Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ביטוי של אנטיגנים אקסוגני חיסון ה-BCG Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס דרך קישוט משטח שאינו גנטי עם מערכת אבידין-ביוטין

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56421
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine and Vancouver Costal Health Research Institute, University of British Columbia, 2Institute of Biomedical Technology, University of Tampere

Summary

טכניקה הרומן לתצוגה מהירה אנטיגן על משטח חיידקי מוצג, שיכלול משטח biotinylation ואחריו חשיפה חלבונים עניין בפיוז'ן עם אבידין monomeric. טעינת BCG עם אנטיגנים שנבחר בהצלחה משפר את immunogenicity שלה, רומז כי הקליגרפיות יכול להחליף את הגישות המסורתיות גנטי.

Abstract

השחפת (TB) היא מחלה זיהומית קשה, חיסון זמין רק מ חיידקי סטרפטקוקוס בוביס bacillus Calmette-Guérin (BCG) הינו בטוח ויעיל להגנה נגד חמור טרה-בתים דלקת קרום המוח ילדים, כמה צורות של המופץ טרה-בתים, אך אינו מצליח להגן נגד שחפת, וזו הצורה השכיחה ביותר של המחלה. מבטיח אסטרטגיות לשיפור BCG כעת להסתמך גם על השינוי שלה עם הגנים קידוד immunodominant מ. שחפת (Mtb)-אנטיגנים ספציפיים ו/או קומפלמנטציה עם הגנים קידוד שיתוף גורמים המעודדים אנטיגן הצגת תאים. מגבלות הגדולות גישות אלה כוללים יעילות נמוכה, יציבות נמוכה לרמת הבטיחות של וקטורים ביטוי לא בטוח. במחקר זה, אנו מציגים גישה אלטרנטיבית לשיפור החיסון, אשר מורכב קומפלמנטציה BCG עם חלבונים אקסוגני של עניין על פני השטח של חיידקים, במקום טרנספורמציה עם פלסמידים קידוד הגנים המתאימים. ראשית, חלבונים עניין באים לידי ביטוי פיוז'ן עם אבידין monomeric ב רגיל e. coli מערכות ביטוי אז נהגו לקשט את פני השטח של biotinylated ה-BCG. ניסויים בבעלי חיים באמצעות משטח BCG מעוטרים עם הפונדקאית אובלבומין אנטיגן מדגימים כי החיידק ששונה הוא מלא immunogenic, מסוגל גרימת תגובות תא T ספציפי. בסך הכל, הנתונים המוצגים כאן בחום תמיכה של הרומן שיטה יעילה לשינוי הצורה של החיסון BCG הנוכחי מחליף את הגישה המקובלת מפרך של קומפלמנטציה עם חומצות גרעין אקסוגני.

Introduction

אסטרטגיות שונות הוצעו כדי להחליף את החיסון הנוכחי שחפת BCG, כולל חלבון אדג'וונט מערכות, טכנולוגיות הווקטורי ויראלי, זנים M.tb בשידור חי הקלוש של זנים מהונדסים BCG, גם להחדיר גנים יתר ביטוי אנטיגנים BCG באים לא מספיק לידי ביטוי במהלך זיהום1 או שחרור מהיר למוט אוכף-אנטיגנים ספציפיים מציג BCG2. עם זאת, הנדסה גנטית, פונה מחסומים רבים כולל רמת לא בטוח בטיחות התהליך זמן רב, יעילות נמוכה של הביטוי וקטורים4,5. לגבי שיפור BCG, גישה חלופית יש צורך לשפר את immunogenicity ללא צורך מסעה גנטי לא בטוח.

במחקר זה, נסקור אסטרטגיה הרומן לתצוגה של חומרים מעניינים על פני תא ה-BCG מבוססת על האינטראקציה ידועים אבידין גבוהה-זיקה עם ביוטין. גישה זו מאפשרת מצורף מהיר ולא לשחזור של recombinant אבידין פיוז'ן חלבונים על פני השטח של biotinylated BCG, אשר מקלה על מניפולציות רחבה של BCG כדי להשיג שיפור מקסימלי של יעילותה תוך שמירה על בטיחות מעולה שלה שיא, שנצפה במשך עשרות שנים של שימוש.

אבידין אהדה ביוטין הוא גבוה מאוד (Kd = 10−15 מ'), לאחר שהוקמה, המתחם ביוטין-אבידין יציב מאוד, רק יכול להיות משובשות תחת denaturing תנאים6. עם זאת, עבור סוג זה של אינטראקציה לשמש חלופה שיטה של העברת גנים, התצוגה לטווח ארוך אבל הפיכה של חומרים נדרש. לפיכך, הצגנו כאן אבידין monomeric של זיקה נמוכה (Kd = 10−7 ז) כי הפניות שחרור הפיך של חלבון מהמשטח מעוצבים BCG בלע פעם אחת בתוך אנטיגן הצגת תאים. כדי לספק הוכחה של המושג, בדקנו בשיטה זו באמצעות חלבון chimeric monomeric אבידין המתאים אנטיגן הפונדקאית נגזר אובלבומין (פשוט)7,8. התוצאות הראו כי השטח תא BCG ניתן בקלות, במהירות מעוטר אבידין monomeric פיוז'ן חלבונים, כי איגוד זה השטח BCG הינה יציב לשחזור וללא שינוי לזיהוי התפתחות חיידקים והישרדות. בנוסף, מצאנו BCG מעוטר monomeric אבידין התמזגו עם ביצית (AviOVA) יכול לגרום תגובה חיסונית הדומה לזה הנגרם על ידי BCG גנטית לבטא אותו אנטיגן גם במבחנה וגם בתוך vivo. טכנולוגיה זו תצוגה הפיך של חלבונים עניין על פני חיידקי ולכן הוא תחליף יעיל של גישות העברת גנים מסורתיים, מספקים פלטפורמה מניפולציות רחבה של BCG ויישומים נוספים בחיסון פיתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל בעלי החיים היו נשמרים על פי פרוטוקולים אושרה על ידי חיה אכפת ועדות שימוש ב אוניברסיטת בריטיש קולומביה. הניסויים היו אושרה על ידי חיה אכפת לי להשתמש ועדות, שבוצעה על פי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים. המספר רווחת בעלי חיים אבטחת הוא A11-0247.

