Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Summary

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Abstract

RNA não-codificante desempenham papéis importantes em diversos processos nucleares, incluindo a regulação da expressão gênica, estrutura da cromatina e reparação do DNA. Na maioria dos casos, a ação de RNA não-codificante é mediada por proteínas que por sua vez, cujas funções são regulamentadas por essas interações com RNA não-codificante. Consistente com este, um número crescente de proteínas envolvidas em funções nucleares têm sido relatado para vincular o RNA e em alguns casos as regiões de RNA-ligação destas proteínas foram mapeadas, muitas vezes através de métodos laboriosos, baseado no candidato.

Aqui, nós relatamos um protocolo detalhado para realizar uma identificação imparcial elevado-throughput, proteoma-largo de RNA-proteínas e suas regiões de RNA-obrigatórias. A metodologia baseia-se na incorporação de uma uridina fotorreativas analógica no RNA celular, seguido de reticulação de RNA-proteína mediada por UV e análises de espectrometria de massa para revelar o RNA-quitosana péptidos dentro do proteoma. Embora nós descrevemos o procedimento para as células estaminais embrionárias de rato, o protocolo deve ser facilmente adaptado a uma variedade de culturas de células.

Introduction

O objetivo do método RBR-ID é identificar novas proteínas RNA-obrigatórias (RBPs) e mapear as regiões de RNA-obrigatórias (RBRs) com resolução de peptídeo-nível para facilitar o design de mutantes de RNA-obrigatórias e a investigação da biológicas e bioquímicas funções de interações proteína-RNA.

O RNA é único entre biomoléculas pode atuar como um mensageiro carregando informação genética e também dobrar em estruturas tridimensionais complexas com funções bioquímicas mais parecidas com as de proteínas^1,2. Um corpo crescente de evidências sugere que o RNA não-codificante (ncRNAs) des....

Protocol

1. cultura e expansão de mESCs

Nota: as células estaminais embrionárias de rato são fáceis de cultura e pode ser expandidas rapidamente para os grandes números exigidos pelo bioquímicas experiências graças a seu tempo de ciclagem rápida. MESCs saudáveis dobrar a cada 12 h.

1. MESCs expandir para o número desejado em placas gelatinizadas no mESC médio (veja abaixo) em uma incubadora de cultura de tecidos mantido a 37 ° C, 5% de CO ₂, e > 95% de umidade.
   Nota: Suficiente placas devem estar preparadas para 3-5 repetições biológicas para o + 4SU amostra e controle a - 4SU. Uma placa de 10 cm (ou seja, 5 m....

Results

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho RBR-ID. Devido a reticulação relativamente baixa eficiência dessa técnica, é muito importante levar em consideração tanto a nível de esgotamento e a consistência do efeito observado (P -valor) através de réplicas biológicas. A Figura 2 mostra uma trama de vulcão de resultado RBR-ID. Peptídeos que sobrepostas domínio de motivo (RRM) de reconhecimento de RNA mostram nível de esgotament.......

Discussion

Descreveremos um protocolo experimental pormenorizado para executar RBR-ID em mESCs e, com modificações apropriadas, em qualquer célula que pode incorporar 4SU em RNA. Outros tipos de células podem exigir a otimização da abordagem para garantir um suficiente sinal à relação de ruído. Além disso, enquanto o protocolo descrito neste documento concentra-se no exame do RBPs nucleares, a tecnologia de RBR-ID deve ser facilmente adaptada para diferentes compartimentos celulares, como o citoplasma ou organelas específicas, pelo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
KnockOut DMEM	Fisher Scientific	10829018
Soro fetal bovino, qualificado, origem americana	Fisher Scientific	26140079
solução de L-Glutamina 200	mM Sigma	G7513
Solução de penicilina-estreptomicina	Sigma	P0781
MEM Solução de aminoácidos não essenciais (100 vezes;)	Sigma	M7145
2-Mercaptoetanol	Sigma	M3148
ESGRO Fator Inibidor de Leucemia (LIF)	EMD Millipore	ESG1106
CHIR99021	Tocris	4423
PD0325901	Sigma	PZ0162
Solução de gelatina, 2% em água	Sigma	G1393
4-tiouridina	Sigma	T4509	50 mM estoque em água
Spectrolinker XL-1500	Fisher Scientific	11-992-90
Fluoreto de fenilmetanossulfonil	Sigma	78830
IGEPAL CO-630	Sigma	542334	Forma comercial de octil-fenoxi-polietoxi-etanol detergente
Iodoacetamida	Sigma	I6125
Tripsina, grau de sequenciamento	Promega	V5111
Empore disco de extração em fase sólida	3M	66883
OLIGO R3 Invertido - Resina de Fase	Fisher Scientific	1133903
Benzonase	Sigma	E8263	Nuclease de alta pureza
Sonic Dismembrator Modelo 100	Fisher Scientific	descontinuado	atualizado com FB505110
Acetonitrila de grau HPLC	Fisher Chemical	A955-4
Água de grau HPLC	Fisher Scientific	W6 4
TFA	Fisher Scientific	A11650
Bicarbonato de amônio	Sigma	A6141
Ácido acético	Sigma	49199
Ácido fórmico	Sigma	F0507
ReproSil-Pur 18-AQ	Dr. Maisch GmbH HPLC	r13.aq.0003	Material de embalagem para coluna de HPLC
Capilar para nano colunas (75 µ m)	Molex	1068150017
software MaxQuant	Instituto Max Planck de Bioquímica		Pode realizar o alinhamento cromatográfico de várias execuções de MS