Summary
Vasküler endotel sıkıca lökosit işe alım denetler. Yetersiz lökosit ekstravazasyonu insan inflamatuar hastalıklar için katkıda bulunur. Bu nedenle, roman yasal unsurları endotel harekete geçirmek için arama enflamatuar bozuklukları için geliştirilmiş terapiler tasarlamak gereklidir. Burada, lökosit enflamasyon sırasında kaçakçılığı değiştirebilirsiniz roman endotel düzenleyiciler ayırdetmek için kapsamlı bir metodoloji açıklayın.
Abstract
Endotel tabakası, birçok farklı fonksiyonları kontrol ederek vücuttaki homeostazı korumak için önemlidir. İnflamatuvar yanıtta endotel tabakası tarafından düzenlenmesi verimli bir şekilde zararlı girişleri karşı mücadele ve hasarlı bölgeleri kurtarma yardım çok önemlidir. Endotel hücreleri gibi gram-negatif bakteri membran, lipopolysaccharide (LPS), dış bileşen inflamatuar bir ortam maruz kaldığı zaman hızlı Ccl5, Cxcl1 ve Cxcl10, gibi çözünebilir pro-inflamatuar sitokinlerin ve tetik lökosit dolaşan harekete geçirmek. Buna ek olarak, ifade adezyon moleküllerinin E-selektin, VCAM-1 ve ICAM-1 endotel yüzeyindeki etkileşim ve endotel tabakası ve sonunda ekstravazasyonu iltihaplı doku doğru harekete geçirmek lökosit yapışma sağlar. Lökosit işe aşırı veya kusurlu harekete geçirmek ilgili enflamatuar bozuklukları için açabilir, çünkü bu senaryoya göre endotel fonksiyonları sıkı bir şekilde düzenlenmiş olması gerekir. Bu yana birçok Bu bozuklukların etkili bir tedavi yok, vasküler katman odaklı bir roman stratejileri araştırılmalı. Lökosit işlevini değiştirin roman endotel düzenleyiciler arama için yararlı olan kapsamlı deneyleri öneriyorum. Biz de dahil olmak üzere çeşitli teknikler ile belirli ifade düşman hedefi lökosit işe alım (örneğin, sitokinler, kemokinler ve adezyon molekülleri) kullanarak endotel aktivasyon analiz: gerçek zamanlı nicel Polimeraz zincir reaksiyonu () RT-qPCR), western-blot, Akış Sitometresi ve yapışma deneyleri. Bu yaklaşımlar endotel fonksiyonları inflamatuar bağlamında belirlemek ve yeni tedavi edici stratejiler tasarlamak için potansiyel olarak değerli roman endotel inflamatuar düzenleyiciler karakterize etmek için tarama testleri gerçekleştirmek çok yararlıdır.
Introduction
İltihabı bulaşıcı ajanlarla patojen ortadan kaldırmak ve hasarlı doku onarımı için büyük amacı karşı faydalı bir biyolojik yanıttır. Kronik enfeksiyonlar veya otoimmün hastalıklar, gibi belirli koşullar altında iltihap gidermez. Bunun yerine, sürekli bir uzun süreli bağışıklık giden doku hasarı, fibrozis, işlev ve genel kayıp, Engellilik ve bazı durumlarda ölüm hastanın tepkisine yol lökosit infiltrasyonu ile anormal bir reaksiyonu vardır. İnflamatuar hastalıklar olarak kataloğa insan bu bozuklukların tümü lökosit ekstravazasyonu1,2kontrolü için kan damarlarının ilgilidir.
Endotel hücreleri lökosit kaçakçılığı kontrol ederek inflamatuar yanıt yönetmelikte temel bir rol oynar. Endotel tabakası LPS gibi inflamatuar aracılar için maruz kaldığında, istirahat endotel etkinleştirir ve pro-inflamatuar sitokinlerin (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, vb) ve adezyon molekülleri (E-selektin, VCAM-1 ve ICAM-1) ifade bu iyilik lökosit enfeksiyon sitesine dolaşan işe alım. Tarafından yayımlanan sitokinler sonra astarlanmalıdır lökosit haddeleme ve muhabir yapışkanlı meslektaşları ile endotel tabakası ile etkileşimi aracılık: PSGL-1 selektin, α4β1 integrin VCAM-1 ve αLβ2 integrin ICAM-1. Son olarak, lökosit damarlara doğru odağı iltihap3arasında göç eder.
Endotel inflamatuar yanıt düzenlenmesinde önemli rol LPS reseptör, toll benzeri reseptör 4 (TLR4), endotel hücreleri üzerinde sadece hızlı için genetik olarak değiştirilmiş fareler üzerinde gösterilmiştir. Bu TLR4 endotel hayvanlar yanıt vermek bir LPS-aracılı inflamasyon ve enfeksiyon bakteri aşılama sonra oluşturulan tespit ve sonuç olarak enfeksiyon çözünürlük ve vahşi tip fareler4 olarak benzer düzeyde hayatta elde başardık , 5.
İnflamatuar yanıt endotel düzenlenmiştir pathway için lökosit-endotel etkileşim bazı aşamalarında inhibisyonu trans-endotel geçiş ve için daha iyi bir prognoz azaltılması neden olacağından bu öne inflamatuar bağlı hastalıklar. Aslında, çeşitli stratejiler endotel harekete geçirmek ve lökosit-endotel etkileşim hedefleme enflamatuar bozuklukları6,7için bir tedavi olarak bağışıklık hücre ekstravazasyonu engellemek için tasarlanmıştır.