1. דור של חלבונים פיוז'ן אבידין Monomeric לבטא פלסמידים

  1. תת לשבט monomeric אבידין רצף12 לתוך פלסמיד pDEST17 בין האתרים "CTC", "גה" המתאים 133-134bp. (כלומר, בין 6-histag pDEST17 Attr1 רקומבינציה האתר) כדי להשיג p17-Avi.
    הערה: רצף הדנ א אבידין monomeric מוצגת להלן. שלוש מוטציות שהוצגה בפראי-סוג אבידין להשיג אבידין monomeric מוצגים תווים מודגשים.
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga
  2. עיצוב תחל תמר מוקף עם AttB1 ו- AttB2 אתרים המתאימים ביצית מפוליפפטיד757-1035 (-Ab- ו H-2_Kb-מוגבל epitopes) רצף ה-DNA. פריימר רצפים הם: Attb1-ביצית
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT ו- Attb2-ביצית
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 ו- b2 Attרצפים הם מודגשים).
    1. להגביר את-PCR ביצית מפוליפפטיד757-1035 רצף ה-DNA עם תחל לעיל באמצעות פלסמיד pUC57-ביצית כתבנית.
    2. לשכפל את המוצרים PCR לתוך pDONR-221 דרך בייעודי לאתר במבחנה רקומבינציה לתגובה (למשל, BP Clonase) כדי לקבל pDONR-ביצית.
  3. להעביר את הגן עניין p17-Avi באמצעות התגובה LR Clonase כדי להשיג p17-אבי-ביצית.
    הערה: לקבלת פרטים של BP וחברת LR רקומבינציה שיבוט, עיין במדריך של היצרן.

2. monomeric אבידין פיוז'ן חלבון ביטוי, טיהור, Refolding

  1. להפוך פלסמיד p17-אבי-ביצית BL21 e. coli , זירוז 250 מ של e. coli BL21 תרבות עם IPTG (0.1 M) עבור h 3-37 מעלות צלזיוס.
  2. פירוק של חיידקים, הכללה גופות Solubilization
    1. גלולה 250 מ של תרבות BL21 המושרה על ידי 30 דקות של צנטריפוגה ב 4000 x g ו ב 4 ° C.
    2. לאסוף כדורי 10 מ"ל של פירוק מאגר (50 מ מ טריס-HCL, 150 מ מ NaCl, 6 מ' Guanidine-HCL, pH 1.5-2.5) דגירה למשך 15 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס. דגירה ללילה בטמפרטורת החדר על מסובב.
    3. צנטריפוגה 30 דקות ב- 15,000-g ו 4 ° C ותגובת שיקוע לאסוף.
  3. לטהר אבי-ביצית של תגובת שיקוע (שבר Solubilized גופות הכללה) תוך שימוש בעמודות Ni-נ. ת.
    1. לדלל הכללה גופות 1:2 עם פירוק מאגר.
    2. השתמש 4 מ"ל של ני-נ שרף לכל 250 מ של תרבות-derived גופים הכללה.
    3. רחץ 3 x 10 מ של פירוק מאגר (pH 7.0).
    4. Elute עם 10 מ"ל • תנאי מאגר (פירוק מאגר pH 7.0 עם 250 מ מ imidazole).
  4. לקפל את החלבון eluted על ידי דילול הדרגתי (1:10), vortexing מהירה במאגר טריס (pH 7.5) המכיל 1 מ מ DTT, 200 מ"מ NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0.5 מ מ Tween 80, ארגינין 500 מ מ ו-200 מ מ NaCl למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מבטל את מלח, מאגר exchange refolded חלבון מהמאגר טריס לתוך PBS עם ריכוז חלבון על פי הפרוטוקולים של היצרן.
  6. הסר אגרגטים על ידי צנטריפוגה למשך 30 דקות ב- 3,500 x g וב -4 ° C, ולאחסן את aliquots של חלבון מסיס ב-20 ° C.

3. Biotinylation משטח BCG תא

  1. לגדול BCG של מידלברוק 7H 9 מרק עם 10% OADC (חומצה אולאית, אלבומין פתרון דקסטרוז) ו- 0.05% Tween 80 ב 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה שאכר ב-50 סל ד עד OD = 0.5-1.
    הערה: BCG הוא. חיידק רמה 2 אבטחה, כל ניסויים הנוגעים BCG צריך להיעשות על אבטחה של ארון עם ציוד מגן אישי מתאים.
  2. רחץ 109 BCG 3 פעמים עם 500 µL של PBS חינם אנדוטוקסין כקרח בתוספת 0.1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). להשעות BCG גלולה ב- PBS חינם אנדוטוקסין סטרילי.
  3. מיד לפני השימוש, להכין 1 מ"ל של 10 מ מ Sulfo-NHS SS ביוטין במים מסוננים סטרילי.
    1. דגירה חיידקים עם 1 מ"ל של 0.5 מ מ של האס. אס Sulfo-NHS ביוטין בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  4. רחץ חיידקים שכותרתו 3 פעמים עם 500 µL של PBST קר קר כדי להסיר ריאגנט biotinylation לא הגיב.
    1. מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של PBST.
  5. כדי להעריך את יעילות biotinylation, כתם8 10 biotinylated BCG עם Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µL) בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
    1. דגירה חיידקים ויטראז'ים ב מ 1 ל 2% מחברים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן בדוק רמות של biotinylation על ידי ניתוח cytometry זרימה.

4. ותפקיד של Biotinylated Mycobacteria: צמיחה והישרדות

  1. לגדול BCG זנים של מידלברוק 7H 9 מרק עם 10% OADC (חומצה אולאית, אלבומין פתרון דקסטרוז) ו- 0.05% Tween 80 ב 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה שאכר ב-50 סל ד.
    1. להקליט את צפיפות אופטית (OD600) של התרבות חיידקי במשך תקופה 8 ימים.
  2. השתמש BCG-לוק (שתואר לעיל9) כדי לזהות הישרדות של חיידקים מקרופאגים.
    1. להדביק תאים RAW264.7 עם biotinylated BCG-לוק (MOI 10:1) או מטופל BCG-לוק (בקרה), מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס מעל 48 שעות תקופת זמן.
    2. לשטוף תא monolayers ואת lyse ואז עם 0.025% מרחביות לשחרר חיידקים בלע.
    3. מדד הייצור ביולומינסנציה עם לוציפראז assay מערכת luminometer.
      הערה: הפריה חוץ גופית אות היא מעידה על יכולת הקיום חיידקי. נא עיין במדריך של היצרן לקבלת פרטים של לוציפראז וזמינותו.

