Summary
نفذت هذه الدراسة تسلسل الجينوم الكامل لتحليل الطفرات في الجينات منح المقاومة للعقاقير المضادة للفطور في المبيضات صناعي. كانت متتابعة يعزل صناعي جيم- مقاومة اتشينوكاندينس، الآزولات و 5-فلوسيتوسيني، لتوضيح المنهجية. التشكيلات الجانبية للقابلية يعزل يرتبط بوجود أو عدم وجود أنماط محددة من الطفرة في الجينات.
Abstract
ويمكن اكتساب صناعي المبيضات سرعة الطفرات التي تؤدي إلى مقاومة المخدرات، لا سيما الآزولات واتشينوكاندينس. تحديد الطفرات الوراثية أمر أساسي، كما كشف المقاومة في المختبر يمكن غالباً ما يرتبط بفشل السريرية. قمنا بفحص جدوى استخدام تسلسل الجينوم كله (WGS) لتحليل المجين على نطاق المنظومة لمقاومة العقاقير المضادة للفطور في جيم-صناعي. والهدف كان المساعدون توريكوجنيزي والحواجز في الأفرقة العاملة لتنفيذ وقياس فعاليته. وتلخص هذه الورقة في نقاط التفتيش الرئيسية في مجال مراقبة الجودة والمكونات الأساسية للأفرقة العاملة لمنهجية التحقيق البصمات الجينية المرتبطة بتخفيض التعرض للعوامل المضادة للفطور. وتقدر أيضا دقة تحليل البيانات ودورة حول الوقت للاختبار.
قابلية المظهرية من 12 السريرية، وواحد من سلالة ATCC من صناعي جيم- مصممة عن طريق اختبار قابلية المضادة للفطور. عزل هذه شملت ثلاثة أزواج من المرضى الثلاثة، التي وضعت ارتفاع تركيزات العقاقير المثبطة الدنيا. في اثنين من أزواج، عزل الثاني لكل زوج وضع مقاومة اتشينوكاندينس. عزل ثاني زوج الثالثة وضعت المقاومة إلى 5-فلوسيتوسيني. المتبقية المؤلفة من عرضه ومقاومة الازول يعزل. وتأكدت النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة (بطانات) في الجينات المرتبطة بالمقاومة اتشينوكاندين والازول فلوسيتوسيني 5 في يعزل مقاومة من خلال الأفرقة العاملة لاستخدام تسلسل الجيل القادم. بطانات عدم مرادفة في مقاومة الفطريات وتم تحديد الجينات مثل FKS1، FKS2، CgPDR1، CgCDR1 ، و FCY2 . وعموما، في متوسط 98% القراءات WGS من يعزل صناعي جيم- المعينة للجينوم مرجع مع تغطية حوالي 75-fold عمق القراءة. المدة الزمنية والتكلفة كانت مماثلة سانغر التسلسل.
وفي الختام، WGS صناعي جيم- كان ممكناً في الكشف عن الطفرات الجينية سريرياً هامة تشارك في المقاومة لفئات مختلفة من العقاقير المضادة للفطور دون الحاجة إلى عدة ردود فعل تسلسل بكر/الحمض النووي. وهذا يمثل خطوة إيجابية نحو إنشاء قدرة الأفرقة العاملة في المختبرات السريرية للكشف المتزامن استبدالات تخول المقاومة المضادة للفطور.
Introduction
هو صناعي المبيضات ممرض مصادفة على نحو متزايد بأهمية الأنواع الذي يسلك المقاومة الآزولات وكذلك في الآونة الأخيرة،2،1،اتشينوكاندينس3. على عكس مثنوية المبيضة، فرداني جينوم صناعي جيم- قد تسمح لها بالحصول على الطفرات وتطوير المقاومة للعقاقير المتعددة بسهولة أكبر. وأفادت المقاومة المشارك فئات المخدرات على حد سواء كان أيضا4. ومن ثم، التقييم المبكر لقابلية المضادة للفطور والكشف عن المقاومة للعقاقير في جيم-صناعي أمر حاسم للعلاج الصحيح، وهادفة، وكذلك كما هو الحال في سياق الإشراف مضاد للحد من العوامل المحركة لمقاومة مضادات الميكروبات1 , 5 , 6-إنشاء سير عمل فعالة لسرعة الكشف عن وجود توكيدي الطفرات المرتبطة بالمؤشرات الحيوية المقاومة في مقاومة يعزل سيتم أيضا إلى المساعدة على تحسين وصف المقررات والنتائج السريرية.
