Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama
Summary
Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.
Abstract
Kodlamayan RNA’ların gen ekspresyonu, Kromatin yapısı ve DNA tamiri düzenleyen de dahil olmak üzere birkaç nükleer süreçlerinde önemli rol oynarlar. Çoğu durumda, kodlamayan RNA’ların eylem olan işlevleri sırayla kodlamayan RNA’ların ile bu etkileşimler tarafından düzenlenen proteinler tarafından aracılık ettiği. Bununla tutarlı, proteinler nükleer işlevlerinde dahil, giderek artan sayıda RNA bağlamak için bildirilmiştir ve birkaç durumda bu proteinler RNA-bağlama bölgelerinde, kez zahmetli, aday tabanlı yöntemleri ile eşleştirilmiş olan.
Burada, RNA bağlanıcı proteinler ve kendi RNA-bağlama bölgelerinin yüksek üretilen iş, Proteom çapında tarafsız tanımlama gerçekleştirmek için detaylı bir protokol raporu. Photoreactive üridin RNA-çapraz peptidler Proteom içinde ortaya çıkarmak için UV-aracılı protein-RNA crosslinking ve kütle spektrometresi analizleri ardından hücresel RNA, analog birleşme yöntemi kullanır. Her ne kadar biz fare embriyonik kök hücre için açıklayınız, protokol kültürlü hücreler çeşitli için kolayca adapte edilmelidir.
Introduction
PRİX-ID yöntemin amacı roman RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri (RBRs) RNA-bağlama mutantlar tasarımını ve soruşturma biyolojik ve biyokimyasal kolaylaştırmak için peptid düzeyi çözünürlükte harita olmaktır protein-RNA etkileşimlerin işlevleri.
RNA, hem genetik bilgi taşıyan bir haberci olarak hareket hem de aynı zamanda karmaşık üç boyutlu yapılar biyokimyasal fonksiyonları daha fazla benzer-e doğru protein1,2kat biomolecules arasında benzersizdir. Kanıt büyüyen vücut kodlamayan RNA’ların (ncRNA’lar) çeşitli gen düzenleyici ve epigenetik yolları3,4,5 ‘ te önemli rol oynarlar ve tipik olarak, bu düzenleyici işlevleri konserde aracılı öneriyor proteinler ile özel olarak verilen bir RNA ile etkileşim. Belirli uygunluğu etkileşen proteinler bir dizi son zamanlarda yoğun bir şekilde okudu uzun ncRNA (lncRNA) nasıl bu lncRNA kadın hücreleri6,7 x kromozomu inactivation aracılık eder içine değerli bilgiler sağlayan Xist belirlendi ,8. Özellikle herhangi bir kanonik RNA bağlayıcı etki alanları9içeren birçok Xist etkileşim bu proteinlerin değil ve bu nedenle RNA-bağlama faaliyetlerini öngörülen silico yalnız onların birincil sıralamasına dayanan olamazdı. LncRNAs binlerce herhangi bir belirli hücre10dakika sonra ifade edilir dikkate alındığında, RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) olmak keşfetti henüz pek çoğu ile etkileşimleri aracılığıyla hareket varsaymak makul olduğunu. Bu roman RBPs tanımlamak için deneysel bir strateji bu nedenle büyük ölçüde ncRNA’lar biyolojik fonksiyonu dissekan görevini kolaylaştırmak.
RBPs ampirik olarak tanımlamak için önceki girişimleri RNA kütle spektrometresi (MS)11,12,13,14,–15birleştiğinde polyA + seçime yararlanmıştır. Bu deneyler birçok protein, sözde RBPs listesine rağmen tasarım gereği sadece poliadenile transkript bağlı proteinler bulamazlardı. Ancak, çoğu küçük RNA’lar ve birçok lncRNAs poliadenile değildir. 16 , 17 ve onların etkileşen proteinler büyük olasılıkla bu deneylerde cevapsız olurdu. Yeni yapılan bir çalışmada Makine öğrenimi birden çok bilinen RBPs ile birlikte saflaştırılmış ve tekrarlayan RBP ortakları daha RNA-bağlama etkinlikleri18sahip olasılığı olduğunu gösterdi proteinler tanımlamak için protein-protein interactome veritabanlarına uygulanır. Ancak, bu yaklaşım büyük etkileşim veritabanlarında madencilik dayanır ve sadece böylece çözünmez, membran gömülü ve kıt analizinden hariç olmak üzere bilinen RBPs ile sigara denaturing koşullarda ortak saf olabilir proteinler tanımlayabilirsiniz proteinler.
