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Cancer Research

In Vivo EPR valutazione di pH, pO2, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/56624
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1In Vivo Multifunctional Magnetic Resonance center, Robert C. Byrd Health Sciences Center, West Virginia University, 2Department of Biochemistry, West Virginia University School of Medicine, 3Department of Microbiology, Immunology & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

Summary

Risonanza paramagnetica elettronica di basso campo (banda L, 1.2 GHz) usando le sonde nitrossidi e trityl solubile è dimostrata per la valutazione dei parametri fisiologicamente importanti nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno.

Abstract

Questo protocollo dimostra le capacità di risonanza paramagnetica elettronica di basso campo (EPR)-basato su tecniche in combinazione con sonde paramagnetiche funzionale a fornire informazioni quantitative sul microambiente tumorale chimica (TME), tra cui p O2, lo stato redox, pH, concentrazioni di fosfato inorganico interstiziale (Pi) e intracellulare del glutatione (GSH). In particolare, un'applicazione di una sonda sviluppata di recente solubile trityl multifunzionale offre opportunità insuperabile per in vivo misure simultanee di pHe pO2 Pi a E spazio inases (sonda di speranza). Le misure dei tre parametri utilizzando una singola sonda permettono per le loro analisi di correlazione indipendente di distribuzione sonda e ora delle misurazioni.

Introduction

Un ruolo chiave della TME nella progressione del cancro e nella terapia è sempre più apprezzato1. Tra le importanti parametri fisiologici della TME in tumori solidi, di ipossia del tessuto2, acidosi3,4, alta riduzione capacità5, elevate concentrazioni di GSH intracellulare6,7, e interstiziale Pi8 sono ben documentati. Valutazioni di2, pH, Pi, GSH e redox non invasiva in vivo pO forniscono intuizioni uniche i processi biologici nella TME e aiutano anticipo strumenti per lo screening pre-clinico di farmaci anti-cancro e strategie terapeutiche mirate TME. Una radiofrequenza ragionevole profondità di penetrazione nei tessuti da formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) e tecniche basate su EPR a basso campo li rende gli approcci più appropriati per la valutazione non invasiva di questi parametri TME. MRI si basa in gran parte su imaging protoni di acqua ed è ampiamente usato nelle regolazioni cliniche fornire risoluzione anatomica ma manca funzionale ad alta risoluzione. Le misure di risonanza magnetica nucleare di fosforo-31 (31P-NMR) di extracellulare Pi concentrazione e pH basato su un segnale da fosfato endogeno sono potenzialmente interessanti per la caratterizzazione di TME, ma normalmente sono mascherate da diverse volte superiore intracellulare Pi concentrazioni9,10. Al contrario, misure EPR si basano sulla spettroscopia e imaging del appositamente progettato sonde paramagnetiche per fornire la risoluzione funzionale. Nota che esogeno EPR sonde hanno un vantaggio su esogeno NMR sonde dovuto la sensibilità intrinseca molto più elevata di EPR e assenza di segnali EPR sfondo endogeno. Il recente sviluppo di una duplice funzione pH e redox nitrossidi sonda11 e multifunzionale trityl sonda12 fornisce opportunità insuperabile per in vivo misure simultanee di diversi parametri di TME e loro analisi di correlazione indipendente sulla sonda distribuzione e tempo di misura. A nostra conoscenza, non ci sono nessun altri metodi disponibili per valutare simultaneamente in vivo fisiologicamente importanti parametri TME chimici in soggetti viventi, come pO2, pHe, Pi, redox e GSH.

Sonde per In Vivo Misure funzionali:

La figura 1 Mostra strutture chimiche delle sonde paramagnetiche utilizzate per accedere ai parametri TME, che comprendono le sonde del particolato e solubile. Alta sensibilità funzionale, stabilità nel tessuto vivente e tossicità minima sono alcuni vantaggi che fanno del particolato sonde preferiti sopra solubile sonde per in vivo ossimetria EPR. Ad esempio, sonde di particolato sono aumentati tempi di ritenzione al sito di impianto del tessuto rispetto alle sonde solubile che permette di misurare longitudinale del tessuto pO2 sopra parecchie settimane. D'altra parte, sonde solubile sovraperformare particolati sonde fornendo misurazioni spaziali risolto utilizzando basati su EPR tecniche di imaging nonché consentendo analisi concomitante da molteplici funzionalità (pO2, pH, Pi, redox, e GSH).

Figure 1
Figura 1. Strutture chimiche delle sonde paramagnetiche che assemblare analisi valutazione TME. Questo include il particolato pO2 sonda, LiNc-BuO (R = - O (CH2)3CH3) e sonde solubile: sonda di pH e redox di funzione dual, NR; Sonda di GSH-sensibili, Simonerasetti; e multifunzionale pO2, pH e sonda di Pi del microambiente extracellulare, la sonda di speranza. La sintesi di queste sonde è stato descritto nei riferimenti forniti 11,12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

Tutto il lavoro animale è stato eseguito conformemente al protocollo WVU IACUC approvato.

1. sintesi e calibrazione della sonda

  1. Particolato pO2-sensibili LiNc-BuO sonda
    Nota: LiNc-BuO microcristalli vengono sintetizzati e preparate come descritto nel riferimento13. Sono molto stabili e possono essere conservati a temperatura ambiente per anni. L'EPR linewidth della sonda del particolato LiNc-BuO è un pO2-parametro sensibile. LiNc-BuO microcristalli dimostrano ideale dipendenza lineare di linewidth sulla concentrazione di ossigeno nella gamma da condizioni anossiche fino a 760 mmHg di pressione parziale2 pO13, con i valori di linewidth intrinseco in assenza di ossigeno e la pendenza della dipendenza di ossigeno (misurata in mG/mmHg) leggermente diverse per diversi lotti della preparazione microcrystal. Di conseguenza, calibrazione è necessaria per ogni particolare lotto.
    1. Pesare 60 mg di microcristalli di LiNc-BuO.
    2. Per la calibratura di sensibilità di ossigeno, sospendere microcristalli in 3 mL di medium per volta Eagle Media (DMEM) di Dulbecco (a una concentrazione di 20 mg/mL) e trattare con ultrasuoni per 5 minuti sul ghiaccio con un sonicatore sonda a 20 kHz utilizzando 7 W di potenza in un tubo di turno-fondo di vetro da 5 mL.
    3. Posizionare 1 mL dei lisati mediante microcristalli in un vetro del tubo nel risonatore bobina di superficie dello spettrometro EPR banda L (1,2 GHz) e acquisire spettri EPR onde continue (CW) alla temperatura fisiologica di 37 ° C e ossigeno concentrazioni di 0, 1, 2, 4, 8 e il 20,9%. Mantenere la concentrazione di ossigeno dalla bollitura la soluzione con miscela di gas trasportato da un controller di gas e mantenere la temperatura usando un bagno di acqua collegato ad un termostato. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione spettrometro EPR: modulazione di ampiezza, 100 mG; frequenza di modulazione, 100 kHz; larghezza di spazzata, 5 G; tempo, 60 s.
    4. Per ottenere un migliore rapporto segnale-rumore (SNR), utilizzare un valore di ampiezza di modulazione del 60% il linewidth (ad esempio, utilizzare un'ampiezza di modulazione G 0,6 per il linewidth di 1 G).
    5. Procedura di calibrazione semplificata alternativa: registrare gli spettri EPR in aria-gorgogliare e anossici soluzioni14. In quest'ultimo caso, è necessario mantenere anossia nei campioni con l'aggiunta di glucosio di 10 mM e 100 U/mL glucosio ossidasi a soluzioni sonda 1 mL secondo riferimento14.
    6. Montare gli spettri EPR con la funzione lorentziana per trovare lo spessore della linea, LW. Valutare la sensibilità di microcristalli a pO2 come un pendio della dipendenza di LW pO2, vale a dire come un valore di (LWaria−LWanossia) /pO2air, dove LWaria e LWanossia sono spettri linewidth in condizioni di aria e anossia, rispettivamente; p O2air = 152 mm Hg.
  2. Funzione doppia sonda di pH e redox, NR
    Nota: La sonda NR è sintetizzata come descritto nel riferimento11. È stabile a temperatura ambiente come un solido sia in soluzioni acquose. La sonda NR sintetizzata è conservata a 4 ° C. Il splitting iperfine dell'azoto, unaNe il tasso di decadimento di ampiezza di segnale sono i parametri spettrali della sonda NR che sono sensibili al pH (sonda pKun = 6,6 a 37 ° C, gamma di sensibilità di pH da 5,6 a 7.6) e per la capacità di riduzione della sonda microambiente, rispettivamente.
    1. Rimuovere il NR dal freezer e lasciare il contenitore a temperatura ambiente (10-15 min). Pesare 6,34 mg della NR, scioglierli in 1 mL di soluzione salina e regolare il pH a 7,2 con piccole aliquote di HCl o NaOH utilizzando un pH-metro. Utilizzare la soluzione preparata di NR (10 mM) come una soluzione di riserva.
    2. Eseguire la calibrazione del pH della sonda NR come segue (Vedi riferimento11). In primo luogo, aggiungere 0,1 mL della soluzione madre NR 0,9 mL di tampone Na-fosfato di 2 mM, 150 mM NaCl. Titolare la soluzione ottenuta 1 mM NR con aliquote di HCl o NaOH al pH richiesto utilizzando un pH-metro. Controllare la temperatura usando un bagno di acqua collegato ad un termostato.
    3. Registrare gli spettri EPR dei campioni in microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando lo spettrometro EPR banda L. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione spettrometro EPR: modulazione di ampiezza, 2,5 G; frequenza di modulazione, 100 kHz; larghezza di spazzata, 60 G; tempo, 20 s.
    4. Misurare hyperfine spaccare costante (unaN) pari alla metà della distanza tra i componenti di basso e alto-campo degli spettri EPR e trama contro il pH, per fornire la curva di taratura per misure in banda L EPR di pH.
  3. Sonda Simonerasetti GSH-sensibile
    Nota: La sonda Simonerasetti viene sintetizzata come descritto nel riferimento15. Conservare la sonda NR sintetizzata a 4 ° C. Il biradical di bisolfuro Simonerasetti lipofilico composto si diffonde facilmente attraverso la membrana cellulare di reagire con GSH intracellulare e fornire un approccio affidabile per determinare GSH in vivo utilizzando EPR16,17. Questo metodo si basa sui tassi di reazione alta del pool intracellulare predominante dei tioli GSH con la sonda Simonerasetti. La reazione della biradical Simonerasetti con spaccature GSH relativo bisolfuro di legame (Vedi schema 1) con conseguente cancellazione dello scambio di spin tra due frammenti radicale e che si manifesta in una diminuzione delle componenti spettrali biradical e corrispondente aumento delle componenti monoradical. Per la sonda di Simonerasetti biradical, il tasso di aumento dell'ampiezza del componente monoradical è proporzionale alla concentrazione di GSH ed è un parametro di spettrali sensibili al GSH EPR conveniente. Per valutare la concentrazione di GSH dalle misurazioni di EPR in vivo , la taratura precedente del tasso di reazione Simonerasetti con GSH la corrispondente temperatura e pH deve essere eseguita come segue.
    1. Rimuovere il Simonerasetti dal freezer e lasciare il contenitore a temperatura ambiente (10-15 min). Pesare 4,05 mg della NR e dissolverlo in 1 mL di soluzione di DMSO. Utilizzare la soluzione preparata Simonerasetti (10 mM) come una soluzione di riserva.
    2. Determinare il valore del tasso costante, k diobs, della reazione di Simonerasetti con GSH la temperatura desiderabile e a pH come segue.
    3. In primo luogo, aggiungere 20 µ l di soluzione madre Simonerasetti (10 mM) a 0,98 mL di buffer di 1 mM Na-fosfato, pH 7,2, 150 mM NaCl, per ottenere un 0,2 mM Simonerasetti sonda soluzione.
    4. Preparare soluzioni di concentrazioni di 1, 2 e 5 mM di GSH in tampone di Na-fosfato 0,1 M a pH 7,2. Per valutare con precisione la concentrazione di GSH nelle cellule dell'organo mirata dalle misurazioni in vivo , la taratura in vitro deve essere eseguita a un pH vicino al valore del pH intracellulare.
