Derivação livre de integração de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos com Laminin 521 Matrix

Summary

A derivação robusta das células do tronco pluripotente humano induzido (hiPS) foi conseguida utilizando a reprogramação mediada por vetores de vírus Sendai não-integrante (SeV) de fibroblastos dérmicos. A manutenção da célula hiPS e a expansão clonal foram realizadas usando condições de cultura sem xeno e quimicamente definidas com matriz de laminina humana recombinante 521 (LN-521) e meio Essential E8 (E8).

Abstract

As condições Xeno-free e totalmente definidas são parâmetros fundamentais para a geração robusta e reprodutível de células de vástago pluripotente induzido por humanos (hiPS) homogêneas. A manutenção das células HiPS em células alimentadoras ou matrizes indefinidas são susceptíveis a variantes do lote, contaminação patogênica e risco de imunogenicidade. A utilização da matriz de laminina humana recombinante definida 521 (LN-521) em combinação com formulações de meios sem xeno e definidas reduz a variabilidade e permite a geração consistente de células hiPS. O vetor de vírus Sendai (SeV) é um sistema não-integrante baseado em ARN, evitando assim preocupações associadas ao potencial efeito disruptivo sobre a integridade do genoma que os vetores de integração podem ter. Além disso, esses vetores demonstraram eficiência relativamente alta na reprogramação de fibroblastos dérmicos. Além disso, o envio enzimático de células únicas de células facilita a manutenção homogênea de células HiPS sem experiência substancial antes de troncoCultura. Aqui descrevemos um protocolo que foi amplamente testado e desenvolvido com foco na reprodutibilidade e facilidade de uso, proporcionando uma maneira robusta e prática de gerar células HiPS humanas definidas e sem xeno de fibroblastos.

Introduction

Desde a primeira derivação das linhas celulares hiPS por Takahashi et al. ^{1 , 2} , as células HiPS forneceram uma ferramenta útil para modelagem de doenças, descoberta de drogas e como material de origem para a geração de terapias celulares em medicina regenerativa ³ . A cultura de células hiPS tem sido dependente da co-cultura com células alimentadoras de fibroblastos ^{4 , 5} ou em Matrigel ⁶ e com formulações de mídia contendo soro bovino fetal (FBS). As variações de lote para lote são uma conseq....

Protocol

A coleção de material do paciente e derivação de células HiPS é aprovada pelo Ethics Review Board, em Estocolmo, 28 de março de 2012, número de registro: 2012 / 208-31 / 3. As etapas de cultura de células devem ser realizadas em gabinetes de segurança de biossegurança, salvo indicação em contrário. Sempre pratique técnicas de manuseio estéril ao trabalhar com células. Permita que a mídia, placas e reagentes atinjam a temperatura ambiente antes de começar. Incubar células a 37 ° C, 5% de CO ₂ com alta umidade.

1. Isolamento de Fibroblastos Humanos por Biopsia Dermal

1. Preparações de meio de cultura, enzimas dige....

Results

Da biópsia às células hiPS

Todo o processo, desde a biópsia até as células hiPS estabelecidas, sem vetor de reprogramação e pronto para caracterização, leva aproximadamente 16 semanas ( Figura 1 ). Uma linha de tempo mais detalhada é especificada na Figura 2A . Aproximadamente 4 semanas são necessárias para estabelecer e expandir as culturas de fibroblastos. As primeiras.......

Discussion

O resultado esperado deste protocolo é a geração bem-sucedida de várias linhas de células hiPS derivadas de clonação. Importante, o método para a manutenção e expansão de células estabelecidas de hiPS aqui descritas é confiável e pode ser realizado com pouca experiência prévia de cultura de células-tronco. A migração de célula única enzimática com ROCKi juntamente com a matriz LN-521 é conhecida por manter as células como cariotípicamente normais, pluripotentes e prontamente capazes de se diferenciar, evitando a heterog.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Life Technologies	171105-041	Digestão por biópsia
Colagenase	Sigma	C0130	Digestão por biópsia
Gelatina	Sigma	G1393	Matriz de fibroblastos
IMDM	Life Technologies	21980002-032	Meio de fibroblastos
FBS	Invitrogen	10270106	Meio
de fibroblastosPenicilina/Estreptomicina	Life Technologies	15070-063	Antibiótico
Essencial 8 meios	ThermFisher Scientific	A1517001	iPS meios de cultura de células
LN-521	Biolamina	LN521-03	matriz de cultura de células iPS
TrypLE select 1X	ThermoFisher Scientific	12563011	Reagente de dissociação
Inibidor de rho-quinase Y27632	Millipore	SCM075	Inibidor de Rho-quinase (ROCKi)
CytoTune - kit de reprogramação iPS 2.0	Life Technologies	A1377801	Vetor de reprogramação de vírus Sendai
35 mm placa de cultura de tecidos	Sarstedt	83.3900.300	Placas
cultura de tecidos de 60 mm	Sarstedt	83.3901.300	Placas de cultura
24 poços	Sarstedt	83.3922.300
Balões de cultura de células T25	VWR	734-2311	Tubos de cultura
células de 15 mL	Tubos de 430791 Corning		Tubos de centrífuga
Tubo de 1,5 ml	Eppendorf	0030123.301	Tubo de 1,5 mL
CoolCell cell LX	Biocision	BCS-405	Recipiente de congelamento
DMSO	Sigma	D2650-100ml	Congelamento de fibroblastos
Cryovials 1,8 mL	VWR	479-6847	Cryovials
PSC Cryopreservation Kit	Gibco	A2644601	PSC CryomediumRevitaCell suplemento
Tripsina-EDTA (0,05%)	ThermoFisherScientific	25300054	Enzima de dissociação de fibroblastos
DMEM/F12	Life Technologies	31331-028	Diluente
DPBS	Life Technologies	14190-094	PBS
HBSS	ThermoFIsher Scientific	14025-050	Hemocitômetro de preparação para biópsia
	Sigma	BRAND, 718920	Contagem de células
Parafilme	VWR	291-1213	Placas de vedação para armazenamento