Bu raporu, vitro teknikleri tam olarak karakterize enflamatuar uyarıcı LPS karşılık olarak endotel aktivite ve lökosit harekete geçirmek ve yapışma vasküler katmana rolü için kapsamlı bir grup açıklamak. Bu el yazması kullanılan endotel hücre model fare akciğer endotel hücre satırı (MLEC-04), Hortelano ve ark. tarafından açıklandığı gibi oldu 8. MLEC-04 hücre kültürünü endotel harekete geçirmek9,10çalışmaya uygun bir sistem olarak literatürde doğrulanmış. Araştırma çıkarlara dayanan, bu yaklaşımların kolayca herhangi bir endotel yaygınlaştırılması veya lökosit sistemleri ve inflamatuar profil. Seçilen koşullar endotel parametrelerinde tanımladıktan sonra sistem vasküler harekete geçirmek değerlendirmek için önerilen deneme roman uyuşturucu test edebilirsiniz. İnflamatuar bu bağlamda faiz bileşik ile test endotel hücre hücreleri kontrol şartları karşılaştırılabilir ve ortaya çıkan farklılık gelişme ve ilerleme inflamasyon ilacın prognostik sonuç bilgilendirebilir. Sonuç olarak, yeni uyuşturucu hedefler roman vasküler özgü terapiler inflamatuar ilgili hastalıklara karşı tasarımını etkileyebilecek endotel hücreleri, karakterize etmek için bir sistem teklif ediyorum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. endotel hücre kültür
- 2.5 mL jelatin ile kat 100 mm doku kültürü tabak tabak doku kültürü tedavi çözüm (distile su içinde autoclaved, % 0,1 jelatin) 37 ° C'de 30 dk için; bu iyi gibi gerekli biçime yaygınlaştırılması. Jelatin çözüm Aspire edin ve doku kültürü mahallede kurumasını tabakları bırakın.
- Doku kültürü koşulları
- MLEC-04 hücrelerin biyolojik bir kuluçka (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO 2) içinde yetiştirmek. Dulbecco komple medya hücreleri büyümek ' s modifiye kartal orta: %10 Fetal sığır Serum (FBS) ve 100 adet/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin (P/S) ile desteklenmiş besin karışımı F-12 (DMEM/F-12).
- Standart Neubauer odası yöntemi tarafından hücreleri saymak ve 100 mm jelatin tedavi plakaları 10 mL tam ortamda, düşük yoğunluklu 2-11 x 10 4 hücreleri/cm 2, MLEC-04 hücreleri ekleyin. İzdiham ulaştığında 1:3 hücreleri bölme.
Not: Genellikle bu kültür içinde 2-3 gün sonra ortaya çıkar. - Alt kültür 10 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) 2 mL tripsin-EDTA çözüm (% 0.25 Tripsin, 5 mM EDTA) ekleyerek takip ve 3 dk. 37 için kuluçkaya ile tabak yıkama tarafından hücreleri ° C.
- Tripsin-EDTA reaksiyonu durdurmak ve 10 mL tam medya ekleyerek askıya alınan hücreleri kurtarmak. Spin hücreler (300 x g, 5 dk), süpernatant atmak, komple bir medya ve alt kültür hücresel Pelet uygun şekilde resuspend.
2. LPS tedavi ve arabulucu
- MLEC-04 hücreleri aşağıdaki iyi biçime alt kesiştiği yerde, tam medya plaka: 7 x 10 5 hücreleri/iyi 6-şey plakaları ve 2.5 x 10 5 hücreleri/iyi 96-şey Tabaklarda.
- Kültür bir hücre kuluçka (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO 2) 6 h için kuluçkaya. Hücreleri eksik medya (DMEM-F12, P/S) geçin ve gece (ON) eşitlemek için ve hücre etkinliğini azaltmak üzere bırakın.
- Medyayı çıkarın ve endotel hücreleri ile (veya olmadan) kuluçka tarafından roman farmakolojik bileşikler test ilaç söz konusu (örneğin DT 10) eksik medya (30 dk, 37 ° C) seyreltilmiş; 1.4 mL ekleyin/iyi 6-şey plaka veya 0,14 için 96-şey plakaları için mL/de).
- Hücreleri her tahlil belirtilen süre için kuluçka ortamına (100 ng/mL, son konsantrasyonu) LPS ekleyerek meydan. Bir denetim olarak PBS kullanın.
3. Transkripsiyon profil sayfası aktive endotel RT-qPCR tarafından değerlendirilmesi
- 6-şey kültür alt izdiham tohum MLEC-04 hücreleri tabak (7 x 10 5 hücreleri/de). 6 h (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO 2) kuluçkaya ve daha sonra serum açlıktan ölecek devam edin (ON kuluçkaya).
- Medyayı çıkarın ve endotel hücre kültürleri ile ilgi uyuşturucu (kuluçkaya 30 dk, 37 ° C) eksik medya seyreltilmiş; 1.4 mL ekleyin/iyi 6-şey plaka (30 dk, 37 ° C) tedavi (veya muamele yapmak).
- Hücreleri 100 ng/mL LPS inkübe medyaya (2.3 adımda anlatıldığı gibi) ekleyerek meydan ve iki kez soğuk PBS ile yıkayarak tepki 6 h. durdurmak için kuluçkaya ve plakaları-80 ° C'de örnek işleme kadar devam.
- RNA çıkarma
- plakaları çözülme ve 1 mL/iyi RNA ayıklama arabellek (% 38 fenol ve 0, 8 M guanidinium isothiocyanate malzemelerin tabloya bakın;) ekleyin. Ajitasyon ve toplamak homogenate 1,5 mL tüpler altında (RT) oda sıcaklığında 30 dakika bırakın.
- 200 µL kloroform ekleyip hafifçe RT ve santrifüj (11,600 x g, 15 dk, 4 ° C) 3 dk 15 s. Incubate için kışkırtmak.
- Sulu faz için başka bir 1,5 mL tüp aktarın. RT, sonra Santrifüjü (11,600 x g, 4 ° C) bir 10 min kuluçka ardından 500 µL isopropanol ekleyerek RNA çökelti.
- Süpernatant atmak ve Pelet % 75 etanol ile yıkama girdap ajitasyon ve sonra Santrifüjü (7,500 x g, 4 ° C).
- Pelet kurumasına ve RNA 25 µL saf H 2 O kadar örnek işleme 55 ° C. Keep RNA-80 ° C'de 10 dakika için kuluçka solubilize.