وعادة ما يتم تقييم القابلية المضادة للفطور بقياس تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) الذي يعرف بأنه أدنى تركيز المخدرات التي ينتج عنها انخفاض كبير في نمو الكائنات الدقيقة المقارنة مع نمو خال من المخدرات عنصر التحكم. السريرية ومعهد المعايير المختبرية (كلسي) واللجنة الأوروبية على الميكروبات قابلية الاختبار (يوكاست) قد توحيد قابلية طرق الاختبار من أجل البت في هيئة التصنيع العسكري أكثر دقة واتساقا7، 8. بيد الفائدة من الأدوية المضادة للفطور هيئة التصنيع العسكري لا تزال محدودة لا سيما بالنسبة اتشينوكاندينس، خاصة فيما يتعلق بإجراء مقارنات المختبرات فيها منهجيات مختلفة والشروط المستخدمة9. وهناك أيضا ترابط غير مؤكد من البلدان المتوسطة الدخل مع الاستجابة للعلاج اتشينوكاندين وعدم القدرة على التمييز بين WT (أو عرضه) المعزولة من تلك التي تأوي FKS الطفرات (سلالات مقاومة اتشينوكاندين)10،11. وعلى الرغم من توافر تقارير إتمام المشروعات وحيدة الجين توكيدي وسانجر تسلسل علامات المقاومة المضادة للفطور، تحقيق النتائج غالباً ما يتأخر الواجب لعدم الكشف عن واحد من علامات المقاومة متعددة5،12. ومن ثم، المتزامنة الكشف عن الطفرات المقاومة منح في مواقع مختلفة في الجينوم، مكنت من التحليل القائم على تسلسل الجينوم كله، يوفر مزايا هامة أكثر من النهج الحالي.
الجينوم كله التسلسل (WGS) نفذت بنجاح لتتبع انتقال المرض خلال تفشي فضلا عن نهج لمقاومة المخدرات وتقييم المخاطر على نطاق الجينوم الاختبار في البكتيريا والفيروسات13. التطورات الحديثة في تكنولوجيا تسلسل الحمض النووي جعلت تسلسل الجينوم كله (WGS) من مسببات الأمراض في عملي سريرياً بدوره حولها-وقت مجدية تقنيا واقتصادياً على حد سواء. تسلسل الحمض النووي يوفر مزايا هامة على أساليب أخرى لتحديد العوامل الممرضة وتوصيف المستخدمة في علم الأحياء المجهرية المختبرات14،،من1516. أولاً، أنه يوفر حلاً عالمياً مع ارتفاع الإنتاجية والسرعة والجودة. التسلسل يمكن تطبيقها على أي من الكائنات الحية الدقيقة ويسمح وفورات الحجم في المختبرات المحلية أو الإقليمية. وثانيا، أنها تنتج البيانات في تنسيق 'المستقبل واقية' قابلة للمقارنة على المستويين الوطني والدولي. وأخيراً، زادت الفائدة المحتملة للأفرقة العاملة في مجال الطب بالنمو السريع لقواعد البيانات العامة التي تحتوي على مرجع جينومات، التي يمكن ربطها بقواعد بيانات معادلة التي تحتوي على بيانات تعريف إضافية السريرية والوبائية17 ،18.
وقد أثبتت الدراسات الأخيرة لفائدة من الأفرقة العاملة لتحديد علامات المقاومة المضادة للفطور من يعزل السريرية من المبيضات spp. 10 , 19 , 20-وهذا في الغالب بسبب توافر التعاقب benchtop الفائق والمعلوماتية أنشئت خطوط الأنابيب وانخفاض التكلفة لتسلسل21،22. الاستفادة من الأفرقة العاملة للفطريات عبر سانغر التسلسل WGS يسمح تسلسل الجينوم متعددة على تشغيل واحد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد الطفرات الرواية في أهداف المخدرات WGS الجينومات المبيضات ، تتبع التطور الجيني، وظهور أنواع التسلسل ذات الصلة سريرياً20،،من2223. الأهم من ذلك، في حالات مقاومة عصيات الجوهرية، WGS يمكن أن تساعد في الكشف المبكر عن الطفرات المقاومة تمنح قبل العلاج التحديد22،24.
هنا، قمنا بدراسة الجدوى للأفرقة العاملة لتمكين الكشف عن الطفرات المرتبطة بالعقاقير المقاومة لفئات مختلفة من العوامل المضادة للفطور. نقدم منهجية لتنفيذ WGS من منظوري مختبر علم الفطريات التشخيصية والمستخدم النهائي. وأدرجنا في هذا التحليل عزل ثلاثة أزواج مثقف من ثلاث حالات سريرية منفصلة في التي في المختبر وضعت المقاومة اتشينوكاندينس و 5-فلوسيتوسيني مع مرور الوقت بعد العلاج المضادة للفطور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وكان لا الموافقة الأخلاقية المطلوبة لهذه الدراسة.