    5. Mescolare volumi uguali di soluzione Simonerasetti 0,2 mM e una delle soluzioni GSH preparate al punto 1.3.4. per una concentrazione finale della sonda a 0,1 millimetri e di GSH a 0,5, 1 o 2,5 mM.
    6. Subito dopo Simonerasetti e GSH soluzione di miscelazione, il campione viene posto nel risonatore EPR e registrare gli spettri EPR ogni 12 secondi per 10 minuti. Quindi calcolare la cinetica dell'aumento dell'ampiezza spettrale monoradical. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione spettrometro EPR: modulazione di ampiezza, 1 G; frequenza di modulazione, 100 kHz; larghezza di spazzata, 60 G; tempo di sweep, 10-60 s.
    7. Montare la cinetica EPR misurata per il monoexponents e calcolare la costante di tempo della cinetica esponenziale, τ. La regressione lineare (1/τ = k ×obs [GSH]) fornisce il valore della costante tasso osservato della reazione tra GSH e Simonerasetti (ad es., 34 ° C e a pH 7,2, kobs = 2,8 ± 0,2 M-1s-1)11.
  4. Sonda di speranza multifunzionale per pO2, pH e valutazione Pi
    Nota: Il trityl monophosphonated speranza sonda è sintetizzato come descritto nel riferimento12 e viene mantenuto a 4 ° C. Gli spettri EPR CW di speranza al pH << pKa (una - forma acida) e pH >> pKa (B - forma di base) sono rappresentati da doppietti a causa di fosforo hyperfine spaccare, unP. Le impostazioni dello strumento tipico sono i seguenti: modulazione di ampiezza, 37,5 mG; frequenza di modulazione, 100 kHz; larghezza di spazzata, 0,9 G; tempo di sweep, 20-60 s. A pH intermedi (5 < pH < 8) lo spettro EPR di speranza sonda è caratterizzato da un quartetto quando entrambi A e B Stati sono presenti. Il linewidth EPR individuali della speranza è un indicatore di2 pO (precisione, ≈ 1 mmHg; p O2 range, 1-100 mmHg). La frazione di protonata speranza (una forma) è un indicatore di pH nell'intervallo da 6 a 8.0 (precisione, ± 0,05). Il valore del tasso di cambio del protone (espresso in mG) con Pi estratte mediante simulazione di spettri è un marcatore di Pi (precisione, ± 0,1 mM, gamma, 0.1-20mm). Le procedure di calibrazione vengono eseguite a temperatura fisiologica (37 ° C), forza ionica soluzione (NaCl, 150 mM) e concentrazione di sonda di speranza di 0,2 mM, come precedentemente descritto in riferimenti12,18e descritto di seguito.
    1. Rimuovere la sonda di speranza dal freezer e lasciare il contenitore a temperatura ambiente (10-15 min).
    2. Pesare 10,7 mg della sonda speranza, scioglierli in 1 mL di soluzione salina e regolare il pH a 7,4. Aggiungere 20 µ l della soluzione preparata stock della speranza (10 mM) a 0,98 mL della soluzione salina per ottenere un 0,2 mM speranza soluzione sonda.
    3. Per la calibrazione della sonda del pH, titolare 0,2 mM di soluzione della sonda la speranza con l'aggiunta di un piccolo volume di NaOH o HCl, con la diluizione finale del campione inferiore all'1%. Misurare il pH con un elettrodo di pH tarato a 37 ° C, utilizzando i valori di pH per la soluzione di riferimento raccomandata da Bureau Nazionale di standard (US). Utilizzare un becher rivestito reazione associato a un circolatore per mantenere la temperatura di riferimento e soluzioni titolate attentamente nelle misure di pH. Mantenere le condizioni anossiche con l'aggiunta di 10 millimetri di glucosio e ossidasi di glucosio 100 U/mL per le soluzioni di sonda.
    4. Acquisire gli spettri EPR delle forme A e B ≤ pH 5 e pH ≥ 8, rispettivamente, in condizioni di anossia in assenza del fosfato.
    5. Utilizzare gli spettri corrispondenti per ottenere parametri spettrali intrinseci. Vale a dire, è possibile simulare la linea spettrale come la convoluzione della funzione lorentziana con la funzione gaussiana che approssima la struttura iperfine super irrisolta della sonda speranza. Il raccordo degli spettri EPR calcolati per gli spettri sperimentali fornisce i valori diP e Lorentzian linewidth (ΔLpp), determinati dal tasso di rilassamento trasversale, 1/T2 (dove 1/T2 = (√ 3/2) Lpp per il derivato misurato della linea assorbimento RF in CW EPR) e il linewidth della distribuzione gaussiana, G.
      Nota: I seguenti sono i parametri ottenuti dallo spettro misurato alle condizioni specificate al punto 1.4.2: unP(A) = 3,63 G, unP(B) = 3,37 G; 1/T2(A) = 23,6 mG; 1/T2(B) = 9 mG; G(A) = 40 mG; G(B) = 45 mG (Vedi riferimento8).
    6. Acquisire gli spettri EPR della speranza a pH intermedi (5 < pH < 8). Simulare il componente ad alta-archiviato degli spettri EPR acquisiti utilizzando la teoria dello scambio tra diversi siti in sistemi non-accoppiato o loosely-coupled adattati da riferimento19 come descritto in precedenza18. Uso i parametri intrinseci ottenuti per la A e B (Vedi punto 1.4.5) per diminuire il numero di variabili. Montare gli spettri calcolati a quelli sperimentali per trovare i valori della frazione un p (A) e tracciare la dipendenza delvalore p sul pH. Utilizzare la dipendenza di pA sul pH in ulteriori studi come una curva di calibrazione del pH.
      Nota: La dipendenza di pH di p,A , con una curva di titolazione standard di montaggio fornisce il valore della dissociazione costante, pKun (spero) = 6,98. Negli studi in vivo , l'acquisizione di spettri EPR completo della sonda speranza è impraticabile a causa del tempo supplementare necessario per acquisire il divario tra i componenti di basso e alto-campo del fosforo hyperfine spaccare nello spettro EPR. Pertanto, in ulteriori studi esemplificati solo il componente archiviato alta dello spettro EPR ha misurato e analizzato.
    7. Per la calibrazione della sonda di pO2, acquisire spettri EPR della sonda speranza a varie concentrazioni di ossigeno.
    8. Controllo il pO2 valori delle soluzioni dalla bollitura con miscela di gas trasportato da un controller di gas. Controllare la temperatura della soluzione (37 ° C) usando un bagno di acqua collegato ad un termostato.
    9. Simulare gli spettri EPR e farli stare a quelli sperimentali, come descritto al punto 1.4.6 per determinare i valori delle velocità di rilassamento indotto da ossigeno.
      Nota: I valori delle velocità di rilassamento indotto da ossigeno erano 0,49 mG/mmHg entrambi per la A e forme B della speranza della sonda come misurato a 37 ° C8.
    10. Per la calibrazione della sonda di [Pi], acquisire spettri EPR della sonda speranza a varie concentrazioni di fosfato. Utilizzare la soluzione radicale di speranza con un pH vicino a pKun (pKun = 6,9 a 37 ° C)18 e titolare con varie concentrazioni di fosfato. Mantenere la composizione di gas e di temperatura come descritto nei passaggi precedenti.
    11. Simulare gli spettri EPR e farli stare a quelli sperimentali, come descritto al punto 1.4.6 per determinare i valori del tasso di cambio Pi-indotta.
      Nota: La dipendenza del tasso di cambio Pi-indotto [Pi] è usata come calibrazione in ulteriori studi.