Kimliği ile bir protein bir bona fide RBP kez otomatik olarak protein-RNA etkileşimi biyolojik ve/veya biyokimyasal işlevi hakkında bilgi vermez. Bu noktada adrese, bu etki alanı ve amino asit protein artıkları etkileşimde yer alan ilgili belirli mutantlar RNA bağlama işlevi her roman RBP19, bağlamında test etmek için tasarlanmış böylece tanımlamak için genellikle arzu edilir 20. önceki çabalar grubumuza ve diğerleri tarafından kullanmış rekombinant protein parçaları ve silme mutantlar bölgeleri (RBRs)19,20,21,22; bağlama RNA tanımlamak için Ancak, bu tür yaklaşımlar emek yoğun ve yüksek üretilen iş analizleri ile uyumsuz. Son zamanlarda, bir çalışma RNA-bağlama faaliyetleri kütle spektrometresi23kullanarak yüksek üretilen iş moda eşlemek için deneysel bir strateji tarif; Ancak, bu yaklaşım bir çift polyA + RNA seçime dayanıyordu ve böylece aynı sınırlamaları yukarıda açıklanan RBP kimlik yaklaşımlar olarak taşıdı.
Photocrosslinking protein-RNA ve protein ve RNA yapmadan canlı hücrelerdeki ile etkileşim protein bölgeleri tanımlamak için nicel kütle spektrometresi patlatır RNA bağlama bölge tanımlaması (PRİX ID.) olarak adlandırdığı bir tekniği, Gelişmiş varsayım RNA Poliadenilasyon durum, böylece RBPs de dahil olmak üzere polyA-RNA’ların24için bağlı. Ayrıca, bu yöntem sadece crosslinking dayanır ve protein çözünürlük veya erişilebilirlik şartlar yoktur ve böylece membranlar (örneğin nükleer zarf) veya kötü çözünür bölmeleri (RNA-bağlama etkinliklerine eşlemek uygundur örneğin nükleer matris). Biz PRİX-ID fare embriyonik kök hücreler (mESCs) çekirdekleri için gerçekleştirmek için deneysel adımlar açıklar ama koşuluyla verimli 4SU ile Kültür dahil edebilirsiniz küçük değişiklikler ile bu iletişim kuralı hücre tipleri, çeşitli için uygun olmalıdır Orta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz PRİX-ID içinde mESCs ve 4SU RNA dahil edebilirsiniz herhangi bir hücreye uygun değişiklikler ile gerçekleştirmek için detaylı bir deneysel protokol tanımlamak. Diğer hücre tipleri yeterli bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için yaklaşım duruma getirilmesi gerekebilir. Ayrıca, protokol burada odaklanır nükleer RBPs muayenede açıklanan. süre PRİX-ID teknoloji kolayca farklı ayırma kullanımıyla sitozol veya belirli organelleri, gibi farklı hücresel kompartmanlarda için adapte olmalıdır…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.B. Searle bilim programı, WW Smith Vakfı (C1404) ve Mart Dimes Vakfı (1-FY-15-344) tarafından desteklenmiştir. B.A.G hibe desteğinden NIH R01GM110174 ve NIH R01AI118891, DOD yanı sıra BC123187P1 hibe eder. RW-T. NIH eğitim grant T32GM008216 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed – Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
Referências
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
- Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
- Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
- Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3′ ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
- Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
- Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
- Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
- Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
- Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
- Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
- Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5′ splice site recognition. Elife. 4, (2015).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).
