Pentylenetetrazole-geïnduceerde aanmaakhout muismodel

Summary

Dit protocol beschrijft een methode van chemische aanmaakhout met pentylenetetrazole en biedt een muismodel van epilepsie. Dit protocol kan ook gebruikt worden om te onderzoeken kwetsbaarheid voor inbeslagneming inductie en pathogenese na epileptische aanvallen bij muizen.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) is een GABA-A receptor antagonist. Een intraperitoneale injectie van PTZ in een dier induceert een acute, ernstige beslaglegging bij een hoge dosis, overwegende dat opeenvolgende injecties van een subconvulsive dosis hebben ingezet voor de ontwikkeling van chemische aanmaakhout, een model van de epilepsie. Een enkele lage dosis injectie van PTZ induceert een milde beslag zonder Geschudek. Echter, repetitieve lage dosis injecties van PTZ verlagen de drempel om op te roepen een convulsive inbeslagneming. Ten slotte, continue lage dosis beheer van PTZ induceert een ernstige tonic-klonische inbeslagneming. Deze methode is eenvoudig en breed inzetbaar te onderzoeken de pathofysiologie van epilepsie, die is gedefinieerd als een chronische ziekte waarbij steeds terugkerende aanvallen. Deze chemische stof aanmaakhout protocol veroorzaakt herhaalde aanvallen in dieren. Met deze methode, de kwetsbaarheid voor aanvallen PTZ-gemedieerde of de mate van verergering van de epileptische aanvallen werd geschat. Deze voordelen hebben geleid tot het gebruik van deze methode voor het screenen van de anti-epileptische geneesmiddelen en epilepsie-gerelateerde genen. Bovendien is deze methode hanteert voor het onderzoeken van neuronale schade na epileptische aanvallen omdat histologische wijzigingen waargenomen in de hersenen van epileptische patiënten worden ook in de hersenen van dieren chemische-ontstoken weergegeven. Dit protocol is dus nuttig voor gemakkelijk het produceren van dierlijke modellen van epilepsie.

Introduction

Epilepsie is een chronische neurologische aandoening die wordt gekenmerkt door terugkerende aanvallen en ongeveer 1% van de mensen beïnvloedt. De onderliggende mechanismen van epileptogenese en inbeslagneming generatie bij epilepsie patiënten kunnen niet volledig worden verduidelijkt in klinische studies. Daarom is een passende diermodel vereist voor de studie van epilepsie¹.

Een scala aan dierlijke modellen van epilepsie zijn gebruikt om de onderzoeken van de Fysiologie van epilepsie en anti-epileptische geneesmiddelen^2,3. Onder deze modellen is farmacologische inbeslagneming inductie een gemeenschappelijke methode gebruikt voor het genereren van een dierlijk model voor het onderzoek van de pathologie van epilepsie⁴. Deze methode is goedkoop en eenvoudig. Elektrode-gemedieerde aanmaakhout is ook een veelgebruikte methode, maar de kosten van deze procedure zijn hoger, en de methode vereist chirurgische en elektrische vaardigheden voor het opwekken van herhaalde aanvallen⁵.

Farmacologische inductie is ook voordelig, omdat de timing en het aantal vangsten zijn gemakkelijk gecontroleerd. Genetische Muismodellen die spontane aanvallen vertonen worden ook gebruikt in de studie van epilepsie. Voorspellen wanneer en hoe vaak de aanvallen zich in deze genetische modellen voordoen kunnen echter niet onmogelijk⁶. Een systeem voor gezondheidsmonitoring dient te observeren de epileptische gedrag van genetisch gemodificeerde muizen⁶.

Kainic zuur, pilocarpine en pentylenetetrazole (PTZ) worden veel gebruikt als beslaglegging-inducerende drugs⁷. Kainic acid is een agonist voor glutamaat receptoren, en pilocarpine activeert cholinerge receptoren. PTZ is een gamma-aminoboterzuur (GABA)-een receptor antagonist⁸. PTZ onderdrukt de functie van inhiberende synapsen, wat leidt tot verhoogde Neuronale activiteit. Deze verordening veroorzaakt gegeneraliseerde aanvallen bij dieren⁹. Een enkele injectie van kainic zuur en pilocarpine kan veroorzaken acute aanvallen, met name status epilepticus (SE)^10,11 en kainic zuur – of pilocarpine-gemedieerde SE bevordert chronische spontane en terugkerende aanvallen^{12 , 13}. electroencephalographic (EEG) opnamen en gedragsanalyse hebben aangegeven dat spontane recidiverende aanvallen per maand na een enkele injectie^12,13in acht worden genomen. Een enkele injectie van een convulsive dosis van PTZ induceert ook acute inbeslagneming. Chronische spontane aanvallen na een enkele injectie van PTZ zijn echter moeilijk te bevorderen. Chronische toediening van PTZ is vereist voor het opwekken van herhaalde aanvallen¹⁴. De generatie van herhaalde aanvallen is in beide methoden, kunnen voor het opwekken van een pathologie meer vergelijkbaar met die van menselijke epilepsie dan de generatie van acute aanvallen. In het geval van PTZ, elke injectie roept een inbeslagneming en inbeslagneming Ernst ernstiger op een stapsgewijze manier met elke injectie. Tot slot, een enkele lage dosis PTZ injectie induceert een ernstige tonic-klonische inbeslagneming. In deze fase roept elke injectie ernstige aanvallen. Daarnaast wijzigen de inbeslagneming latentie en de duur ook in de loop van de injecties. De latentie te tonic inbeslagneming wordt vaak korter in de laatste fase van het aanmaakhout¹⁵. Bovendien, verergering van de inbeslagneming wordt begeleid door een langdurige inbeslagneming duur¹⁶. Het onderzoeken van het moleculaire mechanisme voor regulering van de ernst van de inbeslagneming, is vertraging en duur handig voor het screenen van de anti-epileptische geneesmiddelen^17,18,19.