2. Mouse modelli di cancro al seno

  1. Modello di MMTV-PyMT spontanea del tumore
    1. Utilizzare 4-8 settimana-vecchio amico virus tipo B suscettibilità/NIH (FVB/N) topo tumore mammario virus promotore (MMTV) polyoma medio-T antigene (PyMT +) i topi femminili con i tumori mammari spontaneamente formati per in vivo studi di EPR.
    2. Per il confronto di microambienti di tessuto delle ghiandole mammarie normali e dei tumori, utilizzare le femmine di pari età littermate carenti nel PyMT dell'oncogene (PyMT−, "wild type")20.
    3. Sottoporre i topi alla spettroscopia EPR banda L una volta alla settimana per quattro settimane durante l'anestesia isoflurano (vedere sonda consegna qui sotto).
    4. Anestetizzare il mouse usando una miscela di aria-isoflurano (3% isoflurano) e posizionare il mouse su un tavolo regolabile in posizione laterale destra con il tumore (ghiandole mammarie) vicino il risonatore di bobina di superficie.
    5. Dopo il posizionamento del mouse, amministrare la sonda di iniezione di intratissual (i.t.), ottimizzare lo spettrometro EPR e acquisire gli spettri EPR per 5-10 min.
    6. Misura 2-3 tumori mammari (da MMTV-PyMT + mouse) o del non tumore cuscinetto ghiandole mammarie (da topi PyMT−) durante la stessa sessione EPR.
  2. Modello del tumore orthotopic MET-1
    1. Crescere cellule di cancro mammario murino sfondo Met-1 FVB/N a 37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità relativa in DMEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS), 10 µ g/mL insulina, rhEGF 5 ng/mL e 1% PSA (penicillina G sodica, solfato di streptomicina e amfotericina B) a ~ 80% confluenza in una boccetta di T175.
    2. Aspirare i media e sciacquare le celle aderenti con 10 mL di PBS (1,54 millimetri KH2PO4, 155 mM NaCl e 2,71 mM Na2HPO4-7h2O senza cloruro di calcio o cloruro di magnesio, pH = 7.4).
    3. Staccare le cellule aggiungendo 5 mL di soluzione di tripsina-EDTA di 0,25% e a dondolo il pallone. Quando le cellule sono disconnessi, aggiungere 10 mL DMEM contenente 10% FBS al pallone e raccogliere le cellule.
    4. Centrifugare la sospensione cellulare a 132 x g per 10 min a 4 ° C. Contare le celle utilizzando un emocitometro e risospendere a 1 x 106 cellule per 100 µ l minimo DMEM.
    5. Usando una siringa da insulina (ago 29 1/2), iniettare lentamente 100 µ l di sospensione cellulare del tumore nel pad grasso mammario numero 4 del 8-settimana-vecchi topi femminili di wild-type FVB/N.
    6. Monitorare l'inizio del tumore tramite la palpazione (appaiono dopo circa 2-3 settimane), crescita (visivo) e del mouse heath (visual) ogni altro giorno.
    7. Misurare le dimensioni del tumore una volta alla settimana utilizzando pinze e determinare volumi del tumore usando l'equazione:
      Figure