5. איגוד של חלבון Monomeric אבידין-Fusion למשטח BCG Biotinylated

  1. מערבבים 5 x 108 biotinylated BCG עם אבי-חלבון (סוף μg/מ"ל ב- PBS-T) לשעה בטמפרטורת החדר בפלטפורמה בשייקר.
  2. שטיפת חיידקים 3 פעמים עם 500 µL של PBST קר קר, הכתם עם הארנב אנטי-אבידין נוגדנים (אלב) (דילול מטריים, שתואר לעיל10) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן עם FITC מצומדת עז ארנב אנטי איג Ab באותם התנאים.
  3. לשטוף חיידקים 3 פעמים עם 500 µL של PBST ולנתח על ידי cytometry זרימה כדי להעריך את היקף השטח קישוט.

6. lyophilization של Mycobacteria

  1. Biotinylate חיידקים על פי 3.1-3.4 שלב biotinylated מעיל חיידקים עם אבי-ביצית לפי שלב 5.1.
  2. Aliquot biotinylated וחיידקים מצופה (108), לשטוף עם PBS ו להשעות מחדש בתקשורת lyophilization 0.5 mL (25% Sauton בינוני, 75% H2O ו- 1.5% Na-גלוטמט).
  3. להעביר חיידקים צלוחיות זכוכית ומקפיאים במקפיא-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. Lyophilize זכוכית מלא וקפוא vials 24 שעות ביממה באמצעות הקפאת מייבש.
  5. לאחסן דגימות מיובשים בטמפרטורת החדר, לשקם ב- PBS בעת הצורך.
  6. חזור על שלב 3.5 להעריך biotinylation, משטח ציפוי יציבות.

7. phagocytosis Assay

  1. לגדול 264.7 גלם תאי מקרופאג במנות תרבות בקוטר 10 ס מ ב- DMEM 5% בינוני FCS המכיל, 1% כל-גלוטמין, HEPES, חומצות אמינו שאינן הכרחיות, ו פניצילין, סטרפטומיצין עד 70-80% confluency.
  2. זרע 2 x 106 264.7 גלם מקרופאג תאים בצלחת 6-. טוב. לאפשר תאים לדבוק בן לילה-CO 37 ° C ו-5%2.
  3. צור DsRed BCG (שתואר לעיל9) מעוצבים עם אבי-ביצית (DsRed BCG-אבי-פשוט) על-פי השלבים 3.1-3.4 ו- 5.1.
  4. להדביק תאים גולמי עם DsRed BCG-אבי-ביצית או BCG טיפול DsRed-MOI 20:1 במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס.
  5. רוחצים תאים שלוש פעמים את trypsinize באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להסיר את החיידקים מנותקת חלקית.
  6. לתקן ב- 2.5% מחברים ב- PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. 3 x עם PBS וקונטה לנתח ידי cytometry זרימה.

8. וגדילת של ביצית מעוצבים Biotinylated BCG ב מקרופאגים

  1. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
    1. זרע 3 x 105 264.7 גלם תאי מקרופאג על coverslips לתוך צלחת 24-. טוב. לאפשר תאים לדבוק בן לילה-CO 37 ° C ו-5%2.
    2. להדביק תאי מקרופאג עם mycobacteria (MOI 10:1) בתקשורת תחזוקה ללא אנטיביוטיקה-37 ° C ו- 5% CO2 עבור 4 עד 24 שעות.
    3. רוחצים את התאים את trypsinize להסיר את משטח חיידקים מחובר, שאינם בלע כמו שלב 7.5.
    4. תיקון נגוע התאים ב- 2.5% מחברים ב- PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו 3 מנקי עם PBS.
    5. Permeabilize תאים במאגר חוסם/permeabilization (0.1% טריטון X-100, 3% BSA ב- PBS) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      1. שימוש נוגדן ספציפי של עניין (למשלארנב אנטי-אבידין Ab) ב 10 μg/מ"ל ב permeabilization מאגר עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו נוגדנים משניים (למשל, FITC-התיש ארנב אנטי איג) במשך 20 דקות.
    6. שטיפת תאים x 3 עם PBS, פעם אחת עם מים, ו הר בשקופיות ב 10 μL של מדיום הרכבה מימית כדי למזער זריחה photobleaching.
    7. לבחון את השקופיות על-ידי דיגיטלי מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מצויד 63 x / 1.4 תוכנית-עדשה אפוכרומטית אובייקטיבי. תמונות הרשומה באמצעות מצלמה דיגיטלית יחד על התוכנה מיקרוסקופ.
  2. Immunogold מכתים ואלקטרון
    1. זרע 2 x 106 264.7 גלם מקרופאג תאים 6-ובכן צלחות.
    2. לתקן מקרופאגים BCG נגוע עם 4% PFA במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
    3. רחץ דגימות פעמיים עם PBS.
    4. להטביע דגימות 4% נקודת התכה נמוכה agarose, מייבשים 70% אתנול.
    5. העברת דגימות שרף אקרילי, פולימריזציה ב 50 º C.
    6. לגזור 60 ננומטר מקטעים עם מיקרוטום ולאסוף סעיפים על רשתות ניקל.
    7. תווית דגימות עם 10 נוגדן אבידין μg/mL עבור h 1 בטמפרטורת החדר או 4 ° C בלילה בפתרון דגירה (PBS ו- 0.1% BSA) ולאחר מכן לשטוף עם הדגירה פתרון מצומדת זהב F(ab')2 של קטן במיוחד עז-נגד-ארנב אג (1/20) עבור h 1 בחדר טמפרטורה בפתרון הדגירה.
    8. לשטוף ובסעיף מים מזוקקים, כתם ב 2% גלוטראלדהיד, לשטוף שוב, אוויר יבש, בודקים עם מיקרוסקופ אלקטרוני.

9. התחסנות חיות ועיבוד איברים

הערה: כל השלבים צריך להיעשות על אבטחה של ארון.

  1. מעבר biotinylated וחלבון מצופה חיידקים באמצעות מחט1/2G 27 10 פעמים כדי להפוך לתא בודד ההשעיה.
  2. קח 1 x 106 חיידקים μL 100 ל- PBS חינם אנדוטוקסין, לחסן את העכברים-C57BL/6 הנשי (-Ab, H - 2 Kb, שבוע 5-6) subcutaneously ב עורפה של הצוואר.
    1. מזריקים בקרת עכברים μL 100 ל- PBS לבד.
  3. המתת חסד עכברים לחסן 20 ימים לאחר חיסון על ידי שאיפת2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם.
    1. לבודד את הטחול, להעבירו RPMI מדיה.
  4. מועכים את הטחול דרך מסננת תא 70 מיקרומטר עם פומפה מזרק 5 מ.
    1. לשטוף עם 5 מ של RPMI. צנטריפוגה (x 800 גרם, 3 דקות) כדי לבודד השעיה תא בודד.
    2. לרוקן RBC עם העכבר ביוטין חיובי בחירת ערכת עם תאים ביוטין-Ter119/Erythroid Ab.
    3. צנטריפוגה והשהה מחדש תאים ב- 10 מ"ל של שלמה RPMI (FCS 10%, 1%-גלוטמין, 1% פניצילין, סטרפטומיצין 1% ו- 50 μM 2-ME).

