Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos
Summary
A microinjecção de oócitos de rato é comumente utilizada tanto para a transgênese clássica ( ou seja, a integração aleatória de transgenes) e a segmentação de genes mediada por CRISPR. Este protocolo analisa os últimos desenvolvimentos em microinjeção, com ênfase particular no controle de qualidade e estratégias de genotipagem.
Abstract
O uso de camundongos geneticamente modificados tem contribuído significativamente para estudos em processos fisiológicos e patológicos in vivo . A injeção pronuclear de construções de expressão de DNA em oócitos fertilizados continua a ser a técnica mais utilizada para gerar camundongos transgênicos para superexpressão. Com a introdução da tecnologia CRISPR para segmentação gênica, a injeção pronuclear em oócitos fertilizados foi estendida à geração de camundongos knockout e knockin. Este trabalho descreve a preparação de DNA para injeção e a geração de guias CRISPR para segmentação gênica, com especial ênfase no controle de qualidade. Os procedimentos de genotipagem necessários para a identificação de potenciais fundadores são críticos. Estratégias inovadoras de genotipagem que aproveitam as capacidades de "multiplexação" do CRISPR são aqui apresentadas. Os procedimentos cirúrgicos também são delineados. Juntos, as etapas do protocolo permitirão a geração de genCamundongos eticamente modificados e para o estabelecimento subseqüente de colônias de ratos para uma infinidade de campos de pesquisa, incluindo imunologia, neurociência, câncer, fisiologia, desenvolvimento e outros.
Introduction
Os modelos animais, tanto em vertebrados quanto em invertebrados, têm sido fundamentais para examinar a fisiopatologia das condições humanas, como a doença de Alzheimer 1 , 2 . Eles também são ferramentas inestimáveis para procurar modificadores de doenças e, em última instância, desenvolver novas estratégias de tratamento na esperança de uma cura. Embora cada modelo tenha limitações intrínsecas, o uso de animais como modelos sistêmicos inteiros é vital para a pesquisa biomédica. Isso ocorre porque o ambiente fisiológico metabólico e complexo não pode ser totalmente simulado na cultura de tecidos.
Até à data, o rato continua a ser a espécie de mamífero mais comum usada para manipulação genética porque apresenta várias vantagens. Os processos fisiológicos e os genes associados a doenças são altamente conservados entre camundongos e seres humanos. O mouse foi o primeiro mamífero a ter seu genoma completo seqüenciado (2002), um ano antes do geno humanoEu (2003). Além dessa riqueza de informações genéticas, o mouse possui boas capacidades de criação, um ciclo de desenvolvimento rápido (6 semanas desde a fertilização até o desmame) e um tamanho razoável. Todas essas vantagens, juntamente com indicadores fisiológicos, como cores de revestimento distintas (necessárias para estratégias de cruzamento), fizeram do mouse um modelo atraente para manipulação genética. Notavelmente, na era mais precoce da genética moderna, Gregor Mendel começou a trabalhar em camundongos antes de se mudar para as plantas 3 .
As técnicas de transferência de genes resultaram na geração do primeiro rato transgênico há mais de três décadas 4 , inicialmente criado usando a entrega viral. No entanto, os pesquisadores logo perceberam que um dos principais desafios da transgênese do mouse era a incapacidade de controlar o destino do DNA exógeno. Como a distribuição viral de transgenes em oócitos de ratos resultou em cópias múltiplas integradas aleatoriamente no genoma, o possibilitO estabelecimento de linhas transgênicas subsequentes foi limitado.
Uma dessas limitações foi superada quando Gordon et al. Gerou a primeira linha de mouse transgênica por microinjeção 5 , 6 . Isso começou a era da tecnologia de DNA recombinante, e os parâmetros que influenciam o resultado de uma sessão de microinjeção foram amplamente estudados 7 . Embora a microinjeção não permita o controle sobre o site de integração do transgene (que eventualmente resulta em níveis de expressão específicos para cada mouse fundador), a principal vantagem da microinjeção pronuclear continua sendo a formação de concatemers ( ou seja, matrizes de múltiplas cópias do transgene, Ligado em série) antes da integração genômica 5 . Esta característica tem sido utilizada ao longo dos anos para estabelecer milhares de linhas de mouse transgênicas que sobre-expressam um gene de interesse. Desde então, a transgênese, aModificação artificial do genoma de um organismo, tem sido amplamente utilizada para identificar o papel de genes únicos na ocorrência de doenças.