1-إعداد ثقافة فرعية والعدوى صناعي المبيضات
- حدد فريق يعزل C.glabrata من الدراسة التي ينبغي أن تشمل أيضا واحد على الأقل صناعي جيم- أمريكية نوع الثقافة جمع (ATCC) مع نمط حساسية معروفة.
- ثقافة فرعية عزل لمس مستعمرة واحدة باستخدام حلقة بلاستيك القابل للتصرف عقيمة و streaking على سكر العنب أجار سابوراود (حزب العمل الديمقراطي) لوحة8.
- احتضان لوحة حزب العمل الديمقراطي ح 24-48 في 35 درجة مئوية لثقافة نقية من عزل مع نمو جيد.
2-تحديد قابلية مضاد فطري
- استخدام حلقة بلاستيك القابل للتصرف عقيمة لاختيار المستعمرات 4-5 من قطر 1 ملم تقريبا من سوبكولتوريد طازجة صناعي جيم- عزل على لوح حزب العمل الديمقراطي. ريسوسبيند في 3 مل ماء المقطر المعقم. مزيج جيد من قبل بيبيتينج لطيف للحصول على تعليق موحدة.
- ضبط كثافة الخلية إلى 0.5 ماكفارلاند الذي يساوي 1 × 106 إلى 5 × 106 خلايا/مل تستخدم الكثافة 8.
- قم بإجراء اختبار قابلية استخدام التحليل التجاري (انظر الجدول للمواد والمواد الكاشفة) على جميع صناعي جيم- يعزل اتباع إرشادات الشركة المصنعة. تفسير قابلية عزل استناداً إلى المؤشرات الناتجة من الأدوية المضادة للفطور ووفقا للمبادئ التوجيهية كلسي وإعداد التقرير (الجدول 1)8.
3. الجينوم استخراج الحمض النووي للتسلسل
- ريسوسبيند لوبفول مستعمرات من صفيحة التعطيل الذاتي المزروعة حديثا في 300 ميليلتر من 50 مم يدتا في أنبوب 1.5 مل.
- إضافة 40 ميليلتر من زيمولياسي (10 مغ/مل) إلى تعليق، ولطف بيبيت 5 مرات حتى يتم تعليق موحدة.
- احتضان العينة في 37 درجة مئوية ح 1-2 لهضم جدار الخلية. تبريد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- الطرد المركزي من التعليق في 14,000 ز × 2 دقيقة ثم قم بإزالة المادة طافية بعناية.
- استخراج الحمض النووي الحمض النووي استخراج مجموعة المبادئ التوجيهية (انظر الجدول للمواد) التالية.
- ريسوسبيند استخراج الحمض النووي بيليه في 50 ميليلتر من 10 ملم تريس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.5-8.5) بدلاً من المخزن المؤقت شطف المنصوص عليها في هذه المجموعة.
- فحص نقاء الحمض النووي بقياس الكثافة البصرية (O.D) في 260/280 nm25.
4-المجينية الحمض النووي الكمي
- إعداد 1 × تريس يدتا (TE) المخزن المؤقت المقدمة في أدوات المقايسة استناداً إلى المبادئ التوجيهية للشركة المصنعة للمقايسة الأسفار (انظر الجدول للمواد).
- تمييع عينة الحمض النووي بإضافة 2 ميليلتر ميليلتر 98 1 × TE الإنزيم المخزن المؤقت (الحجم النهائي من 100 ميليلتر، إضعاف عامل 01:50) في لوحة جيدا 96 المتاح. يمكن إجراء هذه الخطوة إضعاف أما يدوياً باستخدام ماصة الأقنية أو بسائل الآلي التعامل مع محطة العمل.
- إعداد مجموعة المعايير بتمييع لامدا الحمض النووي (100 ميكروغرام/مل) في أدوات التحليل الفلورية (الجدول 2) وتتضمن قياس جنبا إلى جنب مع عينات.
- إضافة 100 ميليلتر من صبغة الفلورسنت إلى 100 ميليلتر المخفف عينات الحمض النووي، ومعايير لرد الفعل. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
- قياس الأسفار من جميع العينات استناداً إلى إرشادات الشركة المصنعة.
- ارسم المنحنى القياسي استخدام قراءات الأسفار وحساب تركيز الأصلي من عينات الحمض النووي.
- تحديد حجم الحمض النووي والعازلة تريس 10 مم (درجة الحموضة 8) المراد إضافتها إلى ضبط تركيز الحمض النووي إلى 0.2 نانوغرام/ميليلتر.
