Her beskriver vi en felles metode for å indusere kroniske skader i mus av fôring av kolin-mangelfull og ethionine-supplert (CDE) diett. Viser vi helseovervåking, lever perfusjon, isolasjon og bevaring. En gang løpet av seks uker kan informere om skader, pathohistology, fibrosis, provoserende, og lever stamfar celle svar.
Kronisk leversykdom som hepatitt, alkoholholdige leversykdom eller alkoholfrie fatty leversykdom, er preget av stadige betennelse, progressiv ødeleggelse og regenerering av hepatic parenchyma, lever stamfar cellen spredning og fibrose. Sluttstadiet til hver kronisk leversykdom er skrumplever, en stor risikofaktor for utvikling av leverkreft. For å studere prosesser regulere sykdom innvielsen, etablering og progresjon, brukes flere dyr modeller i laboratorier. Her beskriver vi en seks ukers tid kurs av kolin-mangelfull og ethionine-supplert (CDE) musemodell, som medfører mate seks – uke gamle mannlige C57BL/6J mus med kolin-mangelfull chow og 0,15% DL-ethionine-supplert drikkevann. Overvåking av dyrehelse og en typisk kroppen vekt tap kurve er forklart. Protokoll viser brutto undersøkelse av en CDE-behandlet leveren og blod samling av cardiac punktering for påfølgende serum analyser. Neste, lever perfusjon teknikk og samling av ulike hepatic lobes for standard evalueringer er vist, inkludert leveren histology vurderinger av hematoxylin og eosin eller Sirius røde stainings, immunofluorescent oppdagelsen av hepatic celle populasjoner og transcriptome profilering av leveren microenvironment. Denne musemodell er egnet for studerer inflammatorisk, fibrogenic, og lever stamfar dynamics indusert gjennom kronisk leversykdom og kan brukes til å teste potensielle terapeutiske agenter som modulere prosessene.
Leveren er den største kjertel metabolske organet av kroppen og har mange komplekse funksjoner. Nøkkelroller for leveren inkluderer fordøyelsen, metabolisme, avgiftning, lagring av viktige næringsstoffer, produksjon av blodplasma protein komponenter og immunitet formidlet gjennom bosatt makrofager eller Kupffer celler. Leveren har en stor evne å regenerere selv om 70-90% av sin totale masse går tapt. Ved akutte skader, som sett etter en delvis hepatectomy eller acetaminophen forgiftning, sprer de gjenværende sunn hepatocytter for å reparere skaden i en svært koordinert prosessen1. Men når hepatocytter er kronisk skadet på grunn av langsiktig virusinfeksjon, alkoholholdige eller alkoholfrie fatty leversykdom, den inflammatoriske microenvironment utløser aktivering av fibrose-kjøring nedsatt stellate celler og spredning av leveren progenitor celler (LPCs) til å skille ut cholangiocytes eller hepatocytter2,3,4,5. Nøyaktige opprinnelsen, differensiering skjebnen til LPCs, deres bidrag til leveren gjenfødelse, og hepatocarcinogenesis har vært tema for intens debatt og mest sannsynlig avhenge skade alvorlighetsgraden og kontekst2. Hendelsesrekkefølgen tidlig fornyelse-assosiert diskuteres også kontroversielt, med noen etterforskere sier at hepatisk stellate celle aktivering og matrix remodeling er avgjørende for generering av en LPC-favoriserer nisje6, mens andre rapporten at LPC ekspansjon og såkalte Ductular reaksjonen er nødvendig for å utløse fibrogenesis7. Det er mange dyr modeller å studere bestemte aspekter av skader og gjenfødelse, i et forsøk på å forstå alle de underliggende faktorene som regulerer sykdomsprogresjon og til slutt utvikle nye behandling strategier for pasienter8.
Kolin-mangelfull og ethionine-supplert (CDE) kosttilskudd modellen ble opprinnelig utviklet for bruk i rotter og senere endret til kroniske skader induksjon i mus9,10. Kosttilskudd mangel på kolin resulterer i svekket montering og sekresjon av svært lav tetthet lipoproteiner. Kombinert med hepatocarcinogen DL-ethionine, dette område fører til overdreven hepatic fett lasting, kontinuerlig betennelse, periportal fibrose, LPC svar og langsiktige hepatocellulært karsinom utvikling11,12 . Men viktigst, annen mus stammer viser karakteristiske mønstre av provoserende, fibrogenic og LPC svar dynamics13. Denne protokollen beskriver kroniske skader induksjon i C57BL/6J mus, de mest brukte innavlede musen belastning.
I kronisk leversykdom forskning inkluderer typisk analyser histologiske vurderinger av hematoxylin og eosin samt Sirius røde flekker å visualisere kollagen depositions, immunohistochemical eller immunofluorescent påvisning av hepatic celle populasjoner, og transcriptomic analyser av den lever microenvironment som orkestrerer indusert mobilnettet endringene gjennom komplekse vekstfaktor og cytokin nettverk14,15,16,17 , 18.
Det er en av de viktigste bidragsyterne sykelighet og dødelighet verdensomspennende kronisk leversykdom er ofte en stille sykdom med de fleste pasienter være asymptomatiske. Kronisk alcoholism og hepatitt C virusinfeksjon er de viktigste årsakene. Kroniske skader er preget av hepatic betennelse, fibrose og i alvorlige tilfeller skrumplever, karsinom og til slutt leversvikt. Det er ingen kur tilgjengelig og selv om store fremskritt har blitt gjort å forstå mekanismer for leversykdom, nye terapeutiske veier fortsatt r…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australia (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Forfatterne vil gjerne takke Curtin helse Innovation Research Institute ansatte for teknisk assistanse.
Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |