Preconditionering de luchtwegen van muizen met bleomycine verhoogt de efficiëntie van Orthotopic long kanker cel Engraftment
Summary
Beschrijven we een methode om engraftment van de orthotopic van longkanker kankercellen in de longen lymfkliertest aanzienlijk te verbeteren door preconditionering van de luchtwegen met blessure. Deze benadering kan ook worden toegepast om te studeren stromale interacties binnen de longen communicatie, gemetastaseerde verspreiding, long kanker co morbiditeit en efficiënter genereren patiënt afgeleid xenografts.
Abstract
Longkanker is een dodelijke behandeling vuurvaste ziekte die biologisch heterogeen is. Om te begrijpen en effectief behandelen het volledige klinische spectrum van thoracale maligniteiten, zijn extra dierlijke modellen die diverse menselijke long kanker subtypen en stadia kunnen recapituleren nodig. Allograft of xenograft modellen zijn veelzijdig en inschakelen van de kwantificering van tumorigene capaciteit in vivo, met behulp van kwaadaardige cellen van lymfkliertest of menselijke oorsprong. Echter zijn eerder beschreven methoden voor long kanker cel engraftment uitgevoerd in niet-fysiologische sites, zoals de flank van muizen, te wijten aan de inefficiëntie van orthotopic transplantatie van cellen in de longen. In deze studie beschrijven we een methode ter verbetering van orthotopic long kanker cel engraftment door preconditionering de luchtwegen van muizen met de fibrose inducerend agent bleomycine. Als een experiment van proof-of-concept, wij deze aanpak om het engraft van tumorcellen van het Long adenocarcinoom subtype, verkregen uit de muis of menselijke bronnen, in verschillende muizenstammen toegepast. We laten zien dat het verwonden van de luchtwegen met bleomycine vóór tumor cel injectie de engraftment van tumorcellen van 0-17 verhoogt % tot 71-100%. Deze methode verbeterde aanzienlijk, Long tumor incidentie en verdere uitgroei met behulp van verschillende modellen en muis stammen. Daarnaast verspreiden werk Long kankercellen uit de longen in relevante verre organen. Dus, wij bieden een protocol dat kan worden gebruikt om te stellen en onderhouden van nieuwe modellen van de orthotopic van longkanker met beperking van de hoeveelheid cellen of biospecimen en kwantitatief beoordelen de tumorigene capaciteit van Long kankercellen in fysiologisch relevante instellingen .
Introduction
Longkanker is de belangrijkste oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen wereldwijd1. Patiënten met longkanker bezwijken uiteindelijk van metastase tot verre organen, met name aan het centraal zenuwstelsel, lever, bijnieren en botten2,3,4. Thoracale maligniteiten zijn traditioneel ingedeeld als kleincellige longkanker (SCLC) of niet-kleincellige longkanker kanker (NKCLK)5. NKCLK is de meest vaak gediagnosticeerd maligniteit en kan worden onderverdeeld in verschillende histologische subtypes, met inbegrip van adenocarcinoom van de Long (LUAD) en Long plaveiselcelcarcinoom (LUSC)6. Genomic analyse van gereseceerd menselijke primaire longkankerziekten is gebleken dat de tumoren binnen een bepaalde histotype ook divers moleculaire verstoringen, verder bij te dragen aan hun uiteenlopende klinische progressie en verstorende patiënt prognose kunnen uitdrukken. De opmerkelijke heterogeniteit van de longkankerziekten vormt een aanzienlijke uitdaging voor het rationele ontwerp preklinisch onderzoek en uitvoering van effectieve therapeutische strategieën. Daarom is er een noodzaak om uit te breiden van het repertoire van hanteerbare experimentele long kanker modellen te bestuderen van de verschillende cellulaire oorsprong, moleculaire subtypen en stadia van deze ziekte.
Verschillende benaderingen met behulp van dierlijke modellen zijn tewerkgesteld long kanker om te studeren in vivo, elk met hun eigen voor- en nadelen, afhankelijk van de biologische vragen van belang. Genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMMs) kunnen richten op specifieke genetische wijzigingen in een bepaalde voorlopercellen celtype, resulterend in tumoren die vooruitgang binnen een immunocompetent host7. Terwijl zeer krachtig en klinisch relevante, kunnen de latency, variabiliteit, en/of Long tumor morbiditeit geassocieerd met GEMMs verbiedend met bepaalde kwantitatieve metingen en de detectie van late stadium metastase in verre organen8. Een complementaire benadering is het gebruik van allograft modellen, waarbij Long kankercellen, hetzij rechtstreeks uit een muis tumor verkregen of afgeleid eerst als het gevestigde cellijnen in cultuur, opnieuw binnengebracht in syngeneic hosts worden. Naar analogie, zijn long kanker xenografts gevestigd van menselijke cellijnen of patiënt afgeleide tumor monsters. Menselijke cel lijn xenografts of patiënt afgeleide xenografts (PDXs) zijn over het algemeen gehandhaafd bij immuungecompromitteerde muizen en daarom beletten volledig immuun-surveillance9. Ondanks dit nadeel bieden zij een laan voor het doorgeven van de beperking van de hoeveelheid menselijke biospecimens en studie fundamentele in vivo eigenschappen van menselijke kankercellen, die voor meer complexe genomic afwijkingen dan GEMM tumoren coderen.
Een nuttige eigenschap van allografts en xenografts is dat ze vatbaar voor traditionele beperkende cel verdunning testen, werkzaam te kwantificeren van de frequentie van de tumor cellen (TICs) binnen een kwaadaardige cel bevolking10initiëren. In deze experimenten, een bepaald aantal cellen worden subcutaan ingespoten in de flank van de dieren en de frequentie van de TICs kan worden geschat op basis van de tumor te nemen koers. Subcutane tumoren kunnen echter meer hypoxische11 en kunnen niet zeer belangrijke fysiologische beperkingen van de Long tumor communicatie model. Intratracheale levering van epitheliale stam of voorlopercellen in de longen van muizen is een methode om te studeren pulmonaire regeneratie en airway stamcel biologie12. Het tarief van de engraftment van deze techniek kan echter relatief laag, tenzij de longen eerst aan fysiologische vormen van schade, zoals virale infectie13,14 onderworpen zijn. Ondersteuning van inflammatoire stromale cellen en/of de verstoring van het membraan van de kelder Long kan in de cel van de stam van de relevante niches in de distale airways15eigendomsvoorbehoud getransplanteerde cellen verbeteren. Fibrose inducerende agenten kan ook vooraf een voorwaarde van de longen te verbeteren engraftment van geïnduceerde pluripotente cellen16 pt17van de mesenchymale stamcellen. Of soortgelijke beschermingsvormen airway letsel kunnen invloed hebben op het engraftment tarief, hebben tumor-initiërende capaciteit, en uitgroei van Long kankercellen nog systematisch worden beoordeeld.
In deze studie beschrijven we een methode te vergroten van de doelmatigheid van orthotopic long kanker cel engraftment, door preconditionering de longen van muizen met blessure. LUAD ontstaat in de distale airways met een grote subset van deze kankers ontwikkelen een fibrotische stroma18 die vaak met slechte prognose19 correleert. Bleomycine, een natuurlijke nonribosomal hybride peptide-polyketide, is uitgebreid om te induceren van longfibrose in muizen20gebruikt. Airway instillation van bleomycine bevordert eerst epitheliale uitputtingsslag in de longblaasjes en rekrutering van ontstekingscellen, met inbegrip van macrofagen, neutrofiele granulocyten en monocyten21. Dit wordt gevolgd door de weefsel remodeling in de distale airways, kelder membraan reorganisatie22,23 pt24afzetting extracellulaire matrix (ECM). De effecten van een enkele Bleomycine injectie zijn voorbijgaande, met fibrosis oplossen na 30 dagen in de meeste studies25. Met behulp van zowel allograft en xenograft modellen, we getest als preconditionering de luchtwegen van muizen met bleomycine aanzienlijk van de te nemen koers van LUAD cellen in de longen verhogen kan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Opvallende klinische parallellen zijn gedocumenteerd tussen longkanker en andere chronische ziekten van de Long-36. Met name patiënten met idiopathische longfibrose (IPF) hebben een verhoogde voorliefde voor ontwikkelende longkanker, en deze vereniging is onafhankelijk van roken geschiedenis37,38. IPF wordt gekenmerkt door progressieve vernietiging van Long architectuur en verminderde ademhalingsfunctie door afzetting van ECM<sup class="x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door subsidies van het National Cancer Institute (R01CA166376 en R01CA191489 te D.X. Nguyen) en het ministerie van defensie (W81XWH-16-1-0227 te D.X. Nguyen).
Materials
| Bleomycin | Sigma | B5507-15UN | CAUTION Health hazard GHS08 |
| Exel Catheter 24G | Fisher | 1484121 | Remove needle. For intratracheal injection |
| Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) | Butler Schein | 56344 | To anesthetize mice |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 | To anesthetize mice |
| Ketoprofen, 5,000 mg | Cayman Chemical | 10006661 | Analgesic |
| Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment | BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC | 8897 | To prevent eye dryness while under anesthesia |
| D-Luciferin powder | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 122799 | For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light |
| Rodent Intubation stand | Braintree Scientific | RIS-100 | Recommended stand for intratracheal injection |
| MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 | DOLAN-JENNER INDUSTRIES | MI-150 / EEG2823M | To illuminate and visualize trachea |
| Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat | Roboz | RS-5111 | For intratracheal injection |
| Syringe Luer-Lok Sterile 5ml | BD / Fisher | 309646 | |
| Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver | Conair | – | To shave mice |
| Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades | Roboz | RS-5840SC | |
| 15 mL conical tube | BD / Fisher | 352097 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA SCIENTIFIC INC | 1615-5500 | |
| Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI | Fisher | 701350 | |
| Filter pipette tips (200 μL) | USA SCIENTIFIC INC | 1120-8710 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| DMEM high glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum USDA | Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942-20ML | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap | Fisher / Corning | 353135 | |
| IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 124262 | For in vivo bioluminescence imaging |
| Living image software | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 128113 | For in vivo bioluminescence analysis |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 118918 | For Isoflurane anesthesia |
| BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) | BD / Fisher | BD328418 | For retro-orbital luciferin injection |
| Syringe 1ml | BD / Fisher | 14-823-434 | For intraperitoneal injections |
| 26 G x 1/2 in. needle | BD / Fisher | 305111 | For intraperitoneal injections |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | 43368-9M | CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ | METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL | 17014411 | |
| Mayer's Hematoxylin | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 517-28-2 | |
| Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% | Fisher | 67-63-0 | |
| Masson Trichrome Stain Kit | IMEB Inc | K7228 | For masson trichrome stain to visualize collagen |
| Superfrost plus glass slides | Fisher | 1255015 | |
| 6 well plate | Corning | C3516 | |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | |
| OCT Embedding compound | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62550-12 | For embedding tissue for frozen sections |
| Leica CM3050 S Research Cryostat | Leica | CM3050 S | To section tissue for staining analysis |
| Keyence All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | – | |
| Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice | Charles River | NIH-553 | |
| NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice | Jackson Laboratories | 5557 | |
| B6129SF1/J mice | Jackson Laboratories | 101043 | |
| NIH-H2030 cells | ATCC | CRL-5914 | |
| 368T1 | generously provided by Monte Winslow (Standford University) | – | |
| PC9 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – | |
| H2030 BrM3 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
- Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
- Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
- Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
- Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
- Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
- Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
- Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
- Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
- Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
- Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
- Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
- Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?. Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
- Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
- Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
- Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
- Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
- Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
- Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , (2015).
- Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
- Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
- Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
- Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, S3-S10 (2004).
- Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
- Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
- Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
- Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
- Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
- Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
- Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
- Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
- Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168 (2013).
