactpunt en garanderen functionele verbindingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6 . Inleiding, verlenging en verbinding van nieuwe neurieten om twee geïsoleerde populaties te verbinden met behulp van meerdere populatieapparatuur en micromanipulatie 7 . (A) Het apparaat isoleert 4 neuronale populatiesTussen 3 gaten van 100 of 200 μm elk. ( B ) Selecteer na afloop van het apparaat een gat en bevestig dat geen neurieten de 2 individuele populaties verbinden. ( C ) Schematisch van de experimentele opstelling zoals zichtbaar in de optische microscoop, geeft de positie van twee micropipetten en de aanwezigheid van PDL-beklede kralen aan. ( D ) Door negatieve druk op een pipet toe te passen wordt een PDL-kraal die aan een neuronale populatie wordt gehecht, getrokken met de pipetpunt, waardoor een nieuwe neuriet wordt geïnitieerd. Door de negatieve druk in de pipet te handhaven, kan het PDL-kraal-neurietcomplex (groen) getrokken worden, waarbij de neuriet verlengd wordt. ( E ) Pipette micromanipulatie begeleidt uitbreiding van de nieuwe neuriet over de kloof en de vorming van een verbinding met een nieuwe neuronale populatie. Om de hechting van de nieuwe neuriet aan de tweede populatie te waarborgen, wordt een PDL-kraal (rood) gepositioneerd met een tweede pipet bovenop zowel neuronale neuriet als neuroNal bevolking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: De nieuw geïnduceerde, verlengde en verbonden Neuriet kan informatie overbrengen tussen twee geïsoleerde neuronale populaties 7 . Geïsoleerde neuronale populaties werden gekweekt gescheiden door een 100 μm kloof in PDMS microdevices. Geparste patchclamp opnames werden uitgevoerd in de volledige celconfiguratie van een neuron in populatie 1 en een neuron in populatie twee (aan de andere kant van de kloof) wanneer de twee populaties door mechanische manipulatie werden verbonden ( a ) Kloof ( b ) of door niet-verbonden blijven door maintAining de kloof ( c ). Representatieve sporen van gepaarde opnames worden getoond voor elke voorwaarde ( df ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van standaard micromanipulatie en innovatieve microfluïdische apparaten werd een nieuwe techniek ontwikkeld om snel nieuwe initiatieven te verlengen, verlengen en precies aansluiten op nieuwe, functionele neuronale circuits over grote afstanden. Pipette micromanipulation is een algemeen instrument in de meeste neurowetenschappen labs 4 , 13 . De echte uitdaging om reproduceerbare en betrouwbare resultaten te behalen, was de standaardisatie van gezonde, nauwkeurig gepositioneerde neuronale culturen voor de duur van het experiment (dat kan in de volgorde van weken zijn) door de ontwikkeling van microfluïdische inrichtingen om celculturen met micrometer precisie te organiseren. Hoge kwaliteit celculturen zijn de hoeksteen van data validatie. Dit draagt bij aan makkelijker en sneller microscopie beeldvorming en standaardisatie van culturen en resultaten. De microfluïdische inrichtingen werden ontworpen om cellen in vitro te cultiveren met een soortgelijke organisatie als in vivo . Het enkele populatie apparaat maakt het mogelijkDe groei van lange neurieten en de eenvoudige identificatie van axonen, neurieten en soma. Het aantal cellen geplateerd in de microfluïdische kamers bepaalt de neuronale dichtheid. Daarom, door minder cellen per apparaat te plakken, is het gemakkelijk om enkele neuronen dicht bij de kanalen te identificeren. De axon en meerdere dendriten van een enkele neuron groeien binnen een kanaal. Dendrieten groeien ten minste 5 keer langzamer dan axonen 6 , 17 en na 2-3 weken in vitro is hun groei in de kanalen gewoonlijk beperkt tot 200 μm, terwijl snelgroeiende axonen meer dan 2 mm 17 kunnen bereiken. Daarom, na het toevoegen van PDL-kralen aan de monsters, is het relatief gemakkelijk om te schatten of de kralen meestal aan axonen of aan axonen en dendrieten hechten ( Figuur 5b - 5f ). Er zijn hogere kansen om nieuwe axonen en dendriten te trekken wanneer de PDL-kralen worden gehecht aan neurieten die korter zijn dan 200 μm, whIle er zijn grotere kansen om alleen nieuwe axonen te trekken bij het aantrekken van PDL-kralen aan neurieten die langer zijn dan 500 μm. Het meervoudige populatie-apparaat is nuttig voor de reproduceerbare groei van gezonde gescheiden populaties gedurende enkele weken. Dit systeem van kanalen is nuttig voor het bestuderen van maximaal 4 verschillende celsoorten of vergelijking van dezelfde cellen met verschillende behandelingen.
