Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's
Summary
We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteïnen en kaart van de regio’s hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.
Abstract
Noncoding RNAs spelen een belangrijke rol in verschillende nucleaire processen, waaronder regulering van de expressie van genen, structuur van de chromatine en DNA-herstel. In de meeste gevallen is het optreden van noncoding RNAs gemedieerd door eiwitten waarvan de functies zijn op hun beurt weer gereguleerd door deze interacties met noncoding RNAs. In overeenstemming met dit, een groeiend aantal eiwitten die betrokken zijn in nucleaire functies hebben gemeld RNA binden en in enkele gevallen de RNA-bindende regio’s van deze proteïnen zijn toegewezen, vaak door middel van moeizame, kandidaat-gebaseerde methoden.
Wij rapporteren hier een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een hoge-doorvoer, Proteoom bestrijkende onbevooroordeelde identificatie van RNA-bindende proteïnen en hun RNA-bindende regio’s. De methodologie steunt op de opneming van een fotoreactief uridine analoge in de cellulaire RNA, gevolgd door UV-gemedieerde eiwit-RNA crosslinking en spectrometrische analyse te onthullen van RNA-kruisverwijzende peptiden binnen het proteoom. Hoewel we de procedure voor de muis embryonale stamcellen beschrijven, moet het protocol gemakkelijk worden aangepast aan een verscheidenheid van gekweekte cellen.
Introduction
Het doel van de methode van de RBR-ID is het identificeren van de roman RNA-bindende proteïnen (RBPs) en hun RNA-bindende regio’s (RBRs) kaart met peptide tabelniveau resolutie ter vergemakkelijking van het ontwerp van RNA-bindende mutanten en het onderzoek van de biologische en biochemische functies van eiwitten-RNA interacties.
RNA is uniek onder biomoleculen zoals het kan fungeren als een boodschapper uitvoering van genetische informatie én ook in complexe driedimensionale structuren met biochemische functies meer verwant aan die van eiwitten1,2 vouwen. Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat noncoding RNAs (ncRNAs) spelen een belangrijke rol in verschillende gene regelgevings- en epigenetische trajecten3,4,5 , en meestal deze regelgevende taken zijn gemedieerde in concert met eiwitten die ermee specifiek een bepaalde RNA. Van bijzonder belang zijn, werd een aantal interacterende eiwitten onlangs geïdentificeerd voor de intens bestudeerde lange ncRNA (lncRNA) Xist, waardevolle inzicht bijbrengen in hoe deze lncRNA x-chromosoom inactivatie in vrouwelijke cellen6,7 bemiddelt ,8. Met name verscheidene van deze Xist-interactie proteïnen bevatten geen canonieke RNA-bindende domeinen9, en daarom hun RNA-bindende activiteit niet kon worden voorspeld in silico gebaseerd op hun primaire volgorde alleen. Gezien het feit dat duizenden lncRNAs worden uitgedrukt in een bepaalde cel10, is het redelijk te veronderstellen dat velen van hen via interacties met handelen misschien nog worden ontdekt RNA-bindende proteïnen (RBPs). Een experimentele strategie om te identificeren deze roman RBPs zou daarom de taak van de ontrafeling van de biologische functie van ncRNAs aanzienlijk kunnen vergemakkelijken.
Eerdere pogingen om te identificeren RBPs empirisch hebben vertrouwd op polyA + RNA selectie gekoppeld aan massaspectrometrie (MS)11,12,13,14,15. Hoewel deze experimenten toegevoegd veel eiwitten aan de lijst van vermeende RBPs, door ontwerp, dat ze kon alleen het detecteren van eiwitten gebonden polyadenylated uitgeschreven. De meeste kleine RNAs en vele lncRNAs zijn echter niet polyadenylated. 16 , 17 en hun interacterende eiwitten zou waarschijnlijk hebben gemist in deze experimenten. Een recente studie toegepast machinaal leren op eiwit-eiwitinteractie interactome-databases op het identificeren van eiwitten die samen met meerdere bekende RBPs gezuiverd en toonde aan dat deze terugkerende RBP partners waren meer kans om te bezitten van RNA-bindende activiteiten18. Echter, deze aanpak is gebaseerd op mijnbouw bestaande grote interactie databases en herkent alleen eiwitten die mede gezuiverde in niet-denaturerende omstandigheden met bekende RBPs kunnen, dus met uitzondering van de analyse onoplosbare membraan-embedded en schaarse eiwitten.