- Miktar ve saflık RNA'ın
- örnek 260 Absorbans ölçerek RNA konsantrasyon ölçmek bir Spektrofotometre nm (Tablo malzemeleri görmek).
- Ölçü at 230 nm ve 280 nm RNA saflık belirlemek için.
Not: 260/280 oranında protein veya fenol kirlenme gösterir. 2 yakın bir oran kabul edilebilir. 260/230 oranında EDTA, karbonhidrat veya fenol kirletici maddeleri gösterir. 2.0-2.2 arasında değerleri kabul edilebilir.
- Kontrol RNA bütünlük
- çalıştırmak 2 µg toplam RNA ve bir RNA merdiven üzerinde özel jel denaturing %1,5; bir jel dokümantasyon sistemde görselleştirmek (Tablo malzemeleri görmek).
Not: Net ve keskin 28S ve 18S rRNA bantları 2:1 oranında sağlam bir RNA gösterir. Kısmen bozulmuş RNA çözümler olarak bulaşmış bir kez.
- çalıştırmak 2 µg toplam RNA ve bir RNA merdiven üzerinde özel jel denaturing %1,5; bir jel dokümantasyon sistemde görselleştirmek (Tablo malzemeleri görmek).
- RT-qPCR
- Standart takip tek iplikçikli RNA (cDNA) tamamlayıcı DNA sentez protokol (bakınız Tablo reçetesi) 11.
- Değerlendir gen ekspresyonu RT-qPCR tarafından
- tepki karışımı her örnek için hazırlamak: Mix 2 µL cDNA, 7 µL floresan bileşik, 300 nM ileri astar ve 300 nM ters astar (Tablo 1) içinde bir Son 13 µL, hacmi ve 96-iyi tepki plakasına eklemek (Tablo malzemeleri görmek).
- Optik bir yapışkan kapak, santrifüj (300 x g, 1 dk) ile plaka mühür ve bir gerçek zamanlı PCR sistemde reaksiyon (sıcak başlangıç için 20 95 ° C s 40 döngüsü tarafından takip: 95 ° C 3 s ve 60 ° C 30 s) (Tablo malzemeleri görmek).
- Analiz sonuçları karşılaştırmalı yöntem 2 kullanarak göreli Nefelometri tarafından -ΔΔCt temizlik genler gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) veya asidik ribozomal Fosoprotein P0 (36B4) 12 .
4. Akış Sitometresi tarafından endotel harekete geçirmek değerlendirmek
- 2 bölümünde açıklanan koşullar takip MLEC-04 hücreleri tedavi ve endotel yüzey proteinleri değişiklikleri Akış Sitometresi tarafından değerlendirmek.
- Hücrelerinin LPS stimülasyon açıklanan tripsin-EDTA yöntemi ile 6 h sonra 1.2.3 adım ve 4'te eksik medya ile yıkayın Detach ° C.
- Neubauer odası yöntemini kullanarak hücreleri saymak ve 10 x 10 4 hücreleri u-alt 96-şey kalıplara yerleştirin. Santrifüj (300 x g, 5 dk) ve atma bir 180 ° süpernatant yaslama üst bilek alt ve özgün konuma hızlı kurtarma için.
- Eksik medya (10 µg/mL, son konsantrasyonu) hücrelere seyreltilmiş seçili antikor 50 µL ekleyip (30 dk, 4 ° C) kuluçkaya.
- Hücreleri iki kez w yıkamaAşağıdaki açıklanan yordamı eksik medya 4.3 adım ve ilgili ikincil antikor 10 µg/mL, 50 µL ile kuluçkaya ith birleştiğinde FITC veya benzer eşlenik (30 dk, karanlık bir alanda 4 ° C).
- Hücreleri bir kez PBS yıkama tarafından takip eksik medya ile yıkayın. 1 mL pipet ipuçlarını kullanarak 300 µL PBS ile hücreleri kurtarmak ve yer sitometresi tüplerde.
- Akış Sitometresi sistemi örnekleri değerlendirmek (Tablo malzemeleri görmek). Hücre nüfus tarafından ileri ve yan Saçılma parametreleri ayarlayın. Faiz nüfusu bir kapı. Gates izotip kontrol ile inkübe hücrelerden negatif kontrol dayalı ayarlayın. Sonuçlar pozitif hücrelerinin yüzde olarak çözümlemek veya demek floresan yoğunluğu 8.
5. Endotel etkinleştirme Western Blot tarafından değerlendirmek
- endotel alt izdiham içinde 6-şey kültür tabak (7 x 10 5 hücreleri/de), tohum ve LPS ile 2 bölümünde açıklandığı gibi davranın. İnflamatuvar protein ifade aşağıdaki western blot protokolü tarafından analiz.
- Endotel yanıt farklı yönlerini aydınlatmak için farklı zaman noktalarda LPS stimülasyon durdurmak:
- inflamatuar proteinler profil LPS stimülasyon 6 h sonra tespit.
- Her 15 dakikada bir 60 dk süre boyunca sinyal hücre belirlemek.
- İki kez soğuk PBS ile yıkayarak tepki her iki durumda da, durdurmak ve-80 ° C'de örnekleri örnek işleme kadar mağaza. Her şey (% 1 iyonik olmayan yüzey aktif, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM Sodyum Klorür, sodyum pirofosfat 30 mM, 50 mM sodyum florür, 2.1 mM sodyum orthovanadate,
- Lyse hücreleri ve protein çıkarma
- ekleyin 200 µL lizis arabelleğe pH 7,6, proteaz inhibitörü kokteyl ile desteklenmiş) (malzemelerin tabloya bakın).
- Ajitasyon altında 4 ° C'de 15 dakika wells bir pipet ucu ile scrape ve 1,5 mL tüpler homogenate toplamak için kuluçkaya.
- 4'te 11,600 x g de tüpler santrifüj kapasitesi ° C.
- Süpernatant temiz 1.5 mL tüpler-80 ° C'de işleme kadar saklayın.