3. consegna della sonda per misure di funzionale In Vivo

  1. Sonda di LiNc-BuO particolato uso (protocollo I) per misurazioni2 pO in modelli di tumore ortotopici impiantando le cellule del tumore con interiorizzato LiNc-BuO microcristalli come precedentemente descritto14,21 e descritto di seguito.
    1. Nel caso del modello di tumore di MET-1, per internalizzazione di LiNc-BuO microcristalli nelle cellule MET-1, sospendere i microcristalli di LiNc-BuO in DMEM ad una concentrazione di 20 mg/mL e Sonicare con un sonicatore sonda a 20 kHz utilizzando 7 W di potenza in un tubo di turno-fondo 5 mL vetro per 5 min sul ghiaccio.
    2. Aggiungere 100 µ l (2 mg di LiNc-BuO) della sospensione in un pallone da T75 con 10 mL di coltura contenenti cellule MET-1 (circa 30% confluenti). Tutte le procedure avvengono in un armadio di sicurezza biologica e il supporto contiene penicillina e streptomicina per minimizzare la potenziale infezione.
    3. Incubare le cellule a 37 ° C per 72 h o fino a quando raggiungono ~ confluency di 80%.
    4. Aspirare i media. Lavare le cellule cinque volte con 10 mL di PBS. Staccare le cellule con 5 mL di tripsina-EDTA. Raccogliere le cellule. Centrifuga come descritto sopra al punto 2.2.4. Macchia di un campione di cellule con tintura di esclusione per determinare la quantità e la vitalità cellulare.
    5. Sospendere le cellule ad una concentrazione di 1 x 106 a 100 µ l minimo DMEM.
    6. Utilizzando una siringa da insulina, iniettare lentamente 100 µ l di sospensione cellulare contenente i microcristalli di LiNc-BuO interiorizzato nell'adiposità mammaria numero 4 dei topi wild-type FVB/N 8-settimana-vecchio femminili come descritto nel passaggio 2.2.5.
    7. Monitorare la crescita e l'inizio del tumore come descritto nei passaggi 2.2.6 e 2.2.7.
  2. Sonda di LiNc-BuO particolato uso (protocollo II) in uno spontaneo o Modelli ortotopici. Iniettare LiNc-OBu microcristalli presso il sito di interesse, ad esempio, in ghiandole mammarie normali o tumori mammari, utilizzando una siringa da insulina.
  3. Sonde solubile
    1. Anestetizzare i topi da inalazione di una miscela di aria-isoflurano (portata fino a 1,0 L/min e 2-3% di isoflurane) utilizzando un'anestesia macchina e metterli nella fessura dello spettrometro EPR.
    2. Accordare lo strumento, quindi iniettare il NR (10-30 µ l, 10 mM), la sonda di speranza (10−30 µ l, 0,5-2 mM) in soluzione fisiologica, pH 7,2 o sonda Simonerasetti nelle soluzioni di DMSO (10 µ l, 10 mM) (i.t.).

4. in Vivo misure funzionali

  1. Per misure spettroscopiche di EPR, anestetizzare i topi per inalazione della miscela aria-isoflurano utilizzando una macchina per anestesia come descritto al punto 3.3.1.
  2. Eseguire misurazioni funzionali mediante spettrometro EPR banda L (1,2 GHz) come segue.
    1. Posizionare il risonatore di bobina di superficie su una normale della ghiandola mammaria o un tumore mammario e sintonizzare lo spettrometro.
    2. Acquisire gli spettri EPR dalla sonda del particolato impiantato per 5−10 min sopra parecchie settimane dopo l'impianto. Nel caso di sonde solubile, è necessario acquisire gli spettri EPR immediatamente dopo l'iniezione di sonda per 5-10 min.
    3. Analizzare gli spettri EPR della sonda NR per trovare il hyperfine spaccare, unaNe l'ampiezza del segnale, i (t). Consente di convertire il valore di unN il valore di pH utilizzando la curva di calibrazione ottenuta al passaggio 1.2.4. Analizzare la velocità di decadimento dell'ampiezza del segnale i (t) come variazione relativa dall'ampiezza iniziale, I(t = 0), calcolata in unità arbitrarie al secondo (s-1).
    4. Adattare l'aumento della componente monoradical dello spettro EPR della sonda di GSH sensibili Simonerasetti a monoexponents per ottenere la costante di tempo della cinetica esponenziale per calcolare la concentrazione di GSH.
    5. Montare gli spettri EPR ad alto campo componente della sonda speranza multifunzionale a quelli sperimentali come descritto in (punto 1.4.5) per produrre i valori di pH, pO2 e Pi.

5. elaborazione statistica

  1. Eseguire l'elaborazione dati e analisi statistiche. Utilizzare test di correlazione di Pearson, una r (per set di dati distribuiti normalmente) e Rank ordine correlazione di Spearman (per set di dati con rifiutati normalità della distribuzione dei dati) per analisi di correlazione.

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Representative Results

Tessuto p O 2 Sonde di valutazione utilizzando il LiNc-BuO:

Utilizzando la procedura descritta nella sezione passaggio 1.1, abbiamo effettuato la taratura della sospensione di microcristalli LiNc-BuO preparati al momento. Figura 2 Mostra la dipendenza di ossigeno tipico di linewidth della sonda LiNc-BuO, nonché suoi spettri EPR esemplificati misurati in sospensione di buffer e nel tessuto del tumore del seno nei topi C57Bl/6 femmina cresciuta dopo l'inizio del tumore tramite l'iniezione di cellule con particelle interiorizzate (punto 3.1). Utilizzando la calibrazione linewidth permette per il calcolo del valore2 tessuto pO (pari a 7,5 mmHg per lo spettro (b) mostrato in Figura 2).

Figure 2
Figura 2 . Sensibilità spettrale EPR della sonda LiNc-BuO particolata all'ossigeno. Dipendenza da rappresentanza di linewidth dello spettro EPR della sospensione sonda LiNc-BuO in DMEM su pressione parziale di ossigeno è mostrato. Lo spettro EPR (Inserisci un) è stato misurato allo 0% di pO2, 37 ° C e rappresenta una linea di Lorentzian pura con il Δ linewidthHpp = 113 mG. Il linewidth aumenta linearmente con pO2 con una pendenza di 11,7 mG/mmHg. Lo spettro mostrato in (inserto b) è stato misurato nel tessuto del tumore mammario dei topi C57Bl/6 femminili anestetizzati risultati ΔHpp = 204 mG, che corrisponde al tessuto pO2 di 7,5 mmHg. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Valutazione del tessuto extracellulare pH e Redox utilizzando il NR sonde:

Utilizzando la procedura descritta nella sezione passaggio 1.2, abbiamo effettuato la taratura della sonda pH e redox, NR. La figura 3 Mostra l'iperfine osservata spaccare costante dipendenza, unaN, della NR radicale sul pH. La dipendenza è descritta da una curva di titolazione standard con il pKun = 6,6 a 37 ° C. Questa dipendenza di unaN(pH) serve come la curva di taratura per in vivo misure corrispondenti, permettendo per misure di pH nell'intervallo da 5,6 a 7.6, con una precisione di 0,05 unità di pH.