De identificatie van een eiwit als een bona fide RBP vaak geen automatisch informatie over de biologische en/of biochemische functie van de interactie eiwit-RNA oplevert. Om aan dit punt, is het meestal wenselijk om de eiwit domein en aminozuur residuen betrokken bij de interactie te identificeren, zodat specifieke mutanten kunnen worden ontworpen om de functie van RNA-bindende testen in het kader van elke roman RBP19, 20. vorige inspanningen van onze fractie en anderen hebben gebruikt recombinant eiwit fragmenten en schrapping mutanten te identificeren van RNA-bindende regio’s (RBRs)19,20,21,22; echter, dergelijke benaderingen zijn arbeidsintensief en onverenigbaar met hoge gegevensdoorvoer analyses. Meer recentelijk, een studie beschreven een experimentele strategie om de kaart van RNA-bindende activiteiten in een high-throughput mode met behulp van massaspectrometrie23; echter deze aanpak gebaseerd op een dubbele polyA + RNA-selectie, en dus uitgevoerd dezelfde beperkingen als de RBP identificatie benaderingen zoals hierboven beschreven.
We ontwikkelden een techniek, genoemd RNA bindende regio identificatie (RBR-ID), die exploiteert eiwit-RNA photocrosslinking en kwantitatieve massaspectrometrie om eiwitten en eiwit regio’s interactie met RNA in levende cellen zonder te identificeren veronderstelling over de status van de polyadenylatie RNA, dus met inbegrip van RBPs afhankelijk van polyA-RNAs24. Bovendien, deze methode berust uitsluitend op crosslinking en stelt geen speciale eisen op eiwit oplosbaarheid of toegankelijkheid en is dus geschikt voor RNA-bindende werkzaamheden binnen membranen (bijvoorbeeld de nucleaire envelop) of slecht oplosbare compartimenten (kaart bijvoorbeeld de nucleaire matrijs). We beschrijven de experimentele stappen voor het uitvoeren van de RBR-ID voor de kernen van muis embryonale stamcellen (mESCs) maar met kleine aanpassingen dit protocol moet geschikt zijn voor allerlei soorten cellen, mits ze efficiënt 4SU van de cultuur opnemen kunnen medium.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven een gedetailleerde experimenteel protocol standaardinteracties RBR-ID in mESCs en met adequate wijzigingen, in een willekeurige cel die 4SU in RNA kunt opnemen. Andere celtypes voorschrijven optimalisatie van de aanpak om ervoor te zorgen een voldoende signaal / ruisverhouding. Bovendien, terwijl het protocol hierin richt zich op de behandeling van nucleaire RBPs beschreven, moet de technologie van de RBR-ID worden gemakkelijk aangepast aan verschillende cellulaire compartimenten, zoals het cytosol of spec…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.B. werd ondersteund door het programma van de geleerden Searle, de W.W. Smith Foundation (C1404) en de March of Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G erkent ondersteuning van NIH grants R01GM110174 en NIH R01AI118891, en DOD verlenen BC123187P1. R.W.-T. werd gesteund door de NIH opleiding grant T32GM008216.
Materials
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed – Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
Referências
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
- Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
- Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
- Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3′ ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
- Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
- Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
- Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
- Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
- Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
- Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
- Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5′ splice site recognition. Elife. 4, (2015).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).
