Die Atemwege von Mäusen mit Bleomycin Vorklimatisierung erhöht die Effizienz der Orthotopen Lung Cancer Cell Engraftment
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur orthotopen Engraftment der Lungenkrebszellen in murinen Lungen deutlich zu verbessern, indem Vorklimatisierung die Atemwege mit Verletzungen. Dieser Ansatz kann auch angewendet werden, um die Stromale Interaktionen innerhalb der Lunge Mikroumgebung, metastasierendem Verbreitung, Lunge Krebs Komorbiditäten zu untersuchen und um effizienter Patient erzeugen Xenotransplantate abgeleitet.
Abstract
Lungenkrebs ist eine tödliche Behandlung refraktärer Krankheit, die biologisch heterogen ist. Um zu verstehen und effektiv die volle klinische Spektrum der thorakalen Tumoren zu behandeln, werden zusätzliche Tiermodellen, die vielfältigen menschlichen Lunge-Krebs-Subtypen und Stufen rekapitulieren können benötigt. Allograft oder Xenograft-Modelle sind vielfältig und erlauben die Quantifizierung der tumorigenic Kapazität in Vivo, mit malignen Zellen murinen oder menschlichen Ursprungs. Jedoch wurden zuvor beschriebene Methoden der Lunge Krebs Zelle Engraftment unphysiologischen Websites, z. B. die Flanke von Mäusen, aufgrund der Ineffizienz des orthotopen Transplantation von Zellen in der Lunge durchgeführt. In dieser Studie beschreiben wir eine Methode zur orthotopen Lunge Krebs Zelle Engraftment verbessern, indem die Atemwege von Mäusen mit Fibrose induzieren Agent Bleomycin Vorklimatisierung. Als ein Proof-of-Concept-Experiment haben wir diesen Ansatz um Tumorzellen von der Lunge Adenokarzinom Untertyp, gewonnen aus menschlichen Quellen oder Maus in verschiedene Stämme von Mäusen weiterhin angewandt. Wir zeigen, dass verletzte die Atemwege mit Bleomycin vor der Tumor Zelle Injektion das Engraftment von Tumorzellen von 0-17 erhöht % und 71-100 %. Diese Methode verbessert deutlich, Lungen-Tumor-Inzidenz und anschließende Auswuchs mit verschiedenen Modellen und Mausstämme. Darüber hinaus verbreiten eingepflanzt Lungenkrebszellen aus der Lunge in relevanten entfernten Organen. So bieten wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, zur Schaffung und Aufrechterhaltung orthotopen Modellneuheiten an Lungenkrebs zu erkranken mit der Begrenzung der Mengen von Zellen oder ibbl und quantitativ bewerten die tumorigenic Kapazität der Lungenkrebszellen in physiologisch relevanten Einstellungen .
Introduction
Lungenkrebs ist die führende Ursache von Krebs im Zusammenhang mit Todesfällen weltweit1. Patienten mit Lungenkrebs erliegen schließlich von Metastasen in entfernten Organen, vor allem auf das zentrale Nervensystem, Leber, Nebennieren und Knochen2,3,4. Thorakale Tumoren wurden traditionell als kleinzelligem Lungenkrebs (SCLC) oder nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) Krebs5eingestuft. NSCLC ist die am häufigsten malignen Erkrankungen diagnostiziert und können unterteilt werden in verschiedene histologische Subtypen, einschließlich Lungenkrebs Adenokarzinom (LUAD) und Lunge Plattenepithel-Karzinom (LUSC)6. Genomische Analyse des resezierten menschlichen primären Lungenkrebs hat ergeben, dass Tumoren innerhalb einer gegebenen Histotype auch unterschiedliche Molekulare Störungen, weiter einen Beitrag zu ihrer divergente klinische Progression und verwirrende Patienten Prognose zum Ausdruck bringen können. Die bemerkenswerte Heterogenität der Fälle von Lungenkrebs stellt eine große Herausforderung dar, der rationales Design, prä-klinischen Erprobung und Umsetzung von wirksamen Therapiestrategien. Infolgedessen gibt es eine Notwendigkeit, das Repertoire der gefügig experimentelle Lunge Krebs Modelle zur Untersuchung der verschiedenen zellulären Ursprung, molekularen Subtypen und Stadien der Erkrankung zu erweitern.