- إجراء تخفيف الحمض النووي باستخدام سائل الآلي التعامل مع محطة العمل. ويمكن تحقيق هذه الخطوة أيضا بدليل بيبيتينج.
5. إعداد مكتبة الحمض الخلوي الصبغي
ملاحظة: إعداد مكتبة وتسلسل أجرى عقب الشركة المصنعة للبروتوكولات والمبادئ التوجيهية التي قدمتها شركة (الشكل 1أ) (انظر الجدول للمواد).
- تاجمينتاتيون وبكر التضخيم
- قم بتسمية لوحة الجدار رقيقة واقية 96-بئر جديدة.
- إضافة 5 ميليلتر من إدخال كمية الحمض النووي في 0.2 نانوغرام/ميليلتر (1 نانوغرام في المجموع) لكل نموذج جيد اللوحة.
- إضافة 10 ميليلتر من المخزن المؤقت تاجمينتيشن و 5 ميليلتر من المخزن المؤقت لتضخيم الحمض النووي التي تحتوي على كل ولطف "الماصة؛" لخلط. ختم اللوحة مع ختم لوحة لاصقة.
- ضع اللوحة في cycler حرارية وقم بتشغيل برنامج الاسترداد التالية: 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وعقد في 10 درجة مئوية. عند وصول العينة إلى 10 درجة مئوية، والشروع فورا في تحييد.
- إضافة 5 ميليلتر لتحييد المخزن المؤقت للوحة لتحييد رد فعل أمبليكون، ولطف "الماصة؛" ميكس. ختم اللوحة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 15 ميليلتر من الفهرسة PCR mastermix للعينات.
- استخدام مربع من الفهرس التمهيدي أنابيب المتاحة لإعداد لتنسيق لوحة 96-جيدا حيث يحصل كل عينة على مزيج فريد من مؤشرات تستند إلى قالب الفهرس (الجدول 3).
- ترتيب الفهرس التمهيدي أنابيب في مؤشر لوحة الحامل (الشكل 1ب) استخدام النظام المنصوص عليه في القالب على الجدول 3 وتسجيل موقف الأرقام القياسية في القالب.
- ضع لوحة تاجمينتيشن مع إضافة PCR mastermix على الرف لوحة الفهرس مع أنابيب الفهرس في الترتيب.
- وضع الفهرس التمهيدي 1 أنابيب في الترتيب العمودي، والفهرس التمهيدي 2 أنابيب في الترتيب الأفقي على حامل الرقم القياسي. استخدام ماصة متعددة القنوات، بعناية إضافة 5 ميليلتر من الإشعال فهرس لكل عينة.
- استبدال قبعات القديمة من أنابيب الفهرس مع قبعات جديدة لتجنب التلوث المتبادل بين الأرقام القياسية.
- ختم لوحة استخدام السدادات لوحة واضحة 96-جيدا وأداء بكر الثاني كما يلي: 95 درجة مئوية لمدة 30 ق، دورات 12 من 95 درجة مئوية لمدة 10 s، 55 درجة مئوية لمدة 30 s، 72 درجة مئوية لمدة 30 s و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تنظيف بكر
- نقل المنتج بكر بكر-تنظيف، من لوحة تاجمينتاتيون إلى لوحة الآبار العميقة (انظر الجدول للمواد).
- (انظر الجدول للمواد) استناداً إلى إرشادات الشركة المصنعة دوامة الحل التجاري المغناطيسي الخرز وإضافة 30 ميليلتر من حبات لكل منتج PCR في لوحة الآبار العميقة.
- هز اللوحة على شاكر ميكروسكوبية 1800 لفة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة واحتضان في درجة حرارة الغرفة دون المصافحة لمدة 5 دقائق.
- وضع اللوحة على الوقوف مغناطيسية لمدة 2 دقيقة حتى أزال المادة طافية.
- تجاهل المادة طافية بعناية مع لوحة لا تزال على موقف المغناطيسية.
- إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% طازجة مع اللوحة على الوقوف المغناطيسية.
- احتضان لوحة على موقف المغناطيسية لمدة 30 ثانية وإزالة بعناية وتجاهل المادة طافية بدون الإخلال بالخرز.
- كرر الخطوة يغسل مرة أخرى والسماح الخرز أيردري لإزالة 15 دقيقة الإيثانول الزائدة أن وجدت.
- إزالة اللوحة من موقف المغناطيسية وإضافة 52.5 ميليلتر من المخزن المؤقت لاستثارة الخرز.
- هز اللوحة على شاكر ميكروسكوبية 1800 لفة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة دون أن تهتز.
