Inflamação induzida pela mielinização Mouse modelo

Summary

Este protocolo descreve um método de inflamação química com mielinização e fornece um modelo do rato da epilepsia. Este protocolo também pode ser usado para investigar a vulnerabilidade à indução de convulsões e patogênese após crises epilépticas em ratos.

Abstract

Mielinização (PTZ) é um antagonista dos receptores GABA-A. Uma injeção intraperitoneal de PTZ em um animal induz uma convulsão aguda, grave em uma dose alta, Considerando que injeções sequenciais de uma dose de subconvulsive têm sido utilizadas para o desenvolvimento da química kindling, um modelo de epilepsia. Uma única injeção de baixas doses de PTZ induz uma convulsão leve sem convulsão. No entanto, injeções de baixas doses repetitivas de PTZ diminuem o limiar para evocar um ataque convulsivo. Finalmente, administração contínua de baixa dose de PTZ induz uma severa convulsão tônico-clônica. Este método é simples e amplamente aplicável para investigar a fisiopatologia da epilepsia, que é definida como uma doença crônica que envolve ataques repetitivos. Este produto químico acender protocolo causa convulsões repetitivas em animais. Com este método, estimou-se a vulnerabilidade a ataques mediada por PTZ ou o grau de agravamento de crises epilépticas. Estas vantagens levaram à utilização desse método para triagem de droga anti-epiléptica e genes relacionados com epilepsia. Além disso, este método utilizou-se para investigar o dano neuronal após ataques epiléticos, porque as alterações histológicas observadas no cérebro de pacientes epilépticos também aparecem nos cérebros dos animais acendeu o produto químico. Assim, este protocolo é útil para produzir convenientemente modelos animais de epilepsia.

Introduction

Epilepsia é uma doença neurológica crônica que se caracteriza por convulsões recorrentes e afeta aproximadamente 1% das pessoas. Os mecanismos subjacentes da geração epileptogenesis e apreensão em pacientes de epilepsia não podem ser totalmente esclarecidos em estudos clínicos. Portanto, um modelo animal adequado é necessário para o estudo da epilepsia¹.

Uma variedade de modelos animais de epilepsia têm sido utilizados para investigar a fisiologia da epilepsia e para identificar a droga anti-epiléptica^2,3. Entre estes modelos, indução farmacológica convulsão é um método comum usado para gerar um modelo animal para a investigação da patologia de epilepsia⁴. Este método é simples e barato. Inflamação mediada por eletrodo também é um método comumente usado, mas os custos deste procedimento são mais elevados, e o método requer habilidades cirúrgicas e elétricas para induzir convulsões repetitivas⁵.

Indução farmacológica também é vantajosa porque o calendário e o número de apreensões são facilmente controladas. Modelos de genética do rato que apresentam convulsões espontâneas também são usados no estudo da epilepsia. No entanto, prever quando e quantas vezes as convulsões surgem nesses modelos genéticos pode ser impossível⁶. Um sistema de monitoramento é necessário para observar o comportamento epiléptico de camundongos geneticamente modificados⁶.

Ácido Kainic, pilocarpina e mielinização (PTZ) são amplamente utilizados como indutora de apreensão de drogas⁷. O ácido Kainic é um agonista de receptores de glutamato, e pilocarpina ativa receptores colinérgicos. PTZ é um ácido gama aminobutírico (GABA)-um antagonista de receptor⁸. PTZ suprime a função de sinapses inibitórias, levando ao aumento da atividade neuronal. Este regulamento causa convulsões generalizadas em animais⁹. Uma única injeção de ácido kainic e Pilocarpina pode induzir convulsões agudas, especialmente estado de mal epiléptico (SE)^10,11 e kainic ácido ou pilocarpina-mediada SE promove convulsões espontâneas e recorrentes crônicas^{12 , 13}. gravações eletroencefalográficos (EEG) e análise do comportamento têm indicado que a espontâneas convulsões recorrentes são observadas um mês após uma única injeção de^12,13. Uma única injeção de uma dose convulsiva de PTZ também induz convulsão aguda. No entanto, crônicas espontâneas convulsões após uma única injeção de PTZ são difíceis de promover. Administração crônica de PTZ é necessária para induzir convulsões repetitivas¹⁴. Em ambos os métodos, a geração de convulsões repetitivas é capaz de induzir a uma patologia mais semelhante da epilepsia humana do que a geração de crises agudas. No caso de PTZ, cada injeção evoca uma convulsão, e severidade de apreensão torna-se mais grave, de forma gradual, com cada injeção. Finalmente, uma única injeção de baixa dose PTZ induz uma severa convulsão tônico-clônica. Nesta fase, cada injeção evoca convulsões graves. Além disso, a duração e a latência de apreensão também mudam ao longo das injeções. A latência de convulsão tônico muitas vezes torna-se mais curta na última fase de acender¹⁵. Além disso, agravamento de convulsão é acompanhado por uma apreensão prolongada duração¹⁶. Investigar o mecanismo molecular que regula a gravidade do ataque, latência e duração é útil para triagem droga anti-epiléptica^17,18,19.