10. אני-Ab tetramer מכתים כדי לקבוע את התדרים של אנטיגן ספציפי CD4+ תאי T ואת ציטוקין תאיים מכתים כדי לקבוע תדרים של אנטיגן ספציפי T תאים שחרור ציטוקינים לחסן חיות

  1. Tetramer מכתים
    1. כתם splenocytes של שליטה ועכברים לחסן (~ 20 x 106 תאים) עם מצומדת-PE-Ab-tetramers323-339 ביצית (1/12.5 דילול) עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס במאגר מחייב (PBS עם FCS 2% ו- 0.1% נאן3).
    2. להוסיף AF647 CD4 Ab (1:25) ו- 7-מ (כדי לאתר תאים מתים) splenocytes למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לנתח דגימות ידי cytometry זרימה.
    4. השג 500,000 אירועים באזור חיובי CD4 כדי לקבוע את התדירות של אירועים חיוביים tetramer.
      הערה: splenocytes סה כ מוגדרים על-ידי נקודה האס/FSC האבן החשופה, תאים חיים מאת הדרה של אירועים חיוביים 7-מ ו CD4 קבוצות משנה על-ידי gating אירועים חיוביים AF647.
  2. התדירות של ציטוקין תאיים ספציפיים אנטיגן, שחרור תאי T
    1. העברת כ 1 × 107 splenocytes לתוך 4 מיליליטר RPMI מלאה, במדיום. ובכן שש צלחות עם או בלי ביצית רקומביננטי (10 µg/mL), תקופת דגירה של 16 h.
    2. פנקו תאים עם Brefeldin (1:1, 000) עבור h 5 נוספים.
    3. לשטוף עם PBS ובכפוף ציטוקין תאיים מכתים כדלקמן:
      1. כתם דגימות תאים עם PE-CD8 או PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 במאגר מחייב) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
      2. לתקן ב 4% PFA בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
      3. Permeabilize באמצעות פתרון permeabilization, על פי הוראות היצרן.
      4. לשטוף את התאים ואת תווית עם AF647 מצומדת IFN-γ Ab (1:50) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      5. רוחצים התאים את נושא ניתוח cytometry זרימה כמתואר לעיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עם כללי בהליכים המתוארים לעיל, נבחנה הכדאיות של biotinylation משטח BCG וקישוט עם אנטיגן הפונדקאית ביצית. Immunogenicity של BCG שהשתנה היה אז נבדק בתוך vivo. השטח חיידקי סומן בקלות עם ביוטין לתצוגה מהירה של אנטיגנים chimeric אבידין ללא כל שינוי לזיהוי פנוטיפים חיידקי. BCG ששונה וכתוצאה מכך ביעילות בליעתו על ידי אנטיגן הצגת תאים, יכול לגרום תגובה חיסונית ספציפית ביצית בעכברים.

דור של פלסמידים פיוז'ן אבידין monomeric, חלבונים
הביטוי פלסמיד p17-אבי הופק כתואמות שער מתודולוגיה לשמש כדי לייצר חלבונים פיוז'ן אבידין monomeric. ביצית היה משובטים לתוך p17-אבי, שבאה לידי ביטוי e. coli, ולאחר מכן מטוהרים, refolded כפי שתואר לעיל (איור 1).

ביוטין מייחסת ביעילות השטח חיידקי, אינה משפיעה על התפתחות חיידקים או הישרדות
חיידקים הודבקו תוויות עם ריכוזים שונים (0-1 מ מ) של ביוטין, מיטה כדי לבחון את היעילות של biotinylation פני השטח על פי פרוטוקולים לעיל. ניתוח cytometry זרימה הראה שינוי מוחלט של קרינה פלואורסצנטית היסטוגרמה של חיידקים המסומנת ביוטין 0.5 מ מ (איור 2), ריכוז זה נעשה שימוש לאורך כל המחקר הזה ליצירת חיידקים biotinylated. בשלב הבא, בחן את ההשפעה של שינוי פני השטח חיידקי על פנוטיפ חיידקי ומצאתי biotinylated ושליטה לא מטופל BCG המוצגים פרופיל צמיחה דומה פרק 8 ימים (איור 3 א). BCG לבטא לוציפראז (BCG-לוק)9 שימש כדי לבחון הישרדות חיידקי ב מקרופאגים. הפריה חוץ גופית אותות. מצביע על יכולת הקיום חיידקי נרשמו מעל 48 ח התוצאות המתקבלות הראה פרופילים דומה של ירידה הדרגתית הכדאיות בין חיידקים biotinylated ושליטה (איור 3B). לסיכום, נתונים אלה מצביעות בבירור על biotinylation משטח חיידקי זה אינו משפיע על התפתחות חיידקים או הישרדות בתוך המקרופאגים, אשר חשוב מכיוון הישרדות מוגברת ב מקרופאגים יכול להיות עלייה בהתקפה אלימה חיידקי.

היעילות של חיידקי הקליגרפיות
חיידקים Biotinylated היו מצופה ביצית פפטיד אנטיגן ב פיוז'ן עם אבידין monomeric, על פי פרוטוקולים לעיל. ניתוח cytometry זרימה הראו רמות מינימלי של ביצית מחייב את החיידקים הלא-biotinylated (MFI = ± 8.31 0.42, איור 4A, החלונית העליונה) רמות משמעותיות של ביצית מחייב את החיידקים biotinylated (MFI = 54.67 ± 4.98) בהשוואה לבקרת חיידקים (MFI = 5.92 ± 0.22, איור 4A, להוריד לוח).

היציבות של הקליגרפיות BCG
מאז קונבנציונאלי חיסונים BCG בשידור חי מנוסחות בתור מיובש אבקות, שאלה חשובה שהתעוררו במהלך מחקר זה היה היציבות של BCG ששונה לאחר ליופיליזציה שיחזור, אחסון בקירור או בטמפרטורת החדר. לכן, אנו בחן משטח התצוגה של אבי-ביצית ב lyophilized BCG אבי-ביצית (משטח מעוטרים עם אבי-ביצית), ב לשידורי ההכנות חיידקי. התוצאות (איור 4B) הראו כי רמות של אבי-ביצית על פני החיידק נותר יציב וחודש לזיהוי לאחר lyophilization ואחסון הטמפרטורה בחדר לעומת ההכנות BCG אבי-ביצית טריים, אשר הוכיחה את השטח הזה שיטת עיטור מתאים פיתוח החיסון.