- Ölçü standart takip bicinchoninic asit tahlil tarafından protein konsantrasyonu protokol (malzemelerin tabloya bakın) 13.
- Toplam protein her örnek için lysate 30 µg % 0,1 Sodyum Lauryl Sülfat, % 10 polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) 14 standart tekniği ile çözmek. 10 mM β-mercaptoethanol (azalan bakiyeli koşullar) ile ya da ezelî örneklerini çalıştırma (sigara azaltarak koşullar) bağlı olarak protein ilgi algılamak için kullanılan antikor.
- Ayrılmış proteinlerin polyacrylamide jel polivinilidin difluoride (PVDF) transfer membran ile 0,45 µm gözenek boyutu standart bir işlem kullanarak transfer.
- Aktarım sonra membran PBS, % 0,1 polysorbate-20 (PBS-T) ile iki kez yıkayın ve PBS-t için tespit edilen phosphoproteins ya da %5 yağsız kuru süt PBS-t ajitasyon (90 dk, altında toplam proteinler için seyreltilmiş 20 mL % 2 BSA ekleyerek belirsiz bağlayıcı siteleri blok RT).
- Seçili antikor uygun engelleme arabellek önerilen konsantrasyon, 10 ml seyreltik ve ajitasyon (ON, 4 ° C) altında membran kuluçkaya. Alternatif olarak, membran mühürlü plastik torbalara koyun ve 5 mL sulandırılmış antikor de kullanılan.
- Ertesi gün, membran üç (aşırı PBS-T, 15 dk, RT) yıkayın.
- Membran ajitasyon (30 dk, RT) 10 mL ile muhabir ikincil antikor, altında bağlı 1:10,000 uygun engelleme arabelleği, seyreltilmiş horseradish peroksidaz (HRP) için Incubate.
- Membran ajitasyon (aşırı PBS-T, 15 dk, RT) altında üç kez yıkayın.
- Membran peroksidaz gelişmiş substrat Kemiluminesan (ECL) 0.1 mL/cm 2 1 dk. için kuluçkaya. İki şeffaf plastik levhalar arasındaki süzülmüş zar ve bir Charged-Coupled aygıt fotoğraf makinesi (CCD) içeren Kemiluminesan algılama sistemi yerleştirin.
- CCD kamera sinyal ve birikmiş programı ile kayıt resimlere yazılımının belirlemek için kullanın (resimleri görüntülemek birikmiş sinyal her 30 s pozlama toplam 15 dk süreyle).
- Kullanıcı Kılavuzu 15 ' te açıklanan protokol sonrası ImageJ yazılımını kullanarak Dansitometresi tarafından grup yoğunluğunu ölçmek.
- Numune ImageJ yazılımında açın ve grubun ilgi dikdörtgen Seçim aracıyla seçin.
- İlk lane ve basın profil araziler almak için şerit arsa gibi seçin.
- Alan normal amortisman seçimi ile doruklarına sınırlandırmak.
- Her tepe içini tıklatarak her grup boyutunu ölçmek.
- Protein denetim (β-aktin, tübülin vb.) yükleme ile ilgili sonuçları temsil.
6. Faktörü endotel yayımlanan lökosit etkinleştirme yapışma deneyleri tarafından üzerinden değerlendirmek
- endotel şartına medyayı edinmek.
- 2 bölümünde belirtildiği gibi MLEC-04 hücreleri tedavi ve LPS ile 24 h stimülasyon sonra kültür süpernatant toplamak (100 ng/mL).
- Klimalı ortam tedavi MLEC-04 hücreleri ve santrifüj (600 x g) toplamak. Süpernatant 0.5 mL aliquots-80 ° C'de kullanımda kadar devam.
- Lökosit yapışma tahlil
- 50 µL/iyi (dışında kollajen, 0.1 M Asetik asit içinde seyreltilmiş) PBS içinde seyreltilmiş seçili hücre dışı matriks proteinleri ile 96-şey plakalar kat: fibronektin (1-10 µg/mL ), laminin (1-10 µg/mL) ve kollajen tip ı (10-40 µg/mL). Bırak ON 4 ° C'de
- Kaplamalı medya atmak ve wells ile 150 µL PBS, % 1 BSA ısı inaktive (1 dk, 100 ° C) dik, 90 dakika için üzerinde belirsiz bağlayıcı siteleri blok
- Wells PBS ile iki kez yıkayın ve wells için 100 endotel şartına µL, daha önce toplanan medya (Bölüm 6.1) ekleyin.
Not: Yapışma tahlil gerçekleştirmek için hazır tabaklara. - Kültür biyolojik bir kuluçka (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO 2) fare monosit makrofaj hücre kültürünü J774 Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI ile), % 10 FBS, % 1 P/S.
Not: Süspansiyon J774 hücrelerin büyümesine. - J774 hücre içine a 15 mL tüp ve santrifüj (300 x g, 5 min) toplamak. Süpernatant atın ve hücresel Pelet 10 mL serum-Ücretsiz medya ile resuspend. Neubauer odasında hücreleri saymak. Hücreler (300 x g, 5 min) santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve serum-Ücretsiz medya 50 µL medya başına 15 x 10 4 J774 hücre hücrelerde resuspend.
- Ekle 15 x 10 4 J774 hücreleri her şey 50 µL serum-Ücretsiz medya ve CO 2 hücre kuluçka 37 ° C'de 1 h ardından 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
- Sıcak PBS ekleyerek iki kez, yavaşça kuyuları yıkama; (300 x g, 5 min) santrifüj kapasitesi ve üst bilekten alt ve özgün konuma hızlı kurtarma için bir 180 ° erken tarafından süpernatant atmak. Ekli cep tamirs % 4 paraformaldehyde (PFA) 100 µL/kuyu içinde PBS ekleyerek ve (10 min, RT) kuluçkaya.
