Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d'ovocytes
Summary
La micro-injection d'ovocytes de souris est couramment utilisée à la fois pour la transgénèse classique ( c.-à-d. L'intégration aléatoire des transgènes) et le ciblage des gènes médié par CRISPR. Ce protocole examine les derniers développements en micro-injection, avec un accent particulier sur le contrôle de la qualité et les stratégies de génotypage.
Abstract
L'utilisation de souris génétiquement modifiées a contribué de manière significative aux études sur les processus physiologiques et pathologiques in vivo . L'injection pronucléaire des constructions d'expression d'ADN dans les ovocytes fécondés reste la technique la plus couramment utilisée pour générer des souris transgéniques pour une surexpression. Avec l'introduction de la technologie CRISPR pour le ciblage des gènes, l'injection pronucléaire dans les ovocytes fécondés a été étendue à la génération de souris knock-out et knockin. Ce travail décrit la préparation de l'ADN pour l'injection et la génération de guides CRISPR pour le ciblage des gènes, en mettant l'accent sur le contrôle de la qualité. Les procédures de génotypage nécessaires à l'identification des fondateurs potentiels sont essentielles. Des stratégies novatrices de génotypage qui profitent des capacités de "multiplexage" de CRISPR sont présentées ici. Les procédures chirurgicales sont également décrites. Ensemble, les étapes du protocole permettront la génération de genDes souris modifiées de manière sélective et pour l'établissement ultérieur de colonies de souris pour une pléthore de domaines de recherche, y compris l'immunologie, les neurosciences, le cancer, la physiologie, le développement et d'autres.
Introduction
Les modèles animaux, chez les vertébrés et les invertébrés, ont contribué à l'examen de la pathophysiologie des affections humaines telles que la maladie d'Alzheimer 1 , 2 . Ils sont également des outils précieux pour rechercher des modificateurs de maladies et pour finalement développer de nouvelles stratégies de traitement dans l'espoir d'un remède. Bien que chaque modèle ait des limites intrinsèques, l'utilisation des animaux comme modèles systémiques complets est essentielle à la recherche biomédicale. C'est parce que l'environnement physiologique métabolique et complexe ne peut pas être entièrement simulé dans la culture tissulaire.
À ce jour, la souris reste l'espèce de mammifère la plus commune utilisée pour la manipulation génétique car elle présente plusieurs avantages. Les processus physiologiques et les gènes associés aux maladies sont fortement conservés chez les souris et les humains. La souris a été le premier mammifère à avoir son génome complet séquencé (2002), un an avant le génome humainMoi (2003). Outre cette richesse de l'information génétique, la souris possède de bonnes capacités d'élevage, un cycle de développement rapide (6 semaines après la fertilisation jusqu'au sevrage) et une taille raisonnable. Tous ces avantages, couplés à des indicateurs physiologiques, tels que des couleurs de revêtement distinctes (requis pour les stratégies de croisement), ont fait de la souris un modèle attrayant pour la manipulation génétique. Notamment, au début de la génétique moderne, Gregor Mendel a commencé à travailler sur des souris avant de passer à des plantes 3 .
Les techniques de transfert de gènes ont entraîné la génération de la première souris transgénique il y a trois décennies 4 , initialement créée à l'aide de l'administration virale. Cependant, les chercheurs ont rapidement compris que l'un des principaux défis de la transgénèse de la souris était l'incapacité de contrôler le devenir de l'ADN exogène. Parce que l'administration virale de transgènes dans des ovocytes de souris a abouti à des copies multiples intégrées au hasard dans le génome, la possibilitéY d'établir des lignes transgéniques ultérieures était limité.
Une telle limitation a été surmontée lorsque Gordon et al. A généré la première ligne de souris transgénique par microinjection 5 , 6 . Cela a commencé l'ère de la technologie de l'ADN recombinant, et les paramètres influençant le résultat d'une session de micro-injection ont été largement étudiés 7 . Bien que la micro-injection ne permette pas le contrôle sur le site d'intégration du transgène (qui aboutit finalement à des niveaux d'expression spécifiques pour chaque souris fondatrice), l'avantage principal de la microinjection pronucléaire reste la formation de concatemers ( c.-à-d. Des tableaux de multiples copies du transgène, Liés en série) avant intégration génomique 5 . Cette caractéristique a été utilisée au cours des années pour établir des milliers de lignes de souris transgéniques qui surexpriment un gène d'intérêt. Depuis lors, la transgénèse, la aModification artificielle du génome d'un organisme, a été largement utilisée pour identifier le rôle des gènes simples dans l'apparition de maladies.