Verschiedene Ansätze mit Tiermodellen sind eingesetzt worden, um Lungenkrebs Krebs in Vivo, jede mit ihren eigenen vor- und Nachteile je nach den biologischen Frage(n) von Interesse zu studieren. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) können bestimmte genetische Veränderungen in einem bestimmten Vorläuferzellen Zelltyp, was zu Tumoren, dass Fortschritte innerhalb einer immunkompetenten Wirt7ausrichten. Während extrem leistungsstark und klinisch relevante, kann die Latenz, Variabilität und/oder Lunge Tumor Morbidität verbunden mit GEMMs bestimmte quantitativen Messungen und die Aufdeckung von späten Stadium Metastasen in entfernten Organen8unerschwinglich sein. Ein ergänzenden Ansatz ist die Verwendung von Allograft-Modelle, wobei Lungenkrebszellen, entweder direkt von einem Maus-Tumor oder zunächst als etablierte Zelllinien in der Kultur abgeleitet in Phänomen Gastgeber wieder eingeführt werden. Analog, sind Lungenkrebs Krebs Xenotransplantate aus humanen Zelllinien oder Patienten abgeleiteten tumorproben gegründet. Menschliche Zelle Zeile Xenotransplantate oder Patienten abgeleiteten Xenotransplantate (PDXs) bestehen in der Regel bei immungeschwächten Mäusen und daher komplett immun-Überwachung9entgegen. Trotz dieses Nachteils bieten sie eine Allee zu propagieren, Begrenzung der Mengen an menschliche bioproben und Studium grundlegende in Vivo Eigenschaften von menschlichen Krebszellen, die komplexere genomische Aberrationen als GEMM Tumoren zu codieren.
Eine nützliche Eigenschaft von Allografts und Xenografts ist, dass sie zu traditionellen begrenzende Zelle Verdünnung Assays eingesetzt, um die Häufigkeit der Tumor Zellen (TICs) innerhalb einer malignen Zelle Bevölkerung10Einleitung zu quantifizieren. In diesen Experimenten eine definierte Anzahl von Zellen werden in die Flanke der Tiere subkutan injiziert und die Häufigkeit der TICs basierend auf Tumor nehmen Rate geschätzt werden kann. Subkutane Tumoren können jedoch mehr hypoxischen11 und können nicht physiologischen Einschränkungen der Lunge Tumor Mikroumgebung modellieren. Intratrachealen Lieferung von epithelialen Stammzellen und Vorläuferzellen in der Lunge von Mäusen ist eine Methode, pulmonale Regeneration und Atemwege Stammzell-Biologie12zu studieren. Die Engraftment Rate von dieser Technik kann relativ gering, jedoch, wenn die Lunge physiologischen Formen der Verletzung, wie virale Infektion13,14zunächst ausgesetzt sind. Unterstützung von Stromazellen Entzündungszellen und/oder die Unterbrechung der Basalmembran der Lunge kann Beibehaltung der transplantierten Zellen in relevanten Stammzell-Nischen in den distalen Atemwege15verbessern. Fibrose induzieren Agenten kann auch die Lungen Engraftment induzierten pluripotenten Zellen16 und mesenchymalen Stammzellen17verbessern Pre-Zustand. Ob ähnliche Formen der Atemwege Verletzungen die Engraftment Rate beeinflussen können, ist Tumor auslösende Kapazität und Auswuchs der Lungenkrebszellen noch nicht systematisch untersucht werden.