- وضع اللوحة على الوقوف المغناطيسية، وتسمح المادة طافية لمسح.
- استخدام ماصة متعددة القنوات، بعناية نقل 50 ميليلتر من المادة طافية من لوحة التنظيف لصفيحة واقية جديدة.
- مكتبة التطبيع
- ذوبان الجليد مكتبة تطبيع الكواشف طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
- نقل 20 ميليلتر من المادة طافية من لوحة تنظيف لوح الآبار العميقة جديدة.
- إضافة ميليلتر 45 تعليق حبة المغناطيسية وختم اللوحة مع السدادة لوحة.
- هز اللوحة على شاكر ميكروسكوبية 1800 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. هذه المرة حضانة أمر بالغ الأهمية، ويجب عدم تجاوزها.
- وضع اللوحة على الوقوف مغناطيسية لمدة 2 دقيقة وتأكيد أن المادة طافية مسح (الشكل 1ب).
- إزالة وتجاهل المادة طافية في حاوية نفايات الخطرة مناسبة مع لوحة لا تزال على موقف المغناطيسية.
- إزالة اللوحة من موقف المغناطيسية وتغسل الخرز مع 45 العازلة أغسل ميليلتر.
- هز اللوحة مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في شاكر ميكروسكوبية 1800 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- وضع لوحة على موقف المغناطيسي 2 دقيقة وتجاهل المادة طافية عندما يتحول واضحة.
- إزالة اللوحة من موقف المغناطيسي وتكرار الغسيل مع المخزن المؤقت للغسيل مرة أخرى.
- إزالة اللوحة من موقف المغناطيسية وإضافة 30 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم N 0.1.
- هز اللوحة مع هيدروكسيد الصوديوم N 0.1 على شاكر ميكروسكوبية 1800 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ووضع اللوحة على الوقوف المغناطيسية لمدة 2 دقيقة أو حتى السائل واضح.
- إضافة 30 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت لكل بئر من لوحة مكتبة تم تسويتها النهائية الجدار رقيقة واقية 96-بئر جديدة.
- نقل 30 ميليلتر من المادة طافية من لوحة التطبيع إلى لوحة مكتبة تم تسويتها النهائية لجعل وحدة التخزين النهائي 60 ميليلتر. المكتبات جاهزة الآن تكون متسلسلة.
- تحديد تركيز مكتبة الحمض النووي قبكر
- ذوبان الجليد mastermix والإشعال والمعايير المنصوص عليها في مجموعة qPCR طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
- تجمع بين PCR mastermix الكاشف والتمهيدي المنصوص عليها في عدة قبكر اتباع إرشادات الشركة المصنعة ومختبرين يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية.
- لتحديد تركيز مكتبة الحمض النووي، جعل إضعاف 1/8000 من مكتبات الحمض النووي باستخدام 10 ملم تريس المخزن المؤقت (pH 8) عن طريق إجراء تخفيف 1: 100 (مكتبة ميليلتر الحمض النووي 1.5 إلى 148.5 المخزن المؤقت تريس ميليلتر) متبوعاً بإضعاف 1:80 (2 ميليلتر من 1: 100 إلى 158 المخزن المؤقت تريس ميليلتر).
- اهتزاز لوحة تمييع 700 لفة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة على الأقل وثم الطرد المركزي في 14000 × ز لمدة 1 دقيقة.
- إعداد 20 ميليلتر لتفاعل PCR النهائي بخلط 4 ميليلتر المخفف الحمض النووي مكتبة أو معايير الحمض النووي وميليلتر 16 من mastermix.
- إجراء PCR بعد إعدادات الشركة المصنعة في ثيرموسيكلير: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، دورات 35 من 95 درجة مئوية عن 30 ثانية و 60 درجة مئوية 45 ثانية، والنهائي 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية لتحليل منحنى تذوب.
- الحصول على قيم Ct المكتبات عينة الحمض النووي والمعايير من ثيرموسيكلير قبكر.
- إنشاء منحنى قياسي من قيمة الأشعة المقطعية للمعايير (الشكل 2). تعريف نطاق مراقبة الجودة العليا والسفلي من ± 3 دورات من الوسط. على سبيل المثال، إذا كان متوسط قيمة قيراط 13 دورات ثم نطاق مراقبة الجودة بين 16 و 10 دورات.
- تحديد مكتبة الفردية ومتوسط التركيزات (ALC) من المنحنى المعياري والقيم المقطعية.
- تحديد حجم مجموع المكتبات المجمعة (PAL) لاستخدامها استناداً إلى الحساب الواردة أدناه للتسلسل النهائي وبالنظر إلى أن تركيز مكتبة الهدف بين 1.4-01:08 م.
