Modèle de souris de bois d’allumage induite par le pentylènetétrazole

Summary

Ce protocole décrit une méthode de bois d’allumage chimique avec pentylènetétrazole et fournit un modèle de souris de l’épilepsie. Ce protocole permet également d’enquêter sur la vulnérabilité à l’induction de la saisie et la pathogenèse après les crises d’épilepsie chez les souris.

Abstract

Pentylènetétrazole (PTZ) est un antagoniste des récepteurs GABA-A. Une injection intrapéritonéale de PTZ dans un animal induit une crise aiguë, sévère à une dose élevée, alors que les injections séquentielles d’une dose de sous-convulsive ont été utilisées pour le développement de produit chimique kindling, un modèle de l’épilepsie. Une seule injection de faibles doses de PTZ induit une crise d’épilepsie bénigne sans convulsion. Toutefois, des injections de faibles doses répétitives de PTZ diminuent le seuil pour évoquer une crise convulsive. Enfin, administration de faible dose continue de PTZ provoque une grave crise tonico-clonique. Cette méthode est simple et largement applicable pour étudier la physiopathologie de l’épilepsie, qui est définie comme une maladie chronique nécessitant des crises répétitives. Ce produit chimique kindling protocole provoque des crises répétitives chez les animaux. Avec cette méthode, on estimait la vulnérabilité aux crises induite par le PTZ ou le degré d’aggravation des crises d’épilepsie. Ces avantages ont conduit à l’utilisation de ce procédé de criblage de médicaments contre l’épilepsie et les gènes liés à l’épilepsie. En outre, cette méthode a servi à enquêter sur les dommages neuronaux après des crises d’épilepsie car les modifications histologiques observées dans le cerveau des patients épileptiques apparaissent également dans le cerveau des animaux chimique-allumé. Ainsi, le présent protocole est utile pour produire facilement des modèles animaux d’épilepsie.

Introduction

L’épilepsie est une affection neurologique chronique qui se caractérise par des crises récurrentes et touche environ 1 % des personnes. Les mécanismes sous-jacents de génération épileptogenèse et saisies chez les patients épileptiques ne peuvent pas être totalement clarifiés dans les études cliniques. Par conséquent, un modèle animal approprié est requis pour l’étude de l’épilepsie¹.

Une variété de modèles animaux d’épilepsie ont été utilisés pour étudier la physiologie de l’épilepsie et d’identifier les médicaments anti-épileptiques^2,3. Parmi ces modèles, l’induction pharmacologique de saisie est une méthode couramment utilisée pour générer un modèle animal pour l’étude de la pathologie de l’épilepsie⁴. Cette méthode est simple et peu coûteux. Induite par l’électrode allumage est également une méthode couramment utilisée, mais les frais de cette procédure sont plus élevés, et la méthode exige des compétences chirurgicales et électriques pour induire des crises répétitives⁵.

Induction pharmacologique est également avantageuse parce que le calendrier et le nombre de saisies sont facilement contrôlés. Des modèles de souris génétiques qui présentent des crises spontanées sont également utilisés dans l’étude de l’épilepsie. Toutefois, le fait de prédire quand et à quelle fréquence les crises surviennent dans ces modèles génétiques peut être impossible⁶. Un système de surveillance est nécessaire pour observer le comportement épileptique de souris génétiquement modifiées⁶.

Acide kaïnique, pilocarpine et pentylènetétrazole (PTZ) sont largement utilisés comme induisant la saisie de drogues⁷. Acide kaïnique est un agoniste des récepteurs du glutamate, et pilocarpine active les récepteurs cholinergiques. PTZ est un acide gamma aminobutyrique (GABA)-un antagoniste de récepteur⁸. PTZ supprime la fonction des synapses inhibitrices, conduisant à une augmentation de l’activité neuronale. Le présent règlement provoque des crises généralisées dans animaux⁹. Une seule injection de l’acide kaïnique et pilocarpine peut provoquer des crises aiguës, surtout état de mal épileptique (SE)^10,11 et kaïnique acide ou pilocarpine-médiation SE favorise le chronique convulsions récurrentes et spontané^{12 , 13}. enregistrements électroencéphalographiques (EEG) et l’analyse du comportement ont indiqué que les convulsions récurrentes spontanées sont observées un mois après une seule injection^12,13. Une seule injection d’une dose convulsive de PTZ induit également la crise aiguë. Toutefois, des saisies spontanées chroniques après une seule injection de PTZ sont difficiles à promouvoir. L’administration chronique de PTZ est nécessaire pour induire des crises répétitives¹⁴. Dans les deux méthodes, la génération de crises répétitives est capable d’induire une pathologie plus semblable à celui de l’épilepsie humaine que la génération des crises aiguës. Dans le cas de PTZ, chaque injection évoque une crise d’épilepsie, et gravité de la saisie devient plus sévère selon des étapes avec chaque injection. Enfin, une seule injection de faibles doses PTZ provoque une grave crise tonico-clonique. Dans cette phase, chaque injection évoque des crises graves. En outre, la latence de la saisie et la durée aussi changent au cours des injections. La latence à la saisie tonique devient souvent plus courte dans la dernière phase d’allumage¹⁵. En outre, aggravation de la crise s’accompagne d’une saisie prolongée durée¹⁶. Étudie les mécanismes moléculaires régissant la sévérité de la saisie, latence et la durée est utile pour le dépistage des antiépileptiques^17,18,19.