Bovendien biedt een gecontroleerde en reproduceerbare celcultuuromgeving een ideaal kader voor celanalyse en manipulatie. Een nauwkeurige positionering van cellen op een schotel vergemakkelijkt de identificatie van regio's van belang, evenals oriëntatie en navigatie door deze gebieden van belang, waardoor uiteindelijk ongekende controle over de neurietinitiatie-site mogelijk wordt. Een gecontroleerde celdistributie maakt het gemakkelijker om de nieuw gevormde verbinding te visualiseren en veel sneller om de nieuwe verbinding met de microscoop te vinden in de dagen na incubatie. Bovendien reproduceerbare configuraties van cellenEenvoudige en nauwkeurige positionering van chemische signalen mogelijk maken, zoals de PDL-gecoate kralen, op de soma, dendrieten of axonen 8 . Gecombineerd, beeldvorming en analyse van cellen gegroeid in microfluïdische apparaten zijn sneller vanwege de standaardcellulaire organisatie die in alle gerechten gereproduceerd wordt. Bovendien zijn de apparaten gemaakt van biologisch verenigbaar, transparant en verwijderbaar materiaal, waardoor beelden gedurende alle weken mogelijk zijn bij alle zichtbare golflengten en celoverleving binnen de apparaten. Miniaturisatie van cellulaire assays helpt ook bij het verzamelen van meer gegevens met minder cellen. Het lage volume verbruik van de microfluidische apparaten vermindert het aantal cellen dat per experiment nodig is en verhoogt de experimentele werkzaamheid. Bijvoorbeeld, in plaats van meerdere uren te zoeken met een microscoop voor misschien 1 of 2 geïsoleerde axonen in een schotel, kan het enkele populatie apparaat worden gebruikt om direct toegang te krijgen tot meer dan 100 geïsoleerde axonen per celmonster. De microfluïdische apparaten bieden een miniaturisatie betrouwbaar en gecontroleerdCelcultuuromgeving die de analyse van zeldzame monsters bevordert met de tijd om meerdere tests uit te voeren.
Potentiële variaties van de techniek omvatten de directe bevestiging van de kraal aan de micropipette. In het huidige protocol wordt een methode beschreven om de kraal aan de punt te bevestigen via zuig, maar de kraal kan ook aan het uiteinde worden gelijmd. Lijm is de betere optie als een zeer stabiele verbinding tussen de punt en de kraal wenselijk is, bijvoorbeeld als er met behulp van de pipet als een sensor wordt gemeten met behulp van de pijp of als het onderzoek van hechting tussen PDL en de neuriet de belangrijkste experimentele doelstelling is. In een andere ader is zuigvorming voordelig omdat het de vrijlating van de kraal na de plaatsing toelaat zonder het neurietkraalcomplex te scheiden, waardoor meerdere verbindingen parallel kunnen worden gemaakt. Suction biedt middelen voor high-throughput rewiring experimenten, een verbetering over andere manipulatie technieken zoals atoomkrachtmicroscopie (AFM) 7 </ Sup> , 16 . Beide modificaties van deze methode laten toe dat de neurietinitiatieplaats wordt geselecteerd door gewoon een kraal in contact te houden met een dendriet, zodat synapsen worden gevormd. De strategie van incubatie van meerdere kralen zoals beschreven in stap 7 bespaart echter tijd in de manipulatietrap en wordt aanbevolen als nauwkeurige controle over de initiatieplaats onnodig in het experiment is.