ملاحظة: متوسط تركيز المكتبة التي تم الحصول عليها من قبكر = جيش تحرير الكونغو؛ مجموع المكتبات المجمعة (PAL) = جيش تحرير الكونغو/2؛ التشويه والتحريف بال (DAL) = بال * 0.666
اعتماداً على حجم DAL مختلطة مع المخزن المؤقت، هو تركيز مكتبة تضاف إلى الخلية التدفق. على سبيل المثال، إذا تم إضافة ميليلتر 65 من مكتبة إلى 835 ميليلتر من المخزن المؤقت، ثم من هذا التخفيف (ديل 1) 195 هو إضافة إلى إجمالي حجم ميليلتر 1300: (65/900) * دنبال = Dil1
Dil1 * (195/1300) = "تركيز النهائي" (يجب أن يكون بين 1.4-01:08 م)
6-مكتبة تجمع وتتابع الشروع في التسلسل Benchtop
- ذوبان الجليد خرطوشة كاشف طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة. تأخذ بها خلية تدفق جديد من مجموعتها من مخزن 4 درجات مئوية وتقديمهم إلى الأقل درجة حرارة الغرفة 30 دقيقة قبل التسلسل. إخراج كارتريدج المخزن المؤقت وتسلسل بريتشيل المخزن المؤقت قبل الاستخدام (انظر الجدول للمواد).
- إعداد مكتبة تحكم بخلط 5 ميليلتر من مكتبة (1 نانومتر) و 5 ميليلتر من 0.2 N هيدروكسيد الصوديوم. الدوامة بإيجاز واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة تجريدها مكتبة عنصر التحكم في خيوط واحد.
- إضافة 5 ميليلتر من 200 ملم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 7 ودوامه. إضافة ميليلتر 235 التسلسل بريتشيليد المخزن المؤقت وتخلط برفق. الحجم الإجمالي هو 250 ميليلتر مع مكتبة التحكم التركيز النهائي في 20 بعد الظهر.
- تجمع مكتبات الحمض النووي عن طريق نقل 5 ميليلتر لكل نموذج في مكتبة تكون متسلسلة من لوحة مكتبة تم تسويتها النهائية في أنبوب واحد منخفض--ربط 1.5 مل.
- إضافة 30 ميليلتر من مكتبة المجمعة و 30 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم N 0.2 تجريدها المكتبات في أنبوب منخفض ربط آخر.
- الدوامة المنخفضة-الربط أنبوب واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة تجريدها المكتبات في خيوط واحد.
- إضافة 30 ميليلتر من 200 ملم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 7 إلى أنبوب مع مكتبات التشويه والتحريف لتحييد رد فعل.
- إضافة ميليلتر 65 تعليق مكتبات التشويه والتحريف معادلتها و 835 ميليلتر من المخزن المؤقت لتسلسل مبردة مسبقاً ودوامه مزيج جيد.
- في أنبوب ربط منخفض نهائي ضم ما يلي: 195 ميكروليتر من المكتبات التشويه والتحريف معادلتها، ميليلتر 1.30 مكتبة التحكم و 1103.70 ميليلتر من المخزن المؤقت للتسلسل. المزيج بشكل صحيح.
- تحميل ميكس مكتبة النهائي (1300 ميليلتر) إلى بقعة معينة على كاشف خرطوشة.
- إنشاء تسلسل تشغيل عن طريق إدخال تفاصيل المشروع وعينه في التسلسل تسمية الموقع المبادئ التوجيهية التالية.
- بدء تسلسل المبادئ التوجيهية التالية. تحميل خلية تدفق، خرطوشة الكاشف مع المكتبات والمخزن المؤقت في التسلسل benchtop.
- تسجيل أرقام دفعة لجميع مجموعات كاشف والخراطيش المستخدمة في التسلسل.
7-بيانات التحميل من الموقع التسلسل
- تحميل ملفات فاستق اتباع إرشادات الشركة المصنعة المقدمة على الموقع.
- لتشغيل التحقق من نوعية جيدة أن النسبة المئوية Q30 كثافة ≥ 75% والمجموعة ما بين 170-280 ك/مم2 مع الأمثل في ك 200-210/مم2 (الجدول 4).
8-تسلسل تحليل البيانات
- استيراد ملفات فاستق من عينات متسلسلة في حزمة برامج متكاملة لتحليل البيانات (انظر الجدول للمواد).