Vangsten worden vaak veroorzaakt door een eenmalige systemische toediening van PTZ, en het herstel is erg snel, binnen 30 min^4,5. Het aantal vangsten is dus meer beheersbaar in de PTZ-aanmaakhout-model. Echter heeft EEG toezicht aangegeven dat veralgemeende spikes kunnen worden gezien tot 12 h na inbeslagneming PTZ-gemedieerde²⁰. Daarom moeten bij voorkeur dieren blijven onder observatie gedurende 24 uur na de inbeslagneming van Myoclone of tonische²¹ voor nauwkeuriger analyse van de aanmaakhout mechanismen.

De toediening van anti-epileptische geneesmiddelen, zoals ethosuximide, valproate, fenobarbital, vigabatrin en retigabine³, vóór of na de PTZ injectie vermindert de verergering van de inbeslagneming Ernst^{3,22, 23}. Evenzo, knock-out muizen dat gebrek aan genen bij verergering van de inbeslagneming, zoals matrix metalloproteinase-9²⁴, FGF-22²⁵ en neuritin^{26 betrokken}, is aangetoond dat verminderde inbeslagneming Ernst vertonen na meerdere PTZ injecties. Bovendien, het observeren van histopathologische veranderingen na epileptische aanvallen is mogelijk met deze methode. Bij patiënten met temporaalkwab epilepsie zijn er typische histologische veranderingen in de hersenen, zoals mossy vezel kiemen^27,28, abnormale submodule neuron migratie²⁹, astrogliosis³⁰, neuronale cel dood in de hippocampus^31,32, en hippocampal sclerose³³. Dergelijke veranderingen worden waargenomen bij epileptische model dieren. Onder de beschikbare methoden is PTZ-gemedieerde chemische aanmaakhout een goede, reproduceerbare en goedkope methode voor de productie van een dierlijk model van epilepsie. In een pilocarpine-gemedieerde SE model, inbeslagneming controle is moeilijk en veel muizen sterven of niet ontwikkelen van SE³⁴. Sterfte en inbeslagneming ernst zijn daarentegen beter controleerbaar in de PTZ-model. Bovendien, PTZ is goedkoper dan kainic zuur, en vaardigheden in muis hersenoperatie zijn niet vereist voor de FDA.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het Animal Care en gebruik Comité van de Tokyo Metropolitan Instituut van medische wetenschap. Postnatale 8 – 16 weken oude muizen worden aanbevolen. Een ingeteelde stam is aanvaardbaar voor het experiment. C57BL/6 muizen meer resistent zijn tegen PTZ, overwegende dat de BALB/c en Zwitserse albino muizen zijn gevoeliger voor PTZ. C57BL/6 werden gebruikt in deze studie. Kwetsbaarheid voor PTZ hangt ook af van de leeftijd van de muis. In vergelijking met jongere muizen…

Representative Results

Repetitieve injectie van PTZ induceert een verhoging van de ernst van de inbeslagneming. Zes C57BL/6 muizen werden behandeld met PTZ en een ander 6 muizen werden behandeld met zoutoplossing als een controlegroep. De PTZ-dosis was 35 mg/kg, en 10 injecties zijn toegediend. De inbeslagneming score geleidelijk verhoogd met PTZ injecties, terwijl geen vangsten of abnormale gedrag werden opgeroepen door zoute injecties (Figuur 2). ANOVA gevolgd door Bonferroni tes…

Discussion

Hier presenteren we een breed toegankelijke protocol voor de oprichting van een farmacologische diermodel van epilepsie. Chemische aanmaakhout PTZ-gemedieerde heeft een lange geschiedenis en is een algemeen aanvaarde model voor de studie van de histopathologie en cellulaire pathologie van epilepsie⁴¹. De chemische aanmaakhout model van epilepsie is eerder onderzocht door Suzdak en Jansen, 1995⁴². Farmacologische inbeslagneming inductie, vooral met PTZ, is een gemakkelijke e…

Materials

Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Sodium chloride	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL)	Terumo	SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Weighing scale	Mettler	PE2000	This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium hydroxide	nacalai tesque	31511-05
Peristatic pump	ATTO	SJ1211
Sucrose	nacalai tesque	30404-45
Microtome	Yamato	REM-700	This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
anti-synaptoporin antibody	Synaptic systems	102 002
anti-ZnT3 antibody	Synaptic systems	197 002
anti-doublecortin	Santa Cruz	sc-8066	This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus	O'hara
Three chamber test apparatus	Muromachi