מקרופאג פנוטיפ אינה מושפעת הקליגרפיות חיידקי
כדי לראות אם זו מתודולוגיה הקליגרפיות מפריע חיידקי כניסתו התאים המארחים, השתמשנו תאים RAW264.7 ו- DsRed חיידקים9 לבצע וזמינותו של phagocytosis המתוארות לעיל בפרוטוקול. איור 4C הראה שלפני השטח חיידקי מעוצבים BCG שאין הפרעה משמעותית עם כניסה חיידקי (22.5 ± 1.57%) בהשוואה ללא ציפוי פראי סוג BCG (24.47 ± 1.18%) המציין כי הקליגרפיות של BCG יש השפעה על מקרופאג פנוטיפ.

אבידין פיוז'ן חלבונים לנסוע intracellularly, לשפה משותפת עם מולקולות MHC
לבחון הגורל של אבי ביצית-מעוצבים BCG בתוך המקרופאגים, תאים RAW חסיד היו נגועים, שנבדקו על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, כפי שמתואר לעיל בפרוטוקול. תמונות שהושג (איור 5A) הראה כי אבי-OVA היה לא רק על פני השטח חיידקים, אבל גם מנותק ובהווה translocated אל הציטופלסמה הרחוקים של חיידקים. כדי לוודא עוד יותר תוצאה זו, ביצענו של immunogold מכתים הניסוי ואת התמונות שהתקבלו הראו בבירור כי אבי-ביצית אנטיגנים נמצאים רק על פני השטח BCG, אך ניתן גם לנתק מעל פני השטח BCG, לחצות את הקרום phagosomal, ולנסוע לכיוון ציטוזול (איור 5B). לבחון עוד יותר החיידק אבי-ביצית ומעוצבים מסוגלים מסירת המטען הדם שלהם מסלול מצגת אנטיגן, מקרופאגים היו נגועים עם אבי-ביצית BCG, כמפורט בפרוטוקול, נתון ניתוחים קונפוקלי. תוצאות (איור 6A) הראו כי היה colocalization של אבי-ביצית עם מולקולות-A, רומז כי חלבון כימרי אבידין מנותק, translocated כדי אנטיגן הצגת תאים איפה שהם טעונים על מולקולות MHC II. התוצאות הראו גם אבי-ביצית פפטיד. רגישה במשותף עם מחלקה אני מולקולות בתוך phagosomes BCG כשהוא מוכתם H-2_kb (איור 6B), אשר הראו כי יש פוטנציאל המצגת של אבי-ביצית אנטיגן כדי CD8+ T תאים על-ידי מקרופאג. נתונים אלה מצביעים על כי ברגע משטח המעוצבים חיידקים הזן מקרופאגים, האנטיגנים מסוגלים תנועה לעבר המסלולים במצגת אנטיגן.

משטח חיידקים מעוצבים הם באופן מלא immunogenic
לבחון האם משטח BCG מעוצבים הוא מסוגל גרימת עכברים C57BL/6 תגובה חיסונית ספציפית בתוך vivo, היו חיסון עם PBS לבד (בקרה), פראי-סוג BCG, אבי-ביצית מעוצבים BCG ו BCG גנטית טרנספורמציה עם פלסמיד להביע דומה אנטיגן ביצית. עכברים לחסן היו שהקריבה עצמה 20 ימים מאוחר יותר, התדרים של CD4 ספציפיים ביצית+ T תאים ותאי T ספציפי ביצית שחרור ציטוקינים אותרו, לפי הפרוטוקול. תוצאות (איור 7 א-ב) הראו שיעור גדול יותר של CD4 ספציפיים ביצית+תא T בתגובה בבעלי חיים חיסון עם BCG מצופה עם אבי-ביצית בהשוואה BCG WT. BCG גנטית שונה כדי לבטא ביצית הראה תגובה חיסונית דומה BCG אבי-ביצית (איור 7). נתונים אלה הראו כי שיטת הקליגרפיות חיידקי הוא מסוגל לגרום הרחבה משמעותית של אנטיגן CD4 ספציפי+ T תאים לבין מידת תא T בתגובה אינדוקציה משולה BCG מהונדסים גנטית לבטא של ביצית דומה אנטיגן.

מאז ציטוקינים תאיים גם אינדיקטורים חשוב של אנטיגן ספציפי תא T תגובות, ציטוקינים תאיים מכתים (ICS) הניסויים נערכו להעריך עוד יותר תגובות חיסוניות תא T על-ידי קביעת ביטוי ולא תדריהם של ציטוקינים אפקטור בבעלי חיים חיסון עם ביצית מעוצבים חיידקים ובקטריות גנטית טרנספורמציה עם ביצית הבעת פלסמיד. אנחנו בחן רמות של IFN-γ שחרור, אשר הוא מחוון הידוע של תגובת הגנה נגד חיידקים תאיים11. הפגנו כי הצלחנו לזהות רמות דומות של ביצית ספציפיים IFN-γ שחרור CD4+ תאי חיסון עם חיידקים משטח מעוטר ביצית (BCG-אבי-ביצית וביצית BCG-p19-אבי-) בהשוואה חיות חיסון עם חיידקים בעלי חיים גנטית לבטא ביצית (BCG-p19-פשוט) (איור 8A). חשוב לציין, היינו גם מסוגלים לזהות תדרים גבוהים יותר באופן משמעותי של IFN-γ בהפקת CD8+ T תאים בבעלי חיים חיסון עם BCG-אבי-ביצית בהשוואה חיות חיסון עם BCG גנטית לבטא ביצית (איור 8 ב'-C) אשר מדגים ביוטין-אבידין מתווכת משטח התצוגה של אנטיגן מתודולוגיה יכול ביעילות להחליף BCG טרנספורמציה עם חומצות גרעין.