Toekomstig onderzoek zou kunnen proberen diverse instrumentale beperkingen aan te pakken, namelijk temperatuurregeling en toegankelijkheid van de steekproef. Mechanische eigenschappen van het celmembraan kunnen aanzienlijk variëren bij verschillende temperaturen 27 . Ideaal gezien moeten alle experimenten uitgevoerd worden bij 37 ° C in neuronaal medium en voldoende condities (correcte CO 2 druk- en vochtcontroles). Het was echter niet mogelijk om een gesloten cel incubator te gebruiken, omdat de toegang tot de monsters van de top nodig is voor de micromanipulators, van deBodem voor de microscoop en van de kant om het podium te verplaatsen. Daarom werd perfusie bij kamertemperatuur gebruikt. In een soortgelijke ader, aangezien de opstelling slechts voldoende ruimte heeft om 2 micromanipulators te kunnen installeren en het duurt bijna 1 uur om een enkele verbinding te maken, is er een beperking van het aantal experimenten dat men kan uitvoeren. Dit probleem kan worden aangepakt bij een manipulator die meer dan één kraal tegelijkertijd trekt. Een andere potentiële verbetering van dit protocol is het vermogen om de hoogte van het kralen-pipetecomplex van het monsteroppervlak te registreren. Het onvermogen om dit te doen kan leiden tot onnauwkeurigheden bij het neerlaten van de tweede kraal en het op de geïnduceerde neuriet plaatsen om het te repareren. De kraal wordt verlaagd bovenop de nieuwe neuriet in een neurietrijk gebied tot de nieuwe neuriet en die op de schotel in hetzelfde brandpunt liggen. De nieuwe neuriet is nooit tussen de kraal en de schotel, maar altijd tussen een kussen van celmateriaal en de kraal, daarom wordt de compressie verminderd. Daarnaast,De nieuwe neuriet wordt gedurende 10 minuten in de microscoop waargenomen om te beoordelen of er sprake is van neurale brandpunten dichtbij de kraal. Zoals beschreven in referentie 16 duidt de aanwezigheid van zwellingen neuriet degeneratie aan. Niettemin, aangezien het toepassen van verschillende hoeveelheden druk op axonen kan leiden tot fysiologische veranderingen 16 , zou toekomstig onderzoek kunnen richten op het aanpassen van de pipetprobes door het aanbrengen van reflectoren daarop en het bewaken van verplaatsingen loodrecht op het monsteroppervlak met AFM-methoden. Ten slotte is misschien de grootste uitdaging voor dit protocol de functionaliteit van de gemanipuleerde verbinding te testen. De meest directe, betrouwbare en goed gevestigde techniek is gepaard met volledige celpatch-klemopnamen. Echter, de succesfrequentie van regelmatige gekoppelde patchclamp opname is zeer laag (<25%) 18 . Hele-cel patch klem heeft verscheidene nadelen, waaronder lange opzet tijd, beperkt aantal experimenten / dag, beperkte opnametijd (~ 30Min), lage experimentele opbrengst voor gepaarde patchclamp opnames en celdood na afmetingen. Vanwege deze technische uitdagingen is de experimentele opbrengst van de hele cilinder patchpast gepaarde opnames na micromanipulatie zeer laag. Betere platforms en technieken zijn nodig om neuronale activiteit nauwkeuriger te stimuleren, op te nemen en te vergelijken in natuurlijke en micromanipulatieverbindingen.