- إنشاء سير عمل تسلسل في البرنامج عن طريق إضافة ميزات من القائمة هي التشذيب، ورسم خرائط للمرجع (حدد مرجع الجينوم)، التقويم المحلي وتحليل متغير (الشكل 3أ) باستخدام الإعدادات المذكورة في الجدول 5.
- تشغيل سير العمل عن طريق تحديد عينة واحدة أو مجموعة من الملفات فاستق عينة وحفظ ملفات الإخراج في مجلدات نموذج معين.
- إنشاء تقرير لتسلسل عمق التغطية والمناطق المعينة وقائمة بالمتغيرات الهيكلية في الجينوم (الشكل 3ب).
- استخدم قائمة بالمتغيرات الهيكلية للبحث عن النوكليوتيدات واحدة غير مترادفين مجمع الأشكال المتعددة (بطانات) في الجينات منح المقاومة وضراوة.
- إعداد تقرير بسرد SNP الموقع والجينات، وعدد من عزلات مقاومة أو عرضه (الجدول 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ثلاثة عشر درست صناعي جيم- تضم صناعي C. ATCC 90030 و 12 يعزل من سريرية علم الفطريات المختبر (يعزل CMRL1 إلى CMRL12)، مستشفى Westmead، سيدني (الجدول 1). وشملت هذه ثلاثة أزواج من يعزل كمرل-1/كمرل-2، كمرل-3/كمرل-4 وكمرل-5/كمرل-6 التي تم الحصول عليها قبل وبعد العلاج بالأدوية المضادة للفطور لا تربطها أية صلة وبائية بين هذه 24 (الجدول 1).
وحددت البلدان المتوسطة الدخل استخدام كلسي التفسيرية نقطة توقف لوكلاء المضادة للفطور التسعة هي: الامفوتريسين (AMB)، أنيدولافونجين (العاني)، ميكافونجين (MIF)، كاسبوفونجين (CAS)، 5-فلوسيتوسيني (5-إف سي)، بوساكونازولي (POS)، فوريكونازولي (فكتوريا)، (الايتراكونازول ساحة التجارب الموحدة) والفلوكونازول (جبهة تحرير الكونغو). بارابسيلوسيس المبيضات واستخدمت ATCC 22019 و كراسي المبيضات ATCC 6258 كسلالات مراقبة الجودة. بين الزوج عزل، كمرل-1 وكمرل-2، تم عزل ثاني كمرل-2 مقاومة ل caspofungin (8 هيئة التصنيع العسكري مقابل 0.12 ملغ/لتر، الجدول 1). وكان كمرل-2 أيضا زيادات متناسبة مع مماثلة في البلدان المتوسطة الدخل من أنيدولافونجين وميكافونجين (≥ 0.5 ملغ/لتر) أسفر عن المقاومة في المختبر لكل ثلاثة اتشينوكاندينس24. وبالمثل، قد وضعت عزل كمرل-4 اتشينوكاندين المقاومة من تلك لعزل كمرل-3 (الجدول 1). بين الزوج الثالث، قد عزل كمرل-6 هيئة التصنيع العسكري 5-فلوسيتوسيني (> 64 مقابل 0.06 مغ/لتر)24. وكان كلا أزواج عزل هذه عرضه/البرية من نوع (WT) العوامل المضادة للفطور الأخرى اختبار. عزل كمرل-6 و 12 كمرل وجد أن مقاومة أو غير وزن لجميع الآزولات. كمرل-7 كانت تقاوم الفلوكونازول وغير WT إلى فوريكونازولي (الجدول 1). جيم-صناعي ATCC 90030 ويعزل كمرل-8 إلى 11 كمرل تم عرضه عرضه/WT إلى جميع العوامل المضادة للفطور24.
وأجرى WGS يعزل 13 استخدام المنظم benchtop. في متوسط، تشغيل تسلسل إخراج منتصف، أسفرت عن حوالي 27-40 جيجابايت البيانات بمعدل خطأ بين 0.5-1.4%. وكان متوسط النسبة المئوية Q30 الحصول على عادة حوالي 80-85%. خلية تدفق الكتلة الكثافة (ك/مم2) يتراوح بين 200-250 (الجدول 4). البيانات الأولية تسلسل من هذه الدراسة قد أودعت في نكبي تسلسل قراءة الأرشيف (SRA) تحت رقم المشروع PRJNA310057. 98% تسلسل يقرأ المعينة للجينوم مرجع جيم-صناعي (سلالة CBS138) من خلال التحليل في برنامج تحليل البيانات المتكاملة. قراءة المتوسط عمق التغطية كان x 75 مع متوسط قراءة طول 143-هناك هيكلية البديل الكشف المحددة أكثر من 50، 000 بطانات لعزل. خاصة، عند تحليل أزواج سلالة CMRL1/كمرل-2، ومجموع بطانات العثور على عزل كل من حول 79,000، كمرل-3/كمرل-4، كان العدد الإجمالي لبطانات حول 60,000 وكمرل-5/كمرل-6، أكثر من 56,000 بالمقارنة مع CBS13824. وكان الفرق SNP عند المقارنة بين يعزل في زوج من سلالة أقل من 25.