Figure 1
איור 1: בנייה של רקומבינציה שיבוט פלסמיד לייצור של חלבונים פיוז'ן אבידין. (א) קטע ג'ין קידוד עבור אבידין monomeric היה מסונתז באתרים מגבלת NdeI ו- NotI, subcloned לתוך pDEST17 בין היסטידין 6 x בקלטת שער ליצירת פלסמיד p17-Avi. ביצית פפטיד252-345 DNA רצפים הסתיים עם attB אתרים היו משובטים לתוך pDONR221. לאחר מכן, ביצית הגנים היו subcloned לתוך p17-Avi. התמונה לעריכה, הודפס מחדש באישור PLOS ONE12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: היעילות של BCG biotinylation. BCG היה biotinylated עם ריכוז שונים של NHS-SS-ביוטין למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואז המסומנת FITC-streptavidin, נותחו על ידי cytometry זרימה. התוצאות מוצגות כחלק היסטוגרמות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק ומייצג הגרף הוספה זאת אומרת ± SEM של עוצמות קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) יקוזז 3 ניסויים עצמאית. * P < 0.05; * * P < 0.01; P < 0.001. התמונה לעריכה, הודפס מחדש באישור PLOS ONE12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: Biotinylation משטח BCG לא השפיע על הצמיחה שלה או את הישרדותה ב מקרופאג. (א) ביו-BCG ושליטה ללא תווית-פראי-סוג BCG גדלו ב- 7 שעות מלאה מדיה 9, שכפול היה במעקב במשך תקופה 8 ימים. התוצאות באים לידי ביטוי עקומות גדילה, קרי, אומר ספיגת על 600 ננומטר כ פונקציה של זמן ± SEM של 3 ניסויים עצמאית. (B) מקרופאגים היו נגועים ביו-BCG-לוק או לשלוט BCG ללא תווית-לוק של פרקי זמן שצוין ולאחר מכן תא lysates היו מוכנים, לבדיקה לתהליך הביולומינציה לזהות חיידקים קיימא. תוצאות באים לידי ביטוי אומר יחידות קלות יחסית (RLU) ± SEM של 3 ניסויים עצמאית. התמונה לעריכה, הודפס מחדש באישור PLOS ONE12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: אבי-ביצית מחייב את ביו-BCG ויציבות שלה. (א) ביו-dsRed-BCG (חיידקים לבטא פלואורסצנטי אדום, שתואר קודם לכן9) השליטה הלא-biotinylated dsRed-BCG היו מעורבבים עם אבי-ביצית בטמפרטורת החדר במשך 1 h ואת מידת ביצית איגוד הוערך על ידי צביעת משטח עם נוגדן אנטי אבידין ארנב וארנבת עזים-FITC אנטי איג (FL1). הדגימות היו נשטפים, נותחו על ידי cytometry זרימה. התוצאות מוצגות כחלק היסטוגרמות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק, ערכי איגוד SEM של MFI של ביו-BCG-AviOVA זאת אומרת ± המתקבל 3 ניסויים עצמאית. ביו Lyophilized (B)-BCG מצופה עם אבי-ביצית, ומדברי אבי-ביצית-ביו-BCG היו שכותרתו נותחו על ידי cytometry זרימה כמתואר בא הנתונים המוצגים הם נציג של 3 ניסויים עצמאית, ערכי איגוד SEM של MFI של אבי-ביצית-ביו-BCG זאת אומרת ± המתקבל 3 ניסויים עצמאית. מקרופאגים RAW (ג) היו נגועים DsRed BCG-אבי-OOVA או DsRed-BCG עבור 24 שעות ב 37 º C. דוגמאות ואז נשטף, שטופלו טריפסין, קבוע, ולא נותחו על ידי FACS. תוצאות מבוטא היסטוגרמות פלואורסצנטי אדום, אשר משקפים את היקף phagocytosis. הערכים מצביעים על האחוז הממוצע ± SEM של תאים בליעת BCG המתקבל 3 ניסויים עצמאית. התמונה לעריכה, הודפס מחדש באישור PLOS ONE12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: אבי-ביצית מנותק ממשטח BCG ועברנו את הקרום phagosomal לכיוון ציטוזול. (א) תאים חסיד RAW על שער גולשת היו נגוע מעוצבים ביצית dsRed-BCG עבור 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, לאחר מכן קבועה/permeabilized, צבעונית עם נוגדן אנטי אבידין ארנב וארנבת עזים-FITC אנטי איג. דוגמאות רכוב על שקופיות מיקרוסקופ, נותחו על ידי קונפוקלית דיגיטלי. סימנים אדומים מציינים את המיקום של ה-BCG ומשקפים אותות ירוק הלוקליזציה של אבי-ביצית. הקו המקווקו מציין בגבולות התא מקרופאג הימנית לוח הוא 4 X הגדלה של הקדמי שמוצג בחלונית השמאלית התחתונה. (B) סעיפים דקים של תאים RAW BCG-AviOVA נגוע היו קבוע עם paraformaldehyde, מודגרות ברצף עם נוגדן אנטי אבידין וארנבת עז מצומדת זהב אנטי איג להמחיש אבי-ביצית ובחן עם מיקרוסקופ אלקטרוני. ההגדלה של 12,000 X מוצג. ראשי חץ מצביעים על אבי-ביצית לזהויות BCG משטח וייצא מעבר קרום phagosome. הדימויים המוצגים הם נציגים של שני ניסויים עצמאית. התמונה לעריכה, הודפס מחדש באישור PLOS ONE12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: אנטיגן אבידין-fusion שותף מקומי עם MHC מחלקה II, מחלקה אני מולקולות. תאים BMA3.1A7 חסיד, קו תא מקרופאג העכבר, נדבקו בנגיף ביצית מעוצבים GFP-BCG (לבטא פלורסנט, שתואר לעיל ירוק9) במשך 4 שעות ואז מגורה ואז עם IFN-γ עבור 24h. התאים היו קבועים/permeabilized מוכתם נוגדן אנטי אבידין ארנב, אלקסה 594 ארנב אנטי איג אלקסה 647 עכבר עכבר אנטי-A (A) או אלקסה 647 עכבר עכבר אנטי H-2_kb (B). דוגמאות רכוב על שקופיות מיקרוסקופ, נותחו על ידי קונפוקלית דיגיטלי. אותות ירוק לציין את המיקום של ה-BCG-GFP ומשקפים אותות אדום הלוקליזציה של אבי-ביצית. הסימנים הכחולים לציין את המיקום של מחלקה MHC II או מחלקה אני מולקולות. הקו המקווקו מציין את תחום העניין. ראשי חצים מצביעות על אבי-ביצית colocalization עם מולקולות MHC. הראו תמונות הם נציגים של שני ניסויים עצמאית. התמונה לעריכה, הודפס מחדש באישור PLOS ONE12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: In vivo CD4+ תא T בתגובה BCG מעוצבים ביצית. C57BL/6 עכברים היו מזריקים subcutaneously עם משטח BCG מעוטר ביצית, BCG יאומתו פראי-סוג, PBS (בקרה), BCG גנטית טרנספורמציה לבטא ביצית (BCG-p19-פשוט), או טרנספורמציה עם שליטה פלסמיד, משטח מעוטרת (אבי-ביצית BCG-p19-AviOVA). לאחר תקופה של 20 ימים, היו splenocytes שהוכנו על טחולים של חיות לאללה, מוכתם מצומדת-PE-Ab-ביצית323-339 tetramers (א) ואחריו נוגדן AF647-CD4 ו 7-מ. דוגמאות ואז נותחו על ידי cytometry זרימה. תוצאות מבוטא מגרשים נקודה שתיים-פרמטר להציג התדרים הממוצע ± SEM של tetramer אירועים חיוביים CD4+ אוכלוסייה של שתי חיות/קבוצה. הנתונים המוצגים הם נציג של 3 ניסויים עצמאית (סך של עכברים שישה נבחנו עם דגימות תאים כל עכבר הערכה שהפקידים). הנתונים גרפים (B) באים לידי ביטוי אומר SEM ± ערך המספר המוחלט (בסכום של 500,000 אירועים) של ביצית tetramer CD4 ספציפי+ תאי בין שתי חיות/קבוצה 3 ניסויים עצמאית. * P < 0.05; * * P < 0.01; P < 0.001. התמונה לעריכה, הודפס מחדש באישור PLOS ONE12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: תדרים של תאי T לשחרר ציטוקינים בתגובה אבי-ביצית מצופה חיסון ה-BCG. Splenocytes של עכברים חיסון עם PBS, BCG פראי-סוג, משטח BCG WT מעוצבים עם אבי-ביצית, BCG-p19-ביצית BCG-p19-AviOVA היו מגורה עם חלבון רקומביננטי ביצית עבור 16 h ואחריו טיפול h-פרק 5 עם תאים א Brefeldin היו אז שטף ו מוכתם קודם עם PE-Cy7 anti-CD4 (A) או נוגדן anti-CD8 PE (B) ואז נוגדן anti-IFN-γ AF647. התאים היו לאחר מכן שטף, נותחו על ידי cytometry זרימה. תוצאות באים לידי ביטוי כפי נקודה פרמטר שני מגרשים להציג ± תדרים הממוצע SEM של IFN-γ תא לעשיית קבוצות משנה ב- CD4+ ו CD8+ אוכלוסיות של שתי חיות/קבוצה. הנתונים המוצגים הם נציג של 3 ניסויים עצמאית (סך של עכברים שישה נבחנו עם דגימות תאים כל עכבר הערכה שהפקידים). הנתונים גרפים (C) מבוטא הממוצע של ± מספר מוחלט SEM של IFN-γ שחרור CD4+ T תאים (הגרף השמאלי) או IFN-γ שחרור CD8+ T תאים (נכון גרף) בין שתי חיות/קבוצה 3 ניסויים עצמאית. * P < 0.05; * * P < 0.01; P < 0.001. התמונה לעריכה, הודפס מחדש באישור PLOS ONE12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנחנו דיווחו במחקר זה בגישה הלא גנטי לתצוגה מהירה ויעילה של חלבונים אקסוגני במשטח BCG להוסיף אנטיגנים ספציפיים או מאפיין פונקציונלי מסוים צפוי לשיפור ביעילות immunogenicity של החיידק. להדגים כי השטח תא BCG יכול להיות בקלות biotinylated לקישוט משטח מיידי עם אבידין פיוז'ן חלבונים. ניתן לבצע את ההליך הכולל בתוך 2 h, בזמן שינוי גנטי, מבחר של שיבוטים חיובית דורשת 2-3 חודשים של זמן השהיה. שינוי פני השטח אינה משפיעה על התפתחות חיידקים והישרדות. חיידקים מעוטרים עם אנטיגן הפונדקאית ביצית הצליחו לספק אנטיגן לתוך השביל מצגת אנטיגן, המושרה תגובה חיסונית ספציפית אין ויוו, אשר הוערך על ידי מבחני cytometry זרימה כולל MHC tetramer מכתים, ציטוקין תאיים מכתים (ICS). חשוב מכך, ויוו מחקרים הראו בבירור כי חיידקים משטח המעוצבים הצליחו לגרום רמות דומות של התגובה החיסונית בהשוואה BCG מהונדסים גנטית כדי אנטיגנים דומים אקספרס.