- Medya yavaşça atmak ve RT. atma medya adlı 2 min için PBS içinde % 2 metanol hücrelerle hafifçe permeabilize ve % 20 metanol için %90 0.5 kristal violet 50 µL/kuyu ekleyerek hücreleri leke RT. s
- Plaka bol su ile yıkayın, aşırı sıvı atmak ve kurumasını bırakın. Dijital kamera için ışık mikroskop birleştiğinde tarafından eklenen hücreleri raporu.
- 100 µL/kuyu 0.1 M sodyum sitrat, % 50 etanol ekleyerek boyama hücre sulandırmak. 545 nm ve Absorbans veya yüzdesini % 100 olarak hücre adezyon dikkate alınarak tarafından yapışma rasgele birimleri olarak sonuçlarını ulaştı wells için temsil Absorbans kaplı yüksek ligand konsantrasyonu ile ölçü
7. Test endotel etkinleştirme lökosit-endotel co yapışma tahlil tarafından
- MLEC-04 hücreleri 96-şey plakaları 2 bölümünde açıklandığı gibi tedavi ve LPS (6 h, 37 ° C) ile kuluçkaya.
- Fluorescently J774 hücre Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CSFE) ile etiketleyin.
6.2.5 yordamda aşağıdaki PBS
- yıkama J774 hücrelerde. Hücreler tarafından Neubauer odası yöntemi ve 1 x 10 6 hücre/mL PBS, % 0,1 BSA, resuspend sayımı.
- CFSE (5 µM, son konsantrasyonu) hücrelerle 20 dk 37 ° C. Ekle 5 mL eksik medya için kuluçkaya ve (5 dk, 4 ° C) kuluçkaya.
- Yıkama bir kez eksik medya ile 6.2.5 içinde açıklandığı gibi., 15 x 10 4 hücreleri/100 µL resuspend ve co yapışma tahlil için devam.
- Endotel tedaviden sonra wells üç kez eksik medya ile yıkayın. CFSE-J774 hücreleri (15 x 10 4 hücreleri/100 µL) her endotel kaplı-de ekleyin. 37 60 dk ardından 4 ° C'de 10 dakika plaka kuluçkaya ° C.
- Kuyuları yavaşça 6.2.7 içinde açıklandığı gibi yıkayın. ve J774 adezyonu endotel tabakası tarafından aşağıdaki iki yöntemden rapor ısıtılan PBS kullanma:
- Lyse 0.1 M Tris-HCl pH 8.8, % 1 SDS hücrelerde (100 µL/de) ve ölçmek CFSE-J774 sinyal fluorometry ile (uyarma/emisyon 492 nm/517 nm =). Sonuçlar floresan yoğunluğu rasgele birimleri veya yapışma açısından olumlu denetim yüzdesi olarak temsil (sinyal eklendi toplam hücrelerden her şey için).
- Floresan mikroskop altında görselleştirme tarafından eki CFSE-J774 hücrelerin endotel hücreleri %4 PFA ve rapor düzeltmek (uyarma/emisyon 492 nm/517 nm =).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LPS kaynaklı endotel hücre aktivasyonu RT-qPCR tarafından değerlendirilmesi
Açlıktan serum MLEC-04 hücreleri 100 ng/mL LPS 6 h için tarafından teşvik ve endotel gen ekspresyonu harekete geçirmek işaretleri istirahat durumuna ifade karşılaştırarak RT-qPCR kullanarak değerlendirildi. Şekil 1Aile gösterildiği gibi LPS inkübe MLEC-04 hücreler seçili adezyon molekülleri (E-selektin, VCAM-1 ve ICAM-1) inflamatuar yanıt sırasında lökosit işe dahil mRNA ifade indüklenen. Ifade bu deneysel tedavi altında değiştirilmemiş çünkü PECAM-1 bir iç denetimi olarak kullanıldı. Şekil 1B endotel etkinleştirme sitokinler Ccl5, Cxcl10 ve Cxcl1 artan mRNA ifade tarafından ölçülen LPS tarafından temsil eder. Bu moleküller lökositlerin endotel tabakası ve inflamasyon sitesine sonraki ekstravazasyonu kaçakçılığı dahil olmak üzere, dolaşan aktif olarak katılmaktadırlar. Sitokin, IL4, bir iç kontrol altında bu deneysel tedavi olarak kullanılmıştır.
Şekil 1: değerlendirilmesi LPS kaynaklı endotel hücreleri etkinleştirme tarafından RT-qPCR. MLEC-04 hücreleri ile 100 ng/mL LPS 6 h (Kırmızı çubuklar) denetim koşulu (Mavi çubuklar) karşılaştırıldığında için teşvik ve gen ekspresyonu RT-qPCR tarafından analiz edildi. Grafikler gösterirken mRNA seçili endotel adezyon molekülleri(a)denetim durumu ile ilgili olarak kat indüksiyon ve sitokinler (B) lökosit harekete geçirmek ve işe alım inflamatuar yanıt sırasında katılan. PECAM-1 ve IL4 negatif denetimleri bu koşul altında olarak kullanılmıştır. Sonuçları ± SEM gerçekleştirilen, üçte bir deneme nüsha yürütülen demek gibi ifade edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Protein ifade adezyon moleküllerinin endotel hücrelerinin LPS-tedavi
İnflamatuar stimülasyon önceki bölümde detaylı olarak MLEC-04 hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiş ve protein ifade western blot tekniği ile araştırılmıştır. Dinlenme endotel adezyon molekülleri VCAM-1 ve ICAM-1 (etiket) aynı derecede - neredeyse belirlenemeyen seviyeleri sunuyor. LPS (+) huzurunda, endotel aktive fenotip nitelendirdi işaretler (Şekil 2) ifade upregulation tarafından belirgindir. Membranlar yükleme denetimi olarak göreli bant yoğunlukları Dansitometresi analizden sonra hesaplamak için kullanılan β-aktin algılama normalleştirilmiş.