In dieser Studie beschreiben wir eine Methode zur Steigerung der Effizienz des orthotopen Lunge Krebs Zelle Engraftment durch Vorklimatisierung der Lunge von Mäusen mit Verletzungen. LUAD entsteht in den distalen Atemwegen eine bedeutende Teilmenge dieser Krebsarten entwickeln eine fibrotische Stroma18 , die oft mit schlechter Prognose19korreliert. Bleomycin, eine natürliche Nonribosomal Hybrid Peptid-Polyketid, wurde ausgiebig genutzt, Lungenfibrose in Mäusen20induzieren. Atemwege Instillation von Bleomycin fördert zuerst epithelialen Fluktuation in den Alveolen und Rekrutierung von Entzündungszellen, einschließlich Makrophagen, Neutrophilen und Monozyten21. Dies wird gefolgt von Gewebe Umbau in der distalen Atemwegen, Basalmembran Reorganisation22,23 und extrazelluläre Matrix (ECM) Ablagerung24. Die Auswirkungen einer einzigen Bleomycin Einspritzung sind vergänglich, mit Fibrose nach 30 Tagen in den meisten Studien25zu lösen. Mit Allograft und Xenograft Modellen, haben wir getestet, wenn die Atemwege von Mäusen mit Bleomycin Vorklimatisierung Take-Rate von LUAD Zellen in der Lunge erheblich steigern könnte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Markante klinische parallelen wurden zwischen Lungenkrebs und andere chronische Erkrankungen der Lunge36dokumentiert. Insbesondere Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose (IPF) haben eine erhöhte Vorliebe für Lungenkrebs zu erkranken, und der Verein ist unabhängig vom Rauchen Geschichte37,38. IPF zeichnet sich durch die fortschreitende Zerstörung der Lunge Architektur und eingeschränkter Atemfunktion durch Ablagerung von ECM<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde finanziert durch Zuschüsse aus dem National Cancer Institute (R01CA166376 und R01CA191489 zu D.X. Nguyen) und das Department of Defense (W81XWH-16-1-0227, D.X. Nguyen).
Materials
| Bleomycin | Sigma | B5507-15UN | CAUTION Health hazard GHS08 |
| Exel Catheter 24G | Fisher | 1484121 | Remove needle. For intratracheal injection |
| Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) | Butler Schein | 56344 | To anesthetize mice |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 | To anesthetize mice |
| Ketoprofen, 5,000 mg | Cayman Chemical | 10006661 | Analgesic |
| Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment | BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC | 8897 | To prevent eye dryness while under anesthesia |
| D-Luciferin powder | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 122799 | For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light |
| Rodent Intubation stand | Braintree Scientific | RIS-100 | Recommended stand for intratracheal injection |
| MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 | DOLAN-JENNER INDUSTRIES | MI-150 / EEG2823M | To illuminate and visualize trachea |
| Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat | Roboz | RS-5111 | For intratracheal injection |
| Syringe Luer-Lok Sterile 5ml | BD / Fisher | 309646 | |
| Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver | Conair | – | To shave mice |
| Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades | Roboz | RS-5840SC | |
| 15 mL conical tube | BD / Fisher | 352097 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA SCIENTIFIC INC | 1615-5500 | |
| Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI | Fisher | 701350 | |
| Filter pipette tips (200 μL) | USA SCIENTIFIC INC | 1120-8710 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| DMEM high glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum USDA | Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942-20ML | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap | Fisher / Corning | 353135 | |
| IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 124262 | For in vivo bioluminescence imaging |
| Living image software | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 128113 | For in vivo bioluminescence analysis |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 118918 | For Isoflurane anesthesia |
| BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) | BD / Fisher | BD328418 | For retro-orbital luciferin injection |
| Syringe 1ml | BD / Fisher | 14-823-434 | For intraperitoneal injections |
| 26 G x 1/2 in. needle | BD / Fisher | 305111 | For intraperitoneal injections |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | 43368-9M | CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ | METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL | 17014411 | |
| Mayer's Hematoxylin | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 517-28-2 | |
| Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% | Fisher | 67-63-0 | |
| Masson Trichrome Stain Kit | IMEB Inc | K7228 | For masson trichrome stain to visualize collagen |
| Superfrost plus glass slides | Fisher | 1255015 | |
| 6 well plate | Corning | C3516 | |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | |
| OCT Embedding compound | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62550-12 | For embedding tissue for frozen sections |
| Leica CM3050 S Research Cryostat | Leica | CM3050 S | To section tissue for staining analysis |
| Keyence All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | – | |
| Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice | Charles River | NIH-553 | |
| NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice | Jackson Laboratories | 5557 | |
| B6129SF1/J mice | Jackson Laboratories | 101043 | |
| NIH-H2030 cells | ATCC | CRL-5914 | |
| 368T1 | generously provided by Monte Winslow (Standford University) | – | |
| PC9 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – | |
| H2030 BrM3 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – |
Referências
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