אבידין ביוטין אינטראקציה היא האינטראקציה קשרי ערכיות החזק ביותר הידוע בטבע עם Kd של 10−15 מ'13. . זה לא רק כלי שימושי נפוץ המחקר הביולוגי14, אבל גם לאחרונה הוכח להיות ישים סרטן טיפול15,16. במחקר זה, מוטציה טריפל (N54A, W110K ו- N17I) היה מוחל על פראי-סוג אבידין להמרת אבידין tetrameric סוג של monomeric אבידין זה הפחיתה באופן משמעותי אבידין-ביוטין זיקה (Kd= 10−7 מ') ומאגד הפיכה ל ביוטין. אבידין monomeric הזה שימש לפתח של פלסמיד p17-Avi התואמת לשער רקומבינציה שיבוט (Invitrogen) עבור ביטוי מהירה בשלב אחד של חלבון עניין. זו הגירסה החדשה של אבידין monomeric יש מספר יתרונות, כולל מניעת סבך חיידקי גדול צבירה, ארעי/הפיך חיידקי משטח התצוגה של חלבונים עניין. לכן, ברגע בלע התא המארח, אבי-fusion חלבונים ניתן לנתק מפני השטח של חיידקים biotinylated, תנועה intracellularly. לבסוף, מוטציות להמיר אבידין טופס glycosylated שאינו יכול להיות ישים שמרים או הצמחים הטרנסגניים17,18 לייצור כמויות גדולות של חלבונים פיוז'ן אבידין במערכות האיקריוטים. צורה זו של monomeric אבידין נבחר במקום גירסה של monomeric streptavidin (מס א)19, אשר יש רצפי הן streptavidin והן rhizavidin והיה זיקה מחייבת גבוהה יותר (Kd / 10−9 מ') לעומת mAvidin. עם בדיקות מקדימות, חלבון כמירה למתקן היה ליעילות קשירה נמוכה הרבה חיידקים biotinylated בהשוואה mAvidin הכימרה חלבון. מחקר זה, לכן, היה מבוסס על mAvidin, אבל monomeric streptavidin או צורות אחרות של streptavidin/אבידין תהיה גם אפשרות עבור יישומים אחרים.