Şekil 2: Protein ifade adezyon moleküllerinin endotel hücrelerinin LPS tedavi. Temsilcisi western blot değerlendirirken VCAM-1 ve ICAM-1 protein ifadede dinlenme (-) MLEC-04 hücreleri LPS tedavi (+) karşılaştırıldı. β-aktin yükleme denetimi olarak kullanıldı. Her protein molekül ağırlığı parantez içinde olduğunu. Değerleri göreli bant yoğunlukları yarı miktar temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
LPS-aracılı iltihap endotel yüzey işaretlerinin
Endotel aktivasyon inflamatuvar bağlamda LPS tarafından 6 saat stimülasyon sonra Akış Sitometresi tarafından değerlendirildi (100 ng/mL). Bu durumda, moleküller lökosit etkileşime katılan ilgili yapıştırıcı ile ilgili algılama değerlendirilmiştir. Sol panelindeki şekil 3A izotip negatif kontrol (siyah noktalı histogram) göre Bazal ifadesini belirtilen veri işaretleyicilerini dinlenme MLEC-04 hücrelerdeki (kırmızı-katı çubuk grafik) temsil eder. Şekil 3A doğru kapı aynası uyarılan MLEC-04 elde edilen sonuçları gösterir. LPS tedavi önemli ölçüde upregulated Ifade adezyon molekülleri E-selektin, VCAM-1 ve ICAM-1 ile plazma zarı (kırmızı-katı çubuk grafik) Zaman (siyah noktalı histogram) istirahat durumuna göre. Gösterildiği gibi sitometresi profilleri ve PECAM-1 ifadesi deneysel bu durumda değişmeden önce gösterdi. Şekil 3B endotel inflamatuar reaksiyon mümkün arabulucu değerlendirmek için referans olarak kullanılan miktar değerleri gösterir. %: yüzde pozitif hücre; MFI: floresan yoğunluğu demek.
Şekil 3: LPS-aracılı iltihap endotel yüzey işaretlerinin. Akış Sitometresi profilleri üzerinde dinlenme hücre adezyon molekülleri ve LPS teşvik MLEC-04 hücreleri. Sol panelde protein ifade resting hücrelerde (Antigen etiketli-kırmızı çubuk grafik) eşleşen izotip kontrol (Ctrl-siyah çubuk grafik) ile ilgili olarak gösterir. Doğru kapı aynası LPS tedavi endotel hücreleri (kırmızı çubuk grafik) için denetim hücre yüzeyine protein ifade (siyah çubuk grafikler) karşılaştırır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Sinyal yolları LPS stimülasyon endotel hücreleri tarafından tetiklenen
Mekanizmaları enflamasyon sırasında damar yuvası harekete geçirmek dahil anahtar sinyal molekülleri değerlendirerek incelenmiştir. MLEC-04 hücrelerinin LPS ile farklı dönemlerde uyarılmış protein çıkarma için işlenmiş olan ve harekete geçirmek derecesini Batı leke tekniği ile analiz edildi. Şekil 4 NF-κB sinyal, IκB-α önleyici 15dk sonra LPS-kuluçka fosforile ve 1 saat sonra için Bazal düzey döndürür gösterir. Öte yandan, LPS etkinleştirir ERK 1/2 15 dakika sonra sinyal, hangi kurar bir temel yolu endotel etkinleştirme sırasında inflamatuar yanıt dahil. Membranlar β-aktin veya ERK tarafından 1/2 algılama, hangi yükleme denetimi olarak göreli bant yoğunlukları Dansitometresi analizden sonra hesaplamak için kullanılan normalleştirilmiş.
Şekil 4: endotel hücrelerinin LPS tarafından tetiklenen yolları sinyal. MLEC-04 hücreleri 100 ng/mL LPS Times ile uyarılan resimde belirtilen ve ERK 1/2 (P-ERK 1/2) ve NF-kB (P-IκBα) aracılığıyla sinyal yolları western blot tarafından değerlendirildi. ERK 1/2 Toplam ve β-aktin her koşul denetimleri yükleme olarak kullanılmıştır. Parantez içinde her protein için moleküler ağırlığıdır. Değerleri göreli bant yoğunlukları yarı miktar temsil eder. Daha büyük bir versiyonu görmek için buraya tıklayın lütfenBu rakam.
Endotel LPS ile uyarılmış tarafından lökosit davranış Yönetmeliği
Endotel etkinleştirme, inflamatuar reaksiyon gelişimi düzenlenmesi biyolojik alaka lökosit performans fonksiyonel deneyleri tarafından belirlenir. Protokol bölümünde açıklandığı gibi iki farklı yaklaşımlar endotel hücreleri tarafından düzenlenir lökosit işlev sınamak için dahildir. Deneyleri inflamatuar yanıt (endotel sitokinler lökosit harekete geçirmek ve endotel adezyon molekülleri lökosit etkileşim için western blot tarafından yayımlanan için RT-qPCR) farklı yönlerini sorguya, elde edilen veriler olmakla birlikte her ikisi de mikroskobik lökosit ek ayrıntılarını değerlendirin. Hücre adezyon çeşitli yüzeyler için iyilik gibi lökosit etkinleştirme endotel çözünür faktörler tarafından verimli bir enflamatuar yanıt geliştirmek için önemlidir. Şekil 5A J774 hücre adezyon için 0,5 µg/mL fibronektin kaplı wells önceden toplanan klimalı ortam denetimi gelen yanıt veya LPS endotel hücreleri tedavi gösterir. Parlak alan görüntüler ve spektrofotometrik ölçümler LPS tedavi endotel şartına medyadan yayımlanan faktörler hücre eki indüksiyon tarafından gösterildiği gibi verimli bir şekilde J774 harekete geçirmek, ikna etmek yeterli olduğunu gösteriyor fibronektin. Şekil 5B damar tabaka lökosit firma adezyonu endotel adezyon molekülleri roman ifade tarafından destek yeteneği değerlendirmek için bir işbirliği yapışma tahlil temsil eder. Kısaca, LPS ile 6 h için teşvik MLEC-04 hücreleri açlıktan serum subconfluent kültürleri birkaç kez yıkanmış ve J774 daha önce floresan sonda ile CFSE etiketli lökosit hattı ile birlikte inkübe edildi. Filmler ve spectrofluorometric ölçümleri gösterildiği gibi LPS-vasküler stimülasyon endotel monolayer hücrelere CFSE-J774 arasındaki etkileşimin yanadır.
