Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi
Summary
Fare oositlerinin mikroenjeksiyonu hem klasik transgenezis ( yani, transgenlerin rastgele bütünleşmesi) hem de CRISPR aracılı gen hedeflemesi için yaygın olarak kullanılır. Bu protokol, kalite kontrolü ve genotiplendirme stratejileri üzerinde özel bir vurguyla mikroenjeksiyondaki en son gelişmeleri gözden geçiriyor.
Abstract
Genetik olarak modifiye edilmiş farelerin kullanımı hem fizyolojik hem de patolojik in vivo süreçler üzerinde çalışmalara önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. DNA ekspresyon yapılarının fare devirde döllenen oositlere enjekte edilmesi, aşırı ekspresyon için transgenik fareler üretmek için en sık kullanılan teknik olarak kalır. Gen hedeflemesi için CRISPR teknolojisinin kullanıma girmesiyle, döllenmiş oositlere pronükleer enjeksiyon, hem nakavt hem de knockin farelerinin nesline kadar genişletildi. Bu çalışma, enjeksiyon için DNA'nın hazırlanmasını ve gen kontrolü için özel bir vurguyla gen hedeflemesi için CRISPR kılavuzlarının oluşturulmasını açıklamaktadır. Potansiyel kurucuların tespiti için gerekli genotiplendirme prosedürleri kritik öneme sahiptir. CRISPR'nin "çoğullama" yeteneklerinden yararlanan yenilikçi genotipleme stratejileri burada sunulmuştur. Cerrahi işlemler de özetlenmektedir. Birlikte, protokolün aşamaları genin üretilmesini sağlayacaktırImmünoloji, nörobilim, kanser, fizyoloji, gelişim ve diğerleri dahil olmak üzere bir çok araştırma alanı için fare kolonilerinin kurulması için kullanılmıştır.
Introduction
Omurgalılarda ve omurgasız hayvanlarda hayvan modelleri, Alzheimer hastalığı 1 , 2 gibi insan koşullarının patofizyolojisini incelemek için bir araç olmuştur. Ayrıca, hastalık düzenleyicileri aramak ve sonuçta tedaviyi umut ederek yeni tedavi stratejileri geliştirmek için paha biçilemez araçlar. Her model özünde sınırlamalara sahip olsa da, hayvanların tüm sistemik modeller olarak kullanılması, biyomedikal araştırmalar için hayati öneme sahiptir. Bunun nedeni, metabolik ve kompleks fizyolojik ortamın doku kültüründe tamamen simüle edilememesi.
Bugüne kadar, fare birçok avantaja sahip olduğu için genetik manipülasyon için kullanılan en yaygın memeli türüdür. Hastalıklarla ilişkili fizyolojik süreçler ve genler, fareler ve insanlar arasında oldukça korunmaktadır. Fare, insan genosundan bir yıl önce, tam genom dizilimine sahip ilk memeliydi (2002)Ben (2003). Bu genetik bilginin yanı sıra, fare iyi yetiştirme kapasitelerine, hızlı gelişme döngüsüne (fertilizasyondan sütten kesilmeye kadar 6 hafta) ve makul bir boyuta sahiptir. Bütün bu avantajlar, farklı kat renkleri (geçiş stratejileri için gerekli) gibi fizyolojik göstergelerle birleştiğinde fare, genetik manipülasyon için çekici bir model yaptı. Özellikle, modern genetikte çok erken yaşlarda, Gregor Mendel, bitkilere gitmeden önce farelerde çalışmaya başladı 3 .
Gen transferi teknikleri başlangıçta viral doğum kullanılarak yaratılan, ilk otuz yıl önce ilk transjenik fare oluşumuyla sonuçlandı. Bununla birlikte, araştırmacılar kısa sürede, fare transgenezinin ana zorluklarından birinin, eksojen DNA'nın kaderini kontrol edemediğini fark etti. Transgenlerin fare oositlerine viral olarak verilmesi, birden fazla kopyanın genom içine rasgele entegre edilmesine neden olduğundan, olasılıklarDaha sonraki transgenik hatların kurulması sınırlıydı.
Böyle bir kısıtlamaya Gordon ve ark. Ilk transjenik fare hattını mikroenjeksiyon 5 , 6 ile üretti. Bu, rekombinant DNA teknolojisi çağına başladı ve bir mikroenjeksiyon oturumunun sonucunu etkileyen parametreler çokça incelendi. Mikroenjeksiyon, transgenin entegrasyon bölgesinin (sonuçta her bir kurucu fare için spesifik ekspresyon seviyeleri ile sonuçlanır) kontrol edilmesini sağlamasa da, pronükleer mikroenjeksiyonun ana avantajı, konkatemlerin oluşumunda kalmaktadır ( yani, transgenin çoklu kopyalarının dizileri, Seri bağlı) genomik integrasyon öncesi 5 . Bu özellik, ilgilenilen bir geni aşırı ifade eden binlerce transgenik fare hattı kurmak için yıllarca kullanılmıştır. O zamandan beri, transgenesis, birBir organizmanın genomunun doğal tadilatı, hastalıkların ortaya çıkmasında tekli genlerin rolünü tanımlamak için yaygın bir şekilde kullanılmıştır.