Uma outra conquista chave na manipulação do genoma do mouse foi alcançada quando o Mario Capecchi interrompeu com sucesso um único gene no mouse, abrindo a era da segmentação gênica 8 . No entanto, as principais desvantagens emergiram rapidamente da segmentação por células baseadas em células ES, incluindo os desafios de cultivar células ES, o grau de quimerismo um tanto variável e o comprimento do processo ( ou seja, 12-18 meses, mínimo, para obter o mouse) .
Recentemente, os avanços nas novas tecnologias, tais como endonucleases de engenharia ( por exemplo, nucleases de zinco (ZFN), efetoras nucleas efectoras de transcrição (TALEN), e repetições palindrômicas curtas (CRISPR / Cas9) agrupadas regularmente foram emergentes como métodos alternativos para Acelerar o processo de segmentação de genes no microfoneE 9 , 10 . Estas endonucleases podem ser facilmente injetadas em oócitos de ratinho por microinjeção, permitindo a geração de camundongos alvo de genes em apenas 6 semanas.
Desde o primeiro relatório sobre o uso do CRISPR para a edição do genoma 11 , este sistema imunológico adaptativo bacteriano substituiu ZFN e TALEN por suas muitas vantagens, incluindo a facilidade de síntese e a capacidade de segmentar múltiplos loci de uma vez (referido como "multiplexação "). O CRISPR foi utilizado pela primeira vez para segmentação gênica em camundongos 12 e desde então foi aplicado a inúmeras espécies, de plantas a seres humanos 13 , 14 . Até à data, não há relatório de uma única espécie resistente à edição do genoma CRISPR.
Os dois principais passos limitantes da geração de camundongos transgênicos são a injeção de oócitos eo reimplanteDesses oócitos em fêmeas pseudo-grávidas. Embora esta técnica tenha sido descrita por nós 15 e outros 16 , as melhorias técnicas recentes em embriologia de ratos e técnicas de transferência de genes revolucionaram o processo de geração de camundongos geneticamente modificados. Essas melhorias serão descritas aqui.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passos críticos dentro do protocolo
A geração de camundongos geneticamente modificados é conhecida por ser tecnicamente desafiadora. No entanto, o protocolo apresentado aqui é um método otimizado e simplificado que permite dominar e solucionar a técnica em tempo recorde. Há duas etapas necessárias para a conclusão bem-sucedida da técnica. Primeiro, a síntese de modelos de DNA linear (para a síntese de sgRNAs) pode ser conseguida sem cloreto de magnésio (MgCl2). No entanto, é alta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a equipe da instalação animal (BRC) por seu apoio contínuo. Este trabalho foi financiado pelo National Health and Medical Research Council e pelo Australian Research Council.
Materials
| Micropipette 0.1-2.5 ul | Eppendorf | 4920000016 | |
| Micropipette 2-20 ul | Eppendorf | 4920000040 | |
| Micropipette 20-200 ul | Eppendorf | 4920000067 | |
| Micropipette 100-1000 ul | Eppendorf | 4920000083 | |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1kb |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x – Dilute to 1x |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| PCR purification kit (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| Vacuum system (Manifold) | Promega | A7231 | |
| Nuclease-free microinjection buffer | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC microcentrifuge filter | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR expressing plasmid (px330) | Addgene | 42230 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA purification spin columns (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| Donor plasmid | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa embryo culture medium | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| Mineral oil | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Mouthpiece | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Glass microcapillaries | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Proteinase K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Vessel clamp | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| Wound clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Clips applier | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 incubator | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| Electrophoresis set up | BioRad | 1640300 | |
| UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| 2x Micromanipulators | Eppendorf | 5188000.012 | |
| Oocytes manipulator | Eppendorf | 5176000.025 | |
| Microinjector (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| Mice C57BL/6J strain | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
Referências
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