Une autre réalisation clé dans la manipulation du génome de la souris a été atteinte lorsque Mario Capecchi a perturbé avec succès un seul gène à la souris, ouvrant l'ère du ciblage des gènes 8 . Cependant, des inconvénients majeurs ont rapidement émergé du ciblage génétique basé sur les cellules ES, y compris les défis de la culture des cellules ES, le degré de chimérisme quelque peu variable et la durée du processus ( c'est-à-dire 12-18 mois minimum pour obtenir la souris) .
Récemment, les progrès dans les nouvelles technologies, telles que les endonucléases modifiées ( p. Ex., Les nucléases de doigts de zinc (ZFN), les nucléases effectrices de l'activateur de la transcription (TALEN) et les répétitions palindromiques courtes (CRISPR / Cas9) classées régulièrement sont apparues comme des méthodes alternatives Accélérer le processus de ciblage des gènes dans le microE 9 , 10 . Ces endonucléases peuvent être facilement injectées dans des ovocytes de souris par micro-injection, ce qui permet de générer des souris ciblées par gène en 6 semaines seulement.
Depuis le premier rapport sur l'utilisation de CRISPR pour l'édition génomique 11 , ce système immunitaire adaptatif bactérien a remplacé ZFN et TALEN en raison de ses nombreux avantages, y compris la facilité de la synthèse et la capacité de cibler de multiples loci à la fois (appelés "multiplexage" "). Le CRISPR a d'abord été utilisé pour le ciblage des gènes chez la souris 12 et a depuis été appliqué à d'innombrables espèces, des plantes aux humains 13 , 14 . À ce jour, aucun rapport d'une seule espèce n'est résistant à l'édition du génome CRISPR.
Les deux principales étapes limitantes de la génération de souris transgéniques sont l'injection d'ovocytes et la réimplantationDe ces ovocytes chez des femelles pseudo-grossières. Bien que cette technique ait été décrite par nous 15 et d'autres 16 , des améliorations techniques récentes dans l'embryologie de souris et les techniques de transfert de gènes ont révolutionné le processus de génération de souris génétiquement modifiées. Ces améliorations seront décrites ici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etapes critiques dans le protocole
On sait que la génération de souris génétiquement modifiées présente un défi technique. Cependant, le protocole présenté ici est une méthode optimisée et simplifiée qui permet de maîtriser et de dépanner la technique en un temps record. Il faut deux étapes pour réussir la technique. Tout d'abord, la synthèse de modèles d'ADN linéaires (pour la synthèse des sgRNA) peut être obtenue sans chlorure de magnésium (MgCl 2 ). C…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le personnel de l'établissement animal (BRC) pour leur soutien continu. Ce travail a été financé par le National Health and Medical Research Council et le Australian Research Council.
Materials
| Micropipette 0.1-2.5 ul | Eppendorf | 4920000016 | |
| Micropipette 2-20 ul | Eppendorf | 4920000040 | |
| Micropipette 20-200 ul | Eppendorf | 4920000067 | |
| Micropipette 100-1000 ul | Eppendorf | 4920000083 | |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1kb |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x – Dilute to 1x |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| PCR purification kit (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| Vacuum system (Manifold) | Promega | A7231 | |
| Nuclease-free microinjection buffer | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC microcentrifuge filter | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR expressing plasmid (px330) | Addgene | 42230 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA purification spin columns (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| Donor plasmid | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa embryo culture medium | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| Mineral oil | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Mouthpiece | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Glass microcapillaries | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Proteinase K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Vessel clamp | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| Wound clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Clips applier | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 incubator | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| Electrophoresis set up | BioRad | 1640300 | |
| UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| 2x Micromanipulators | Eppendorf | 5188000.012 | |
| Oocytes manipulator | Eppendorf | 5176000.025 | |
| Microinjector (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| Mice C57BL/6J strain | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
Referências
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