Fare genomunun manipüle edilmesinde bir diğer önemli başarı, Mario Capecchi'nin, fare üzerindeki tek bir geni başarıyla bozmasıyla, hedeflenen 8 gen hedefinin açılışında ulaşıldı. Bununla birlikte, büyük dezavantajlar, ES hücrelerinin kültürlenmesindeki zorluklar, biraz değişen kimeriklik derecesi ve sürecin uzunluğu (fare elde etmek için en az 12-18 ay, asgari olarak) dahil olmak üzere ES hücre temelli gen hedeflemesinden hızla çıkmıştır. .
Son zamanlarda, mühendislik endonükleazları ( örneğin, çinko parmak nükleazları (ZFN), transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazları (TALEN) ve düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR / Cas9) gibi yeni teknolojilerdeki ilerlemeler) alternatif yöntemler olarak ortaya çıkmıştır Mikrofonda gen hedefleme sürecini hızlandırmakE 9 , 10 . Bu endonükleazlar, 6 hafta gibi kısa bir sürede gen hedefli farelerin üretilmesine olanak tanıyan, mikroenjeksiyon yoluyla fare oositlerine kolayca enjekte edilebilir.
Genom düzenleme 11 için CRISPR kullanımıyla ilgili ilk rapordan bu yana, bu bakteriyel adaptif bağışıklık sistemi, sentez kolaylığı ve bir defada birden fazla lokus hedefleme yeteneği de dahil olmak üzere birçok avantajı nedeniyle ZFN ve TALEN'in yerini almıştır ("çoğullama" "). CRISPR ilk farelerde 12 gen hedeflemesi için kullanılmıştır ve o zamandan beri bitkilerden insanlara 13 , 14'e kadar sayısız türün uygulanmıştır. Bugüne kadar, CRISPR genomu düzenine dirençli tek bir türe ilişkin rapor bulunmamaktadır.
Transjenik farelerin üretiminin iki temel sınırlayıcı aşaması oositlerin enjeksiyonu ve reimplantasyonBu oositlerden psödo-gebe kadınlara dönüşür. Bu teknik bizim 15 ve diğerleri16 tarafından tarif edilmesine rağmen, fare embriyolojisinde ve gen transfer tekniklerinde son zamanlardaki teknik gelişmeler, genetiği değiştirilmiş fareler üretme sürecinde devrim yaratmıştır. Bu iyileştirmeler burada açıklanacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol dahilinde kritik adımlar
Genetiği değiştirilmiş farelerin üretimi teknik açıdan zorlayıcı olarak bilinir. Bununla birlikte, burada sunulan protokol tekniğin rekor düzeyde hakim olmasına ve gidermesine olanak tanıyan optimize edilmiş ve basitleştirilmiş bir yöntemdir. Tekniğin başarılı bir şekilde tamamlanması için iki adım vardır. Birincisi, lineer DNA şablonlarının sentezi (sgRNA'ların sentezi için) magnezyum klorid (MgCl2) olmadan başarılabilir. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, devam eden destekleri için hayvan tesisi personeline (BRC) teşekkür ederler. Bu çalışma Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi ve Avustralya Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi.
Materials
| Micropipette 0.1-2.5 ul | Eppendorf | 4920000016 | |
| Micropipette 2-20 ul | Eppendorf | 4920000040 | |
| Micropipette 20-200 ul | Eppendorf | 4920000067 | |
| Micropipette 100-1000 ul | Eppendorf | 4920000083 | |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1kb |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x – Dilute to 1x |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| PCR purification kit (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| Vacuum system (Manifold) | Promega | A7231 | |
| Nuclease-free microinjection buffer | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC microcentrifuge filter | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR expressing plasmid (px330) | Addgene | 42230 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA purification spin columns (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| Donor plasmid | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa embryo culture medium | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| Mineral oil | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Mouthpiece | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Glass microcapillaries | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Proteinase K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Vessel clamp | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| Wound clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Clips applier | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 incubator | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| Electrophoresis set up | BioRad | 1640300 | |
| UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| 2x Micromanipulators | Eppendorf | 5188000.012 | |
| Oocytes manipulator | Eppendorf | 5176000.025 | |
| Microinjector (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| Mice C57BL/6J strain | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
Referências
- Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer’s disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
- Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer’s mice. Science. 354 (6314), 904-908 (2016).
- Marantz Henig, R. . The Monk in the Garden. , (2000).
- Jaenisch, R., Mintz, B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).
- Carbery, I. D. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genética. 186 (2), 451-459 (2010).
- Sung, Y. H. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).
- Jinek, M. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wang, H. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kang, X. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).
- Liang, P. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).
- Ittner, L. M., Götz, J. Pronuclear injection for the production of transgenic mice. Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- . Resuspension Calculator Available from: https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/ (2017)
- Auerbach, A. B. Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production. Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).
- Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months. Biol Reprod. 86 (2), 49 (2012).
- Nakagawa, Y., et al. Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice. Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).
- Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 29 (17), E88 (2001).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nat Commun. 7, 10431 (2016).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. , (2016).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Liu, X., et al. A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling. J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).
- Ke, Y. D. Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS. Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).
- Auerbach, A. B. Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection. Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Zhou, Y. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum. Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).
- Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection. Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).
- Biggers, J. D., Summers, M. C. Choosing a culture medium: making informed choices. Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).
- Nakagata, N. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).
- Truett, G. E. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
- Delerue, F., Ittner, L. M. Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects. Clon. Transgen. 4, (2015).