Figure 3
Figura 3 . Sensibilità spettrale EPR della sonda NR solubile a pH. Spettri EPR banda L della soluzione sonda NR sono stato acquistati a 37 ° C a vari pH e pH-dipendenza dell'iperfine osservata spaccare costante, unaN, è stata tracciata. La linea continua è la misura dei dati sperimentali con la curva di titolazione standard, Equation 2 , producendo pKun = 6.6, unaN(NR-H+) = 14,24 G e unaN(R) = 15.27 G. Insert: spettro EPR esemplificato, di 1 mM NR soluzione (pH 6,4), che ha acquisito utilizzando le seguenti impostazioni di spettrometro: spazzata del campo magnetico, 80 G; tempo di modulazione ampiezza, 2,5 G, acquisizione, 20 s. Il misurato hyperfine spaccare costante è 14.63 G. riprodotto dal riferimento23 con il permesso di John Wiley & Sons, Inc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 esemplifica le misurazioni di pH e redox in un modello murino di tumore al seno, eseguita come descritto al punto 3.3 (iniezione di sonda i.t.) e sezione 4 (acquisizione di spettri e analisi degli spettri).

Figure 4
Figura 4 . Valutazione di EPR del tessuto, riducendo la capacità in vivo. Inserto: Spettro di banda L EPR della sonda NR misurato in vivo dopo l'iniezione di i.t. (10 µ l, 10 mM) nel tessuto del tumore mammario dei topi FVB/N femminili anestetizzati. Hyperfine spaccare, unaN, è stato trovato per essere uguale a 14,72 G, che corrisponde al valore di pHe = 6,52 supponendo che il tumore del tessuto temperatura 34 ° C e pKun = 6.6. Il tasso di riduzione NR viene valutato seguendo il decadimento del componente spettrale centrale-campo. La cinetica esemplificata misurata nel tumore mammario (■) e ghiandole mammarie (o) dimostrare maggiore capacità di riduzione del tessuto del tumore vs normale della ghiandola mammaria. L'analisi della parte iniziale della cinetica produce le tariffe della riduzione segnale EPR, krosso, nei media extracellulari dei tessuti come 2,5 x 10-3/snel tumore vs 0,5 x 10-3/s nella ghiandola normale. Riprodotto da riferimento11 con il permesso di John Wiley & Sons, Inc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 riassume le misure di pHe e redox eseguite per il gruppo di topi FVB/N MMTV-PyMT femminili in tumori e ghiandole mammarie normali supporto siliceo microambiente extracellulare del tumore e ad alta capacità riducente.

Figure 5
Figura 5 . In vivo Valutazione EPR dell'acidità dei tessuti e riducendo la capacità. PH extracellulare del tessuto (riempito bar) e la riduzione del tasso (barre vuote) valori di nitrossidi NR in ghiandole mammarie normali e tumori mammari di topi FVB/N femmina misurati in vivo EPR. Barre di errore indicano SE. riprodotto da riferimento11 con il permesso di John Wiley & Sons, Inc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

PH del tessuto simultanee e , Redox, e p O 2 Valutazione combinando NR e LiNc-BuO sonde:

Particolato LiNc-BuO è la sonda di scelta quando misurazioni ripetitive longitudinale di pO2 valori sono previsti in un tessuto predeterminato di interesse. Purtroppo, una limitazione importante della sonda del particolato è che solo consente il rilevamento di ossigeno e senza altri parametri chimici fisiologicamente rilevanti all'interno della TME e non consente la formazione immagine del tessuto. Così, l'uso di sonde solubile in EPR hanno il vantaggio di formazione immagine e il rilevamento di diversi parametri TME fisiologicamente rilevanti. A questo proposito, pO2 misurazioni utilizzando impiantato LiNc-BuO particelle possono essere combinate con il pH a doppia funzione e sonda redox NR perché componenti spettrali di basso e ad alto campo dello spettro EPR NR non si sovrappongono con la linea EPR della Sonda di LiNc-BuO.

La figura 6 illustra un tipico spettro EPR osservato dalla sonda NR immediatamente dopo l'iniezione di i.t. nel tessuto del tumore del seno di topi femminili C57Bl/6. Lo spettro osservato tripletta della sonda NR è overlaid con la singola riga EPR di microcristalli di LiNc-BuO che sono stati incorporati all'interno del tumore (la crescita del tumore è stata avviata tramite l'iniezione delle cellule con particelle interiorizzate come descritto al punto 3.1. Il valore del pH viene calcolato misurando un splitting iperfineN come una distanza tra i componenti di basso e alto-campo e utilizzando la taratura mostrata in Figura 3 (pari a 6,88) per lo spettro mostrato nella Figura 6. Nota che viene eseguita la valutazione2 pO basato su misurazioni di linewidth del segnale LiNc-BuO prima dell'iniezione della sonda NR. Il decadimento del segnale NR fornisce il valore del tessuto, riducendo la capacità come illustrato nella Figura 4.

Figure 6
Figura 6 . Sonde di valutazione di TME multifunzionale che unisce LiNc-BuO e NR. EPR spettro misurato in vivo nel tessuto del tumore mammario del topo C57Bl/6 femmina immediatamente dopo l'iniezione di i.t. della sonda NR. Lo spettro osservato tripletto del NR si sovrappone con una sola linea EPR di LiNc-BuO sonde incorporato all'interno del tumore. Il valore di pH calcolato dallo spaccare tra componenti di basso e alto-campo è 6.88. Il decadimento del segnale NR fornisce il valore del tessuto, riducendo la capacità. p O2 valutazione viene eseguita in base alle misure del linewidth di LiNc-BuO prima dell'iniezione della sonda NR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In Vivo Valutazione di GSH intracellulare:

La reazione di scambio tiolo-bisolfuro tra la sonda di Simonerasetti e GSH divide il ponte disolfuro della sonda con conseguente formazione di due monoradicals22 e cancellazione di scambio intramolecolare spin tra i frammenti di monoradical. Figura 7A illustra l'effetto della reazione della sonda Simonerasetti con GSH sugli spettri EPR conseguente la scomparsa delle componenti spettrali "biradical" e il corrispondente aumento dell'intensità dei componenti monoradical. È la costante di tasso osservato della reazione tra GSH e Simonerasetti: kobs = 2,8 ± 0,2 M-1s-1 (T = 34 ° C, pH 7,2)11. Figura 7B esemplifica la cinetica del cambiamento di intensità di picco spettrale monoradical misurato nel tumore mammario (●) e normale della ghiandola mammaria (o) utilizzando L-band EPR. Le linee continue sono le misure della parte iniziale della cinetica di monoexponent utilizzando kobs = 2,8 M-1s-1 e producendo [GSH] = 10,7 mM e 3,3 mM per il tumore e normale della ghiandola mammaria, rispettivamente.

Figure 7
Figura 7 . In vivo Valutazione EPR delle concentrazioni di glutatione intracellulare del tessuto. (A), la X-band tra gli spettri EPR di 100 µM Simonerasetti misurati ai vari intervalli di tempo dopo incubazione con 2,5 mM GSH in 0.1 M Na-fosfato tampone, pH 7,2 e 1mm DTPA a 34 ° C. L'analisi cinetica fornisce il valore della costante tasso osservato della reazione tra GSH e Simonerasetti, kobs (pH 7.2, 34 ° C) = (2,8 ± 0,2) M-1 s-1. (B) la cinetica del cambiamento di intensità di picco spettrale monoradical misurata da banda L EPR nel tumore mammario (●) e normale della ghiandola mammaria (o) dei topi FVB/N immediatamente dopo l'iniezione di i.t. di Simonerasetti sonda (Vedi punto 3.3.2). Le linee continue sono le misure della parte iniziale della cinetica di monoexponent, supponendo kobs (pH 7.2, 34 ° C) = 2,8 M-1s-1 e producendo [GSH] = 10,7 mM e 3,3 mM per il tumore e normale della ghiandola mammaria, rispettivamente. Riprodotto da riferimento11 con il permesso di John Wiley & Sons, Inc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Valutazione multifunzionale del tessuto extracellulare pH, p O 2 e Pi usando la sonda multifunzionale di speranza:

Figura 8 illustra la sensibilità dei parametri spettrali della sonda speranza ottenute utilizzando le procedure di taratura descritte nella sezione 1.4.

Figure 8
Figura 8 . Valutazione multifunzionale del microambiente chimico usando sonda speranza. (un) il regime di equilibrio di pH-dipendente tra due stati di ionizzazione della sonda. (b) L-band EPR spettro di speranza. (c) The EPR linewidth della speranza è un indicatore di2 pO (precisione, ≈ 1 mmHg; p O2 range, 1-100 mmHg). (d), la frazione di protonata speranza è un indicatore di pH nell'intervallo da 6 a 8.0 (precisione, ± 0,05). (e) dipendenza del tasso di cambio del protone (espresso in mG) della speranza con concentrazione di fosfato inorganico (Pi) estratte da spettri simulazione (precisione, ± 0,1 mM, gamma, 0.1-20mm) 12,18. Riprodotto da riferimento8 con permesso del Nature Publishing Group. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9 illustra multifunzionale misure effettuate nelle ghiandole mammarie FVB/N wild-type e nei topi transgenici TME di MMTV-PyMT, che spontaneamente sviluppano il cancro al seno ed emulano umane del tumore20di gestione temporanea. I valori medi di pO2 (50 ± 3 mmHg in TME vs 58 ± 3 mmHg nel tessuto normale) e di pHe (6.99 ± 0.03 in TME vs 7,1 ± 0.03 in tessuto normale) sostengono un aspetto delle regioni ipossiche e acide nel tumore. I cambiamenti più drammatici sono stati osservati nella concentrazione di Pi interstiziale (1,8 ± 0,2 mM in TME vs 0.84 ± 0,07 mM nel tessuto normale) che indica un ruolo potenziale della concentrazione interstiziale di Pi come un marcatore TME della progressione del tumore. Le misurazioni individuali mostrano significative variazioni attorno i valori medi. Un importante vantaggio di una sonda multifunzione è che tutti i parametri sono misurati utilizzando una singola sonda, consentendo quindi per analisi di correlazione indipendente della sonda la distribuzione e l'ora delle misurazioni come illustrato in Figura 9b- e. La correlazione positiva osservata tra pO2 e pHe nella ghiandola mammaria normale contro l'assenza di correlazione nei tumori supporta affidarsi tumore glicolisi indipendente della concentrazione di ossigeno; a nostro parere questa è una dimostrazione esemplificato in vivo dell'effetto Warburg. A sua volta, la correlazione negativa osservata tra interstiziale [Pi] e pO2 sia in tessuti normali e tumorali è d'accordo con l'associazione di alta [Pi] (e rapporto ATP/Pi basso) con i cambiamenti nello stato di bioenergetica all'ossigeno inferiore fornitura.

Figure 9
Figura 9 . In vivo tessuto p O 2 pH e e Pi valutazione utilizzando la sonda di speranza ed EPR. (una) fotografia dell'allestimento per in vivo banda L misure EPR Mostra il mouse anestetizzato tra i magneti dello spettrometro EPR, con l'inserto sulla destra mostrando collocamento e posizionamento del risonatore ciclo sul tessuto misurato. Si noti la localizzazione extracellulare interstiziale della sonda speranza: esso non penetrare nelle cellule a causa di ingombranti strutture cariche e il segnale di speranza dal sangue non viene rilevato da EPR a causa di segnale ampliando di complessazione di speranza con l'albumina del plasma24 . (b–e) Correlazione tra interstiziale pO2, pHee Pi valori misurati in normali ghiandole mammarie di topi wild type FVB/N ed nella TME di cancro al seno in topi transgenici MMTV-PyMT (n = 23). Per estendere la gamma di variazioni di ossigeno, condizioni anossiche nello spazio interstiziale sono state stabilite tramite l'iniezione di i.t. del sistema enzimatico che consumano ossigeno del glucosio/glucosio ossidasi (simboli rossi). Linee blu rappresentano una misura lineare per i set di dati totale. (b) una correlazione positiva tra pO2 e pHe nel tessuto normale (r = 0,5, p = 0,014 per nero simboli; r = 0,64, p = 1,8 × 10-4 per set di dati totale) vs (c) non significativo correlazione tra pO2 e pHe nella TME (r = 0,01, p = 0,97 per nero simboli; r = 0.23, p = 0,3 per set di dati totale) sono stati trovati. (d) un negativo correlazione tra pO2 e Pi entrambi nel tessuto normale (r = −0.51, p = 0,013 per nero simboli; r = −0.7, p = 2,3 × 10-5 per set di dati totale) e (e) nella TME (b, fondo: r = −0.4, p = 0,079 per simboli neri; r = −0.62, p = 0,001 per set di dati totale) sono stati trovati. Adattato da riferimento8 con permesso con del Nature Publishing Group. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I metodi presentati consentono per la valutazione non invasiva in vivo dei parametri critici della TME chimica, vale a dire pO2, pH, stato redox e le concentrazioni di GSH intracellulare e interstiziale Pi. Tecniche di risonanza magnetica, quali MRI e basso campo EPR, sono i metodi di scelta per non invasiva in vivo profilatura di questi parametri TME. MRI Visualizza le strutture anatomiche, ma manca di sensibilità funzionale. In contrasto con MRI, EPR tecniche forniscono sensibilità funzionale ai parametri locali del microambiente quando usato in combinazione con sonde di spin funzionale. A nostra conoscenza, non ci sono nessun altri metodi disponibili per valutare simultaneamente in vivo fisiologicamente importanti parametri TME chimici in soggetti viventi, come pO2, pHe, Pi, redox e GSH.

I protocolli descritti sono basati sull'utilizzo di basso campo banda L EPR e appositamente progettato sonde paramagnetiche. Un insieme di quattro sonde presentato nella Figura 1 può essere considerato un test di valutazione del TME efficaci in vivo . Disponibilità delle sonde è un presupposto importante per le misurazioni di EPR descritto in vivo . La sintesi delle sonde secondo le procedure pubblicate11,12,13,15 richiede competenze in chimica organica sintetica e può diventare un passaggio fondamentale per l'implementazione del metodo .

Applicazione della sonda del particolato consente misurazioni ripetute di tessuto pO2 per fino a settimane dopo l'impianto14,21. Sonde solubile dimostrano sensibilità a un esteso numero dei parametri di là dell'ossigeno concentrazione25 e forniscono un'opportunità per misure spaziali risolto26. In particolare, un'applicazione della sonda speranza multifunzionale offre opportunità insuperabile per in vivo misurazioni simultanee di pH, pO2e Pi nello spazio extracellulare. Le misure dei tre parametri utilizzando una singola sonda permette per le loro analisi di correlazione indipendente di distribuzione sonda e ora delle misurazioni8.

Le sonde non possono essere utilizzate contemporaneamente, fatta eccezione per la sonda di particolato LiNc-BuO impiantata, che può essere utilizzata in combinazione con una qualsiasi delle sonde solubili come dimostrato nella Figura 6. Pertanto, il disegno sperimentale dovrebbe essere basato su misurazioni separate delle singole iniezioni di sonde solubile funzionali specifiche. Il pH extracellulare idrofilo e la sonda redox NR possono essere consegnati sia via i.t. iniezione11,14,26 e consegna sistemica27, mentre altre due sonde solubile, Simonerasetti e speranza, consentire i.t. consegna solo 8 , 11 , 12 , 16. nota che le future modifiche strutturali di Simonerasetti e di speranza sonde può superare il limite di quest'ultimo di consegna sonda tramite lo sviluppo di analoghi di sonda più idrofilici e meno tossici per consegna sistemica25.

Si noti che la modalità EPR spettroscopica fornisce i valori medi dei parametri misurati nella TME, che spesso è caratterizzata dalla sua alta eterogeneità. Questo parzialmente le potenziali differenze tra i parametri di maschere o diminuisce significato nell'analisi di correlazione. L'uso delle sonde descritte in diversi tipi di imaging consente di ottenere informazioni funzionali risolta spazialmente26. Noi crediamo che il futuro dell'imaging multi-funzionale di EPR si basa sullo sviluppo di metodologie relativamente nuovi, quali scansione rapida EPR imaging e MRI a Overhauser (OMRI, anche chiamato protone-elettrone double-risonanza, PEDRI). Le nuove direzioni nello sviluppo di funzionale EPR sonde e tecniche avanzate di imaging sono state recentemente discusse la corrispondente funzione articolo25.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da NIH concede CA194013, CA192064 e U54GM104942. Il WVCTSI è riconosciuto per start-up a VVK, AB e TDE. Gli autori ringraziano il Dr. M. Gencheva e K. Steinberger per l'assistenza con gli esperimenti illustrativi. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-band EPR spectrometer Magnettech, Germany L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules
 Temperature & Gas Controller  Noxygen, Germany Temperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition  
Sonicator Fisher Scientific
GSH (L-Glutathione reduced) Sigma-Aldrich G4251
MMTV-PyMT  mice In house
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Met-1 murine breast cancer cells In house
C57Bl/6 wild type mice  Jackson Laboratory
Trypsin Thermo Fisher Scientific 25200056
Trypan Blue Exclusion Dye  Thermo Fisher Scientific T10282
Ohmeda Fluotec 3 
Isoflurane (IsoFlo) Abbott Laboratories
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic sigma-Aldrich S07051
Sodium Chloride sigma-Aldrich S7653
Hydrochloric acid sigma-Aldrich 320331
Sodium Hydroxide sigma-Aldrich S8045
Glucose sigma-Aldrich
Glucose oxydase sigma-Aldrich
Lauda Circulator E100 Lauda-Brikmann
pH meter Orion Thermo Scientific 
LiNc-BuO probe In house The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13
NR probe In house The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11
RSSR probe In house The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15
HOPE probe In house The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12

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References

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