Het belang van spanning bij de axonale groei is sinds de vroege dagen van neuroanatomie bekend - er wordt aangeduid als passief rek 20 . Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling migreren de neurieten door kleine afstanden om hun doelen te bereiken. Aangezien de meeste cellen verdelen en dupliceren, worden axonen onderworpen aan continue krachten om hun lengte te verlengen en aanpassen aan embryonale groei 20 , 21 . Verscheidene groepen hebben geprobeerd de grenzen van de neurietgroei te testen door chemische aanwijzingen en / of mechanische spanning toe te passen op neuRons (voor beoordeling zie referentie 22 ). In deze rapporten 23 , 24 , 25 , 26 en tijdens fysiologische groei worden de neurieten getrokken terwijl ze aan een substraat zijn bevestigd. Het grote verschil voor onze opstelling is dat in de huidige techniek de nieuwe neurieten slechts twee hechtingscontacten hebben; Aan de basis is de neuriet aan de neuron bevestigd en bij de punt is de neuriet aan de kraal bevestigd. Tijdens verlenging hebben de componenten van de nieuwe neuriet de vrijheid om op de meest efficiënte wijze te verspreiden om de trekkrachten op te vangen. Belangrijker nog, dit protocol beschrijft hoe deze experimenten kunnen worden voortgebracht zonder neuritische breuk of degeneratie te veroorzaken, op basis van eerdere studies over de vorming van synaptische contacten 8 en op de weerstand van axonen tot druk 16, die aantoont hoe micro- en nanotools worden gebruikt omDraai de neurieten voortdurend met de juiste kracht. De hierna beschreven neurietuitbreidingssnelheden (1,2 mm / h) zijn 30-60 keer sneller dan de in vivo- percentages van de snelst groeiende axonen van het perifere zenuwstelsel (0,02 tot 0,04 mm / u) 28 . In vergelijking met hetzelfde neuronale type in vitro , zijn de axonale verlengingssnelheden die hier beschreven zijn 7,5 keer sneller dan de groeitempo's die door andere auteurs in een vroeger ontwikkelingsstadium (0,1 mm / h) 4 zijn beschreven. Verschillende soorten neuronen zijn gevonden om axonen uit te breiden bij verschillende intrinsieke percentages die variëren met een aantal vouwen 29 . Daarnaast verdwijnen axons van het centrale zenuwstelsel meestal het hoge percentage axonale groei na doelinvernatie in vivo 29 en 3 d van de cultuur in vitro 6 . Daarom moet de huidige axonale verlengingstechniek met verschillende neuronale typen getest worden om het beter te begrijpenE grenzen van neurietuitbreiding.
Pipette micromanipulatie en microfluïdische inrichtingen zijn technieken aangetoond om nieuwe functionele neurieten te creëren en om neuronale netwerken te beheersen of te plaatsen. Dit platform is ideaal voor systematische, gestandaardiseerde metingen. Het introduceert reproduceerbaarheid en in vivo controle in experimenten op complexe netwerken van neuronen. De toegevoerde uitbreidingssnelheden zijn sneller dan 20 μm / min over afstanden van millimeters en functionele verbindingen worden vastgesteld. Deze resultaten tonen onverwacht dat de intrinsieke capaciteit van axonen voor verlenging, inclusief die van hun cytoskeletische componenten, veel sneller is dan voorheen gedacht 10 , 11 , 12 . Deze voorgestelde mechanische aanpak omzeilt langzame chemische strategieën en vormt derhalve een paradigmaverschuiving voor therapeutische ontwikkelingen om neuronale connectiviteit na herstel te herstellenEn voor micro-neuroengineering van kunstmatige neurale netwerken voor hun gecontroleerde studie in vitro . Deze resultaten hebben ook een grote impact op regeneratieve geneeskunde en neuro-engineering benaderingen met directe implicatie voor therapieën die erop gericht zijn neuronale circuits weer te verbinden na trauma of neurodegeneratieve ziekten. Dit platform opent de deur om gegevens over neuroncommunicatie, signaalmodulatie en groei en regeneratie te verkrijgen. Het is een nieuwe manier om het CNS mechanisch te regenereren en vergelijkbare technieken kunnen het herstel van de functie na het letsel mogelijk maken. Bovendien kan deze techniek gebruikt worden om systematisch ontwikkelde neuronale netwerken te ontwikkelen als nieuwe bioassay platforms voor drug ontdekking en target validatie. Het is een voorloper voor de directe bedrading van robuuste hersenmachine interfaces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur Margaret H Magdesian is de CEO van Ananda Devices die instrumenten produceert die in dit artikel worden gebruikt.
Acknowledgments
We willen Yoichi Miyahara bedanken voor veel nuttige discussies en inzichten. MA en PG erkennen financiering van NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200 μ L Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2 - 20 μL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 μm | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 mL Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
- Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
- Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
- Strober, W.
- Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
- Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
- Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
- Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
- Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E.
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
- Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. , Oxford University Press, USA. (1995).
- Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
- Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).