As convulsões comumente são induzidas por uma única administração sistémica de PTZ, e a recuperação é muito rápida, dentro de 30 min^4,5. Assim, o número de apreensões é mais controlável no modelo PTZ-gravetos. No entanto, monitorização de EEG indicou que picos generalizados podem ser vistos até 12 h após apreensão mediada por PTZ²⁰. Portanto, animais de preferência devem permanecer em observação por 24 h após a convulsão tônico ou Mioclônicas²¹ para análise mais precisa dos mecanismos de inflamação.

A administração de fármacos antiepiléptico, como etossuximida, valproato, fenobarbital, vigabatrina e retigabine³, antes ou após a injeção de PTZ atenua o agravamento do ataque gravidade^{3,22, 23}. Da mesma forma, ratos do KO que falta genes envolveram na exacerbação de apreensão, tais como matriz metaloproteinase-9,²⁴, FGF-22²⁵ e neuritin²⁶, foram mostrados para expor a gravidade reduzida convulsão após múltiplas injecções de PTZ. Além disso, observar alterações histopatológicas após ataques epilépticos é possível com este método. Em pacientes com epilepsia do lobo temporal, existem alterações histológicas típicas no cérebro, tais como fibra musgosa brotando de^27,28, grânulo anormal neurônio migração²⁹, astrogliosis³⁰celular neuronal morte no hipocampo^31,32e esclerose hippocampal³³. Alterações semelhantes são observadas em animais modelo epiléptica. Entre os métodos disponíveis, mediada por PTZ inflamação química é um método bom, Reproduzível e baixo custo para produzir um modelo animal de epilepsia. Em um modelo SE mediada por pilocarpina, controle de crises é difícil e muitos ratos morrem ou deixam de desenvolver-SE³⁴. Em contraste, mortalidade e gravidade de apreensão são mais controláveis no modelo de PTZ. Além disso, PTZ é menos caro do que o ácido kainic, e habilidades na cirurgia de cérebro de rato não são necessárias para a administração de drogas.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso de Tokyo Metropolitan Instituto de ciência médica e cuidado Animal. Pós-natal, 8 – 16 semanas os ratos são recomendados. Toda a tensão pura é aceitável para o experimento. Camundongos C57Bl/6 são mais resistentes a PTZ, Considerando que BALB/c e Swiss ratos albinos são mais sensíveis a PTZ. C57Bl/6 foram utilizados neste estudo. Vulnerabilidade de PTZ também depende da idade do rato. Em comparação aos mais jovens ratos, ratos mais velho…

Representative Results

Injeção repetitiva de PTZ induz um aumento na severidade de apreensão. Seis camundongos C57BL/6 foram tratados com PTZ, e outro de 6 ratos foram tratados com soro fisiológico como um grupo de controle. A dose PTZ foi 35 mg/kg e 10 injeções foram administradas. A pontuação de ataque aumentado gradualmente com injeções de PTZ, Considerando que sem convulsões ou comportamentos anormais foram evocados por injeções de solução Salinas (Figura 2). ANO…

Discussion

Aqui, apresentamos um protocolo amplamente acessível para o estabelecimento de um modelo animal farmacológico de epilepsia. Mediada por PTZ inflamação química tem uma longa história e é um modelo comumente aceitado para o estudo da patologia celular e histopatologia de epilepsia⁴¹. O modelo de inflamação química da epilepsia tem sido avaliado anteriormente por Suzdak e Jansen, 1995⁴². Indução de convulsão farmacológica, especialmente com PTZ, é um método fá…

Materials

Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Sodium chloride	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL)	Terumo	SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Weighing scale	Mettler	PE2000	This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium hydroxide	nacalai tesque	31511-05
Peristatic pump	ATTO	SJ1211
Sucrose	nacalai tesque	30404-45
Microtome	Yamato	REM-700	This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
anti-synaptoporin antibody	Synaptic systems	102 002
anti-ZnT3 antibody	Synaptic systems	197 002
anti-doublecortin	Santa Cruz	sc-8066	This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus	O'hara
Three chamber test apparatus	Muromachi