Saisies sont souvent induits par une seule administration systémique de PTZ, et la récupération est très rapide, moins de 30 min^4,5. Ainsi, le nombre de saisies est plus contrôlable dans le modèle de PTZ-bois d’allumage. Surveillance EEG a cependant indiqué que les pointes généralisées peuvent être vu jusqu’à 12 h après saisie PTZ-mediated²⁰. Donc, les animaux devrait préférence rester sous observation pendant 24 h après la crise myoclonique ou toniques²¹ pour une analyse plus précise des mécanismes de bois d’allumage.

L’administration de médicaments contre l’épilepsie comme éthosuximide, valproate, phénobarbital, vigabatrine et RÉTIGABINE³, avant ou après l’injection de PTZ atténue l’aggravation de la crise gravité^{3,22, 23}. De même, chez des souris knockout que manque gènes impliqués dans l’exacerbation de saisie, tels que matrix metalloproteinase-9²⁴, FGF-22²⁵ et neuritin²⁶, ont démontré à exposer gravité réduite saisie après injections multiples de PTZ. En outre, observer des modifications histopathologiques après des crises d’épilepsie est possible avec cette méthode. Chez les patients atteints d’épilepsie du lobe temporal, il y a des modifications histologiques typiques dans le cerveau, comme les fibres moussues germination anormale granule neuron migration²⁹,^27,28, neuronale, astrogliosis³⁰ mort à l’hippocampe^31,32et³³de la sclérose hippocampique. Des changements similaires sont observées chez les animaux de modèle épileptique. Parmi les méthodes disponibles, bois d’allumage chimique induite par le PTZ est une méthode bien, reproductible et peu coûteuse à produire un modèle animal de l’épilepsie. Dans un modèle SE induite par la pilocarpine, contrôle de saisie est difficile et beaucoup de souris meurent ou ne parviennent pas à développer SE³⁴. En revanche, la mortalité et la gravité de la crise sont plus contrôlables dans le modèle PTZ. En outre, PTZ est moins cher que l’acide kaïnique et compétences en chirurgie de cerveau de souris ne sont pas requis pour l’administration de médicaments.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité de l’utilisation de la Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science et animalier. Postnatal 8 – 16 semaines souris sont recommandés. Toute souche consanguine est acceptable pour l’expérience. Les souris C57BL/6 sont plus résistants aux PTZ, tandis que BALB/c et suisses des souris albinos sont plus sensibles au PTZ. C57BL/6 ont été utilisées dans cette étude. Vulnérabilité aux PTZ dépend aussi de l’âge de la souris. Par rapport…

Representative Results

Injection répétitive du PTZ induit une augmentation dans la sévérité de la saisie. Six souris C57BL/6 ont été traités avec le PTZ, et un autre 6 souris ont été traitées avec une solution saline comme un groupe de contrôle. La dose PTZ était de 35 mg/kg et 10 injections ont été réalisées. Le score de saisie a augmenté graduellement avec des injections de PTZ, tandis que pas saisies ou comportements anormaux ont été évoqués par des injections salines (<strong class="xf…

Discussion

Nous présentons ici un protocole largement accessible pour la mise en place d’un modèle animal pharmacologique de l’épilepsie. Bois d’allumage chimique induite par le PTZ a une longue histoire et est un modèle couramment accepté pour l’étude de la pathologie histopathologie et cellulaires de l’épilepsie,⁴¹. Le modèle chimique embrasement de l’épilepsie a été examiné précédemment par Suzdak et Jansen, 1995,⁴². Induction pharmacologique de saisie, en…

Materials

Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Sodium chloride	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL)	Terumo	SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Weighing scale	Mettler	PE2000	This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium hydroxide	nacalai tesque	31511-05
Peristatic pump	ATTO	SJ1211
Sucrose	nacalai tesque	30404-45
Microtome	Yamato	REM-700	This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
anti-synaptoporin antibody	Synaptic systems	102 002
anti-ZnT3 antibody	Synaptic systems	197 002
anti-doublecortin	Santa Cruz	sc-8066	This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus	O'hara
Three chamber test apparatus	Muromachi