יישום מוצלח של הפרוטוקולים שתואר תלויה איכות החלבון שנוצר פיוז'ן ואת היעילות של biotinylation פני השטח חיידקי. חלבון מתויג אבי eluted אמור להיות מלוח בטל, מאגר להחליף PBS שימוש במסוע חלבון נאותה משקל מולקולרי. משקעים עלולה להתרחש אצל גורמים ריכוז גבוה של חלבונים מסוימים, לכן ריכוז גורם צריך להיבדק, באמצעות כרכים קטנים של חלבון eluted-הראשון, למשל, ל- 0.5-1 מ ל solubilized הגוף הכללה מעורבבת עם 20 מ של PBS ואז מרוכזת. זה חשוב גם לשמור על הטמפרטורה של החלבון בסביבות 4 ° C במהלך התהליך כולו כדי להימנע משקעים.

כדי לשפר את היעילות של חיידקי biotinylation פני השטח, ביוטין SS Sulfo-NHS לאחסן במיכל המקורי שלו בחושך ב 4 º C. הכימית הוא מאוד לחות רגיש; לכן, צריך להיות equilibrated מבחנות שמכילות הכימית לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה. בנוסף, ביוטין מניות פתרון (10 מ מ) צריך להיות עשה מיד לפני השימוש כפי הידרוליזה moiety NHS-אסתר ולהיות לובשת מהר מאוד. פתרון מניות ביוטין לא יאוחסן ויעבור חוזר; בקבוקון ביוטין חדש יש צורך בכל ניסוי biotinylation. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, מומלץ תרבויות טריים BCG, מדיה חדשה, כמו גם מאגרי טריים. כאמור בפרוטוקול, biotinylated ו- BCG מצופה יכול להיות lyophilized, נשמר לפחות 30 ימים מבלי להשפיע על האיכות של ציפוי המשטח. הדבר שימושי במיוחד בעת שליחה או העברת דגימות ממיקום אחד למשנהו או בעת ביצוע ניסויים קורס ארוך.

שיטה זו הקליגרפיות BCG מציע גם אפשרויות מרגשות אחרים לנתח ולהעריך את immunogenicity של החיסון פיתח מועמדים בצורה מהירה ומדויקת. המטרה העיקרית של חיסונים טרה-בתים הרומן היא לזירוז TH1 תאים סוג כגון CD4+ ו CD8+ T תאים זה משחק תפקידים חשובים בהגנה נגד שחפת. מערכת אבידין-ביוטין שפותחו במחקר זה מציע כלי מאוד שימושי כדי להעריך תגובות אלו תאים T. זו טכנולוגיה של במהירות הצגת חלבונים רקומביננטי/אנטיגנים על פני השטח BCG מייצג כלי נהדר כדי להעריך במהירות ובאופן מדויק את היעילות מגן של חלבונים immunogenic רבים (למשל, מופרש ספציפי M.tb חלבונים), ועל כך שניתן יהיה לתרגם פיתוח חיסונים יעילים.

על ידי התאמת ושלל את הריכוז של אבי-fusion חלבונים חיידקי במשטח, יתרון נוסף של שיטה זו יכולה להיות בו זמנית להציג אנטיגנים שונים עניין על פני השטח חיידקים כדי למקסם את היעילות של החיסון. מאז מחקרים הראו BCG מפריע מקרופאג חשוב פונקציות כגון phagosome ההבשלה20,21 ואנטיגן מצגת21, אפשרות אחת כדי לשפר עוד יותר את ה-BCG יכול להיות קישוט BCG משטח עם שילוב של גורמים ידועים כדי להאיץ את ההבשלה phagosome יחד עם אנטיגנים של עניין.

כמה מגבלות של טכנולוגיה זו כוללים את הדרישה של ייצור בקנה מידה גדול של חומרים, אשר יכול להיות מאתגר ויקר באזורים בעלי הכנסה נמוכה. כמו כן, הפקת קשה לטהר חלבונים ידרוש ופתרון בעיות אופטימיזציה. עם זאת, מגבלות אלה יכולים שיפרו עם השיפור בטכנולוגיות ייצור חלבון רקומביננטי. מגבלה נוספת כוללת את האפשרות כי באופן טבעי נוגדנים אנטי אבידין המתרחשים נפוץ וחיות מעבדה22 ייתכן ה"בלתי השימוש אבידין למטרות טיפוליות. עם זאת, מעבדות נוספות בחנו את הבטיחות והיעילות של טיפול אבידין, הראו כי הבטיחות והיעילות של אבידין לא משמעותית הושפעו שלה immunogenicity23. מעניין, המרת אבידין tetrameric פראי-סוג של צורה monomeric באופן משמעותי ירד שלה immunogenicity24.

לסיכום, זו טכנולוגיה ניצול מערכת אבידין-ביוטין כדי לשפר את immunogenicity של ה-BCG דרך מהירה, לשחזור הלא גנטי חיידקי משטח שינוי עם חלבונים עניין יכול בהצלחה להחליף המסורתי טרנספורמציה של BCG עם קידוד אנטיגן פלסמידים. יתר על כן, בשיטה חדשנית זו ניתן לא רק להקל על שיפור של החיסון BCG הנוכחי, אך יכולים גם לספק פלטפורמה חדשנית להערכה מהירה של כמעט כל אנטיגן פוטנציאליים או חלבונים בדרך כלל קשה לבטא גנטית ב- BCG, עם בחורה יישומים בפיתוח חיסון נגד שחפת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים ד ר סטוקס R לזן של פסטר BCG ו א טלאל לקבלת תמיכה טכנית. אנו מודים גם GenScript על העזרה עם ג'ין סינתזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb BD Bioscience 562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG Electron Microscopy Sciences 25100
Middlebrook 7H9 broth BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
  2. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
  3. Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
  4. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  5. Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
  6. Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
  7. Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
  8. Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
  9. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
  10. Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
  11. Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  12. Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
  13. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  14. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  15. Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
  16. Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
  17. Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
  18. Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
  19. Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
  20. Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
  21. Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
  22. Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
  23. Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
  24. Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).

Tags

אימונולוגיה גיליון 131 שחפת Mycobacterium מקרופאגים התגובה החיסונית חומרים תאי T אנטיגנים ביוטין ביוטין אבידין
ביטוי של אנטיגנים אקסוגני חיסון ה-BCG <em>Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס</em> דרך קישוט משטח שאינו גנטי עם מערכת אבידין-ביוטין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liao, T. Y. A., Lau, A., Sunil, J.,… More

Liao, T. Y. A., Lau, A., Sunil, J., Hytönen, V., Hmama, Z. Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System. J. Vis. Exp. (131), e56421, doi:10.3791/56421 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter