Acondicionamiento previo de las vías respiratorias de los ratones con bleomicina aumenta la eficacia del pulmón Orthotopic Engraftment de la célula de cáncer
Summary
Se describe un método para mejorar considerablemente orthotopic engraftment de células de cáncer de pulmón en los pulmones murinos por acondicionamiento previo de las vías respiratorias con lesiones. Este enfoque también puede aplicarse para estudiar las interacciones estromales dentro del microambiente de la pulmonar, diseminación metastásica, comorbilidades de cáncer de pulmón, y generar más eficientemente paciente derivados de xenoinjertos.
Abstract
Cáncer de pulmón es una enfermedad refractaria mortal tratamiento biológico heterogéneo. Para entender y tratar con eficacia el espectro clínico completo de tumores malignos torácicos, se necesitan modelos animales adicionales que pueden recapitular fases y subtipos de cáncer de pulmón humanas diversas. Aloinjerto o xenoinjerto modelos son versátiles y permiten la cuantificación de capacidad tumorígena en vivo, usando las células malignas de origen murino o humano. Sin embargo, se han realizado métodos previamente descritos del engraftment de la célula de pulmón cáncer en sitios no-fisiológicos, tales como el flanco de los ratones, debido a la ineficiencia del trasplante orthotopic de células en los pulmones. En este estudio, se describe un método para mejorar el acondicionamiento previo de las vías respiratorias de los ratones con la bleomicina de agente induce fibrosis orthotopic engraftment de la célula de cáncer de pulmón. Como un experimento de prueba de concepto, se aplicó este enfoque para engraft las células del tumor del subtipo de adenocarcinoma de pulmón, obtenida de fuentes humanas, o de ratón en varias cepas de ratones. Demostramos que hiriendo a las vías respiratorias con bleomicina antes de la inyección de células de tumor aumenta el engraftment de células tumorales de 0-17% 71-100%. Este método había mejorado significativamente, incidencia de tumor de pulmón y posterior consecuencia utilizando cepas de ratón y diferentes modelos. Además, las células de cáncer de pulmón engrafted difusión desde los pulmones a órganos distantes pertinentes. Por lo tanto, proporcionamos un protocolo que puede utilizarse para establecer y mantener nuevos modelos ortotópico de cáncer de pulmón con limitación de la cantidad de células o muestra biológica y evaluar cuantitativamente la capacidad tumorigénica de las células de cáncer de pulmón en configuración fisiológico correspondiente .
Introduction
Cáncer de pulmón es la principal causa del cáncer relacionadas con las muertes en todo el mundo1. Pacientes con cáncer de pulmón eventualmente sucumban de metástasis a órganos distantes, en particular para el sistema nervioso central, hígado, glándulas suprarrenales y huesos2,3,4. Tumores malignos torácicos han sido tradicionalmente clasificadas como cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP) o de células no pequeñas lung cancer (NSCLC)5. NSCLC es el más frecuentemente diagnosticado malignidad y puede subdividirse en diferentes subtipos histológicos, como el adenocarcinoma de pulmón (LUAD) y pulmón carcinoma de células escamosas (LUSC)6. Análisis genómico del cáncer de pulmón primario humano resecado ha revelado que los tumores dentro de un determinado histotype también pueden expresar diversas perturbaciones moleculares, contribuyendo a su evolución clínica divergente y confusión paciente pronóstico aún más. La notable heterogeneidad del cáncer de pulmón representa un desafío significativo al diseño racional, pruebas preclínicas y aplicación de estrategias terapéuticas eficaces. Por lo tanto, hay que ampliar el repertorio de modelos de cáncer de pulmón experimental manejable para estudiar los orígenes celulares diversos subtipos moleculares y etapas de esta enfermedad.
Diversos enfoques usando los modelos animales han sido empleados para el estudio de pulmón cáncer en vivo, cada uno con sus ventajas y desventajas dependiendo de las preguntas biológicas de interés. Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) pueden dirigirse a alteraciones genéticas específicas en un tipo de célula progenitora dado, resultante en tumores que progresan en un anfitrión inmunocompetente7. Aunque extremadamente potente y clínicamente relevantes, la morbosidad de tumor latencia, variabilidad o pulmón asociada GEMMs puede ser prohibitiva para algunas mediciones cuantitativas y la detección de metástasis de etapa tardía en órganos distantes8. Un enfoque complementario es el uso de modelos de aloinjerto, por el que las células cancerosas de pulmón, ya sea directamente de un tumor de ratón obtenidos o derivados primero como las líneas celulares establecidas en la cultura, son nuevamente introducidas en anfitriones syngeneic. Análogamente, xenoinjertos de cáncer de pulmón se establecen de líneas celulares humanas o muestras tumorales derivados pacientes. Xenoinjertos de línea celular humana o xenoinjertos paciente derivadas (PDXs) se mantienen generalmente en ratones inmunodeprimidos y por lo tanto excluye de vigilancia inmune completa9. A pesar de este inconveniente, que proporcionan una vía para propagar limitando cantidades de humanos hay y estudio fundamental en vivo propiedades de las células de cáncer en humanos, que codifican para aberraciones genómicas más complejas que los tumores GEMM.
Una propiedad útil de aloinjertos y xenoinjertos es que son susceptibles a la tradicional limitación celular dilución ensayos, empleados para cuantificar la frecuencia del tumor iniciar células (TICs) dentro de una población de células malignas10. En estos experimentos, un número definido de las células se inyecta por vía subcutánea en el flanco de los animales y la frecuencia de los TICs puede estimarse en base a la tasa de toma del tumor. Tumores subcutáneos sin embargo pueden ser más hipóxico11 y no pueden modelo claves limitaciones fisiológicas del microambiente del tumor de pulmón. Intratraqueal entrega de madre epitelial o células progenitoras en los pulmones de los ratones es un método para estudiar la regeneración pulmonar y las vías respiratorias la célula de vástago biología12. Sin embargo, la tasa de engraftment de esta técnica puede ser relativamente baja, a menos que los pulmones son sometidos primero a formas fisiológicas de lesiones, tales como infección viral13,14. Apoyo de las células stromal inflamatorias o la interrupción de la membrana basal de pulmón puede mejorar la retención de las células trasplantadas en nichos de células relevantes en la15de las vías aéreas distales. Agentes de inducción de fibrosis puede también previamente la condición los pulmones para mejorar el engraftment de células pluripotentes inducidas16 y17de las células madre mesenquimales. Si otras formas de lesión de las vías respiratorias pueden afectar la tasa de engraftment, capacidad de iniciación tumoral y consecuencia de las células de cáncer de pulmón todavía debe evaluarse sistemáticamente.
En este estudio, se describe un método para aumentar la eficiencia de orthotopic engraftment de la célula de cáncer de pulmón, por acondicionamiento previo de los pulmones de los ratones con lesión. LUAD se presenta en las vías aéreas distales con un subconjunto significativo de estos cánceres en el desarrollo de un tejido conectador fibrótico18 que a menudo se correlaciona con mal pronóstico19. Bleomicina, un peptide nonribosomal natural del híbrido-polyketide, ha sido ampliamente utilizada para inducir fibrosis pulmonar en ratones20. Instilación de las vías respiratorias de la bleomicina primero promueve el desgaste epitelial de los alvéolos y el reclutamiento de células inflamatorias, incluyendo macrófagos, neutrófilos y monocitos21. Esto es seguido por remodelación tisular en las vías aéreas distales, reorganización de la membrana del sótano22,23 y deposición de matriz extracelular (ECM)24. Los efectos de una inyección de bleomicina solo son transitorios, con fibrosis resolver después de 30 días en la mayoría de los estudios de25. Utilizando modelos de aloinjertos y xenoinjertos, probamos si acondicionamiento previo de las vías respiratorias de los ratones con bleomicina puede aumentar significativamente el índice de toma de LUAD células en los pulmones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sorprendentes paralelismos clínicos han documentado entre cáncer de pulmón y otras enfermedades crónicas del pulmón36. En particular, los pacientes con fibrosis pulmonar idiopática (IPF) tienen una predilección mayor para desarrollar cáncer de pulmón, y esta asociación es independiente de fumar historia37,38. IPF se caracteriza por la destrucción progresiva de la arquitectura pulmonar y deterioro de la función respiratorio a tr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por becas del Instituto Nacional del cáncer (R01CA166376 y R01CA191489 a D.X. Nguyen) y el Departamento de defensa (W81XWH-16-1-0227 a D.X. Nguyen).
Materials
| Bleomycin | Sigma | B5507-15UN | CAUTION Health hazard GHS08 |
| Exel Catheter 24G | Fisher | 1484121 | Remove needle. For intratracheal injection |
| Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) | Butler Schein | 56344 | To anesthetize mice |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 | To anesthetize mice |
| Ketoprofen, 5,000 mg | Cayman Chemical | 10006661 | Analgesic |
| Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment | BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC | 8897 | To prevent eye dryness while under anesthesia |
| D-Luciferin powder | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 122799 | For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light |
| Rodent Intubation stand | Braintree Scientific | RIS-100 | Recommended stand for intratracheal injection |
| MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 | DOLAN-JENNER INDUSTRIES | MI-150 / EEG2823M | To illuminate and visualize trachea |
| Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat | Roboz | RS-5111 | For intratracheal injection |
| Syringe Luer-Lok Sterile 5ml | BD / Fisher | 309646 | |
| Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver | Conair | – | To shave mice |
| Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades | Roboz | RS-5840SC | |
| 15 mL conical tube | BD / Fisher | 352097 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA SCIENTIFIC INC | 1615-5500 | |
| Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI | Fisher | 701350 | |
| Filter pipette tips (200 μL) | USA SCIENTIFIC INC | 1120-8710 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| DMEM high glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum USDA | Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942-20ML | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap | Fisher / Corning | 353135 | |
| IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 124262 | For in vivo bioluminescence imaging |
| Living image software | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 128113 | For in vivo bioluminescence analysis |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 118918 | For Isoflurane anesthesia |
| BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) | BD / Fisher | BD328418 | For retro-orbital luciferin injection |
| Syringe 1ml | BD / Fisher | 14-823-434 | For intraperitoneal injections |
| 26 G x 1/2 in. needle | BD / Fisher | 305111 | For intraperitoneal injections |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | 43368-9M | CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ | METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL | 17014411 | |
| Mayer's Hematoxylin | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 517-28-2 | |
| Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% | Fisher | 67-63-0 | |
| Masson Trichrome Stain Kit | IMEB Inc | K7228 | For masson trichrome stain to visualize collagen |
| Superfrost plus glass slides | Fisher | 1255015 | |
| 6 well plate | Corning | C3516 | |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | |
| OCT Embedding compound | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62550-12 | For embedding tissue for frozen sections |
| Leica CM3050 S Research Cryostat | Leica | CM3050 S | To section tissue for staining analysis |
| Keyence All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | – | |
| Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice | Charles River | NIH-553 | |
| NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice | Jackson Laboratories | 5557 | |
| B6129SF1/J mice | Jackson Laboratories | 101043 | |
| NIH-H2030 cells | ATCC | CRL-5914 | |
| 368T1 | generously provided by Monte Winslow (Standford University) | – | |
| PC9 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – | |
| H2030 BrM3 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – |
Referências
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