Şekil 5: lökosit etkileşim LPS inkübe endotel monolayer tarafından ortak yapışma tahlil için. (A)ışık mikroskobu görüntüleri 0,5 µg/mL fibronektin kaplı wells klimalı ortam denetimi veya LPS tedavi endotel hücreleri gelen yanıt bağlı J774 hücrelerinin kristal violet boyama gösterilen. Ölçek çubuğu, 50 µm. Aşağıda gösterilen spektrofotometrik analiz ifade olarak rasgele birimleri (yapıyordum) ± SEM bir temsilcisi deneme nüsha çalıştırmak için Absorbans ölçümü gösterir. (B) floresan Filmler göstermek bağlı CFSE-J774 hücreleri denetime veya LPS tedavi MLEC-04 hücreleri co yapışma tahlil tarafından değerlendirildi. Ölçek çubuğu 50 µm =. Aşağıda gösterilen Fluorometrik analizi ifade olarak rasgele birimleri (yapıyordum) ± SEM bir temsilcisi deneme nüsha çalıştırmak için floresan yoğunluğu gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Hedef | NCBI RefSeq kimliği | Sıra (5´-3´) ileri | Ters sırada (5´-3´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | HAREKET GTG GAT GGC CCC TCT GG3 | TGA SKK TGC CCA CAG SKK TG |
| 36B4 | NM_007475.5 | AGA TGC AGC AGA TCC GCA T | GTT CTT GCC KEDİ CAG CAC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | CAA AGC ATC MOLDOVA'DA TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT GAG GAA TA |
| Ccl5 | NM_013653.3 | HM PLAKETLİ DELİKLİ CTG CAG CTG CCC TCA CC | HM PLAKETLİ DELİKLİ TGA ACC CAC TTC TTC TC |
| Cxcl1 | NM_008176.3 | GGG AAG AAA TGC AAG CTG AA | CTG TAC AGC AGG GTC CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | AGT GCA GCA AGA CTC TGG TAC CTA | AGT TCC ACA GAC ATT TGC TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | CTG GAC AAC ATA CTG CTA ACC G | GGG KEDİ CAC TTC TAC CAG GTA A |
| PECAM-1 | NM_008816.3 | CGA TGC GAT GGT GTA TAA CG | TGT CAC CTC CTT TTT GTC CAG |
| E-selektin | NM_011345.2 | GCA TGT GGA ATG ACG AGA GA | GTC AGG GTG TTC CTG TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC CCA GA | MOLDOVA'DA ATT TGA GCA ATC GTT TT |
| ICAM-1 | NM_010493.3 | MOLDOVA'DA CTA CCA TCA MOLDOVA'DA TGT A | GGC GGC TCA GTA TCT SKK C |
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan astar listesi.
| Dinlenme | LPS | |||
| % | MFI | % | MFI | |
| CTRL | 1,79 | 3.5 | 0,55 | 3,48 |
| PECAM-1 | 37.52 | 12,09 | 37.82 | 12.24 |
| E-selektin | 17,12 | 8,06 | 88,13 | 49.84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20,51 | 99.30 | 204.05 |
| ICAM-1 | 99.76 | 114.81 | 99.82 | 363.89 |
Tablo 2: LPS-aracılı iltihap endotel yüzey işaretlerinin. Akış Sitometresi Analizi tarafından dinlenme ve LPS teşvik MLEC-04 hücrelerde hücre adezyon molekülleri ifade miktar. Pozitif hücrelerinin (%) ve ortalama Floresans yoğunluğu (MFI) dinlenme ve LPS uyarılmış endotel hücrelerinde yüzdesini karşılık gelen her işaretçisi temsilcisi değerleridir. PECAM-1 Bu deneysel koşullarda bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Roman mekanizmaları inflamatuar yanıt yönetmelikte yer keşfetmek için zemin oluşturur kademeli bir teknoloji bu endotel protokolünü açıklar. Bu yaklaşımlar endotel faaliyetinin LPS tarafından uyarılan çalışmaya dayanarak ve lökosit işe inflamatuar yanıt sırasında özellikle dahil kritik adımları değerlendirmek: endotel sitokinler açıklaması, endotel yapışma Vasküler katmana molekülleri ifade ve lökosit yapışma. Endotel parametreleri oluşturulduktan sonra sistem yeni bileşikler endotel fonksiyonları yönetmelikte yer alan arama yapabilirsiniz ve sonuç olarak, inflamatuar ilerleme. O düzenleyici ilaçlar sorunlara neden ilaç pazarına ilgi olabilir. Bu sıralı protokol büyük projeksiyon onların göreceli vasküler etkinlik parametreleri ayarlayarak farklı endotel türleri ve uyarıcı koşulları bu çalışmalar genişletmek için bir temel oluşturmaktır.
Bu tarama tarafından seçilen uyuşturucu enflamatuar bozuklukları karşı yeni tedavi edici stratejiler tasarlamak için ilginç adaylar teşkil edecektir. Bir yandan, endotel yanıt lehine ve lökosit işe alım için katkıda bileşikler immün yetmezlik koşulları16,17için umut verici olacak. Öte yandan, endotel inhibitörleri kronik inflamatuar hastalıklar10için mükemmel terapiler oluşturacak.
Tarafından uyarılan endotel ifade sitokinler karakterizasyonu iltihabı evrimi öngörür. Sitokinler küçük proteinler inflamatuar bağlamda endotel tabakası tarafından yayımlanan ve şiddetle lökosit davranışını düzenler. Pro-inflamatuar üyeleri, Ccl5, Cxcl10 ve Cxcl1, gibi bağlamak için onların belirli reseptörleri lökosit yüzeyi ve yeni ifade adezyon molekülleri (E-selektin, VCAM-1 ve ICAM-1), vasküler katmandaki etkileşim lökosit ikna etmek sinyal ve lökosit göç patolojik alan (şekil 1, Şekil 2, şekil 3)8,10,18. Proteinlerin aynı ailenin diğer üyeleri inflamasyon ve sonuç olarak doku onarımı çözünürlüğünde katılmaktadırlar. Bu anti-inflamatuar sitokinlerin ifade kronik inflamatuar hastalıklar için ilgili çünkü onlar lökosit işe engel ve bağışıklık izni10,19,20lehine. Olası endotel inflamatuar düzenleyiciler seçmek için bu sitokin ifade tahlil gerçekleştirmek ve bileşikleri huzurunda endotel adezyon molekülleri ifade ilgi değerlendirmek için önerilir. Aslında, bir değeri hastalığın ilerlemesi için kullanılabilir düzeyleri arasında anti-inflamatuar pro-inflamatuar sitokinlerin karşı analiz ve uyuşturucu tedavi faiz21ortaya koymaktadır.
Onun hücre yüzey reseptör tetikleyicilere karmaşık hücre içi sinyal cascades ERK 1/2 harita kinazlar tarafından liderliğindeki bağlama LPS, JNK ve p38 ve NF-kB signalosome inflamatuar transkripsiyon program ikna etmek için. Bu yollar birçoğu TNF-α veya IL-110,22gibi diğer inflamatuar uyaranlara yaygındır. Endotel harekete geçirmek yanında hafiye Şekil4 ERK 1/2 için gösterildiği gibi harita kinaz üyeler fosforile şeklinde belirlenir. Ayrıca, karmaşık, IKKβ phosphorylates ve NF-kB inhibitörü alçaltır enzimatik aktivite endotel etkinleştirme LPS tarafından neden olmaktadır böylece muhabiri gerçekleştirmek NF-kB efektör üyeleri nükleer translocation sağlayan karmaşık IκB Transkripsiyon etkinlik (şekil 4). Tarafından uyuşturucu bileşik endotel inflamatuar yanıt etkileyen mekanizmaları karakterize çok yararlı, sadece uyuşturucu açıklayan, ancak Ayrıca uyumlu geleneksel tedaviler ile birlikte roman enflamatuar tedavileri tasarlama 23.
Bileşikler endotel inflamatuar tarama deneyleri seçili, sonuçta, enflamatuar bozuklukları için sorumlu hücrelerdir daha fazla lökosit davranış deneyleri, kritik adımlarda fonksiyonel kendi alaka onaylamak için eğitimi aldı gerekir. Bu deneyleri iki farklı deneysel ortamlarda lökosit etkinlik analiz. İntegrin aracılı yapışma deneyleri tarafından sitokinler endotel serbest bırakmak üstünde lökosit harekete geçirmek rolünün değerlendirilmesinde ilkidir. Lökosit integrinler endotel yayımlanan sitokinler tarafından aktif hale gelir. Böylece, lökosit integrin ligandlar yapışkanlı yeteneği lökosit işlevi8,10,18temsilcisi bir ölçümdür. Lökosit etkileşimi vasküler katmana yeni ifade endotel adezyon moleküllerinin rolü eş yapışma deneyleri tarafından eğitim ikincisidir. İnflamatuar bağlamında ifade endotel adezyon molekülleri çevreleyen dokuya lökosit işe alım için esastır. Böylece, hücreler endotel tedavi monolayer ile etkileşim lökosit analiz inflamatuar ilerleme (şekil 5)8,10,18için bir prognostik değer kabul ettiğiniz anlamına gelir. Bu yaklaşımlardan elde edilen sonuçlar seçili bileşikler enflamatuar bozuklukları tedavisi için gelecekteki stratejilerini tasarımında ciddi adaylar öneririm
Burada tanımlanan deneysel teklifi farklı hücresel veya uyarıcı sistemler ulaşmak için onun yetenek gelecekteki uygulamalar için çok yönlü bir araç yüzünden. Yordam endotel için farklı kökenleri veya türler ve birkaç bağışıklık hücreleri yanı sıra LPS, TNF-α, bakteri, virüsgibi farklı inflamatuar ajanlar onun işlevselliğini sınamak için değiştirilebilir. Metinde açıklandığı gibi araştırmacılar ilk endotel harekete geçirmek, kendi sistemi daha sonra karakterize enflamatuar yanıt üzerinde seçili bir bileşik rolü için karakterize gerekir. Seçimi uygun bir negatif kontrol ve tam olarak uyarılmış durumundan dinlenme ayırt endotel etkinlik parametreleri tanımlama iletişim kuralının sınırlamalardır. Bu yazıda tanımlanan koşullara farklı bir sistemi için çalışmaz durumda araştırmacılar deneysel parametreleri ek zamana bağımlı deneyleri yapmak ve inflamatuar uyarıcı bir konsantrasyon degrade kullanarak sorun giderme gerekir inflamatuar yanıt düzenlenmesi için yeni ilaç test etmek için izin verir bir uyarıcı pencere tanımlamak için.
Sonuç olarak, bu endotel inflamatuar Protokolü n arama için önerilirew endotel düzenleyiciler inflamatuar yanıt hedefleme. Bu yordamı uygulama roman, gelecekteki uygulamaları eğitim ve yenilikçi özel vasküler tedaviler inflamatuar ilgili hastalıklara karşı tasarımı için uygulanabilir ve hangi potansiyel olabilir ilginç bileşikleri sağlayacaktır ilaç pazarına ilgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser "gayri resmi" de Economía y Competitividad (MINECO) ve Instituto de tarafından desteklenmiştir Salud Carlos III (ISCIII) (grant sayıya IERPY 1149/16 al; MPY 1410/09 için S. Hortelano); tarafından MINECO Fondo de Investigación tr Salud (FIS) (verir numaraları PI11.0036 ve PI14.0055, S. Hortelano) aracılığıyla. S. Herranz tarafından IERPY 1149/16'dan ISCIII destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013).
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017).
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z.
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