استناداً إلى موجز القابلية يعزل، تعرف بالمقاومة واختيرت المؤشرات الحيوية لتحليل24، خاصة، FKS1، FKS2 و FKS3 (المقاومة اتشينوكاندين)، FCY1 و FCY2 (5- المقاومة فلوسيتوسيني)، و ERG9، ERG11، CgCDR1، CgPDR1 و CgFLR1 (الازول المقاومة). تم فحص الجينات للطفرات المعروفة، وتواتر الحوادث SNP. فقط قراءة بطانات غير مترادفين في الجينات مع تغطية متعمقة من إيه تو زيرو أي، عالية الجودة بطانات (المقر الرئيسي-بطانات) درست على وجه التحديد.
جدير بالذكر أن حددت FKS الطفرات في الجينوم من كلا اتشينوكاندين المقاوم يعزل24. أزواج الأولين، يعزل مقاومة اتشينوكاندين، كمرل-2 كان يؤوي طفرة FKS2 واحد S629P، وكمرل-4، الطفرة FKS2 S663P (الجدول 6). زوج الثالثة، عثر SNP في FCY2 (Ala237Thr) في كل من كمرل-5 (5-فلوسيتوسيني عرضه) و (المقاومة) كمرل-6 (الجدول 6). ومع ذلك، كما عثر بطانات في FCY2 في أخرى يعزل (كمرل-1، 2-كمرل، كمرل-10) فينوتيبيكالي-وزن24. يعزل كمرل-6 وكمرل-12 كانت جديرة بالذكر لمقاومة لعموم-الازول/غير-حرف WT وبطانات في CgCDR1 (ترميز الازول افلوكس مضخات) و CgPDR1 (ترميز عامل النسخ تنظم المضخات efflux) (الجدول 6)26 ،27. وجود الطفرات في الجينات مضخة efflux آخر، وقع CgFLR1 في كلا يعزل الازول عرضه، ومقاومة الازول26،28. التحقيق لبطانات داخل ERG9 (الترميز السكوالين synthase) كشفت عن الطفرات ولكن هناك لا الطفرات التي تم تحديدها في ERG1124.
كما كشف تحليل WGS بطانات متعددة غير مترادفين في المبيضات الجينات التصاق جدار الخلية هي، EPA1، EPA6، PWP2 و PWP5. الطفرات EPA6 كانوا حاضرين في يعزل 9/12. كما حضر بطانات في PWP2 و PWP5 في يعزل كلها تقريبا، باستثناء يعزل كمرل-1 وكمرل-1124.
| عزل | السفير | ANI | قوة الاعتراض المتعددة الجنسيات | الأكاديمية الصينية للعلوم | 5-إف سي | نقاط البيع | فكتوريا | ساحة التجارب الموحدة | جبهة تحرير الكونغو | تفسير قابلية مضاد فطري | الجينات التي تمنح المقاومة التي حددتها الأفرقة العاملة | ||
| كمرل-1 | 0.5 | 0.03 | < 0.008 | 0.12 | < 0.06 | 0.5 | 0.12 | 0.25 | 8 | عرضه للجميع | - | ||
| كمرل-2 | 0.5 | 1 | 1 | 8 | < 0.06 | 0.25 | 0.06 | 0.12 | 4 | مقاومة لجميع اتشينوكاندينس فقط | FKS1 | ||
| كمرل-3 | 0.25 | 0.015 | 0.015 | 0.12 | < 0.06 | 1 | 0.25 | 0.5 | 8 | عرضه للجميع | - | ||
| كمرل-4 | 2 | 1 | 1 | > 8 | < 0.06 | 0.5 | 0.12 | 0.25 | 8 | مقاومة لجميع اتشينوكاندينس فقط | FKS2 | ||
| كمرل-5 | 1 | 0.12 | 0.015 | 0.12 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 16 | عرضه للجميع | - | ||
| كمرل-6 | 1 | 0.06 | 0.015 | 0.06 | > 64 | > 8 | 8 | > 16 | 256 | مقاومة 5-نادي والازولات | FCY2، CgPDR1، CgCDR1 | ||
| كمرل-7 | 0.25 | 0.06 | 0.015 | 0.25 | < 0.06 | 1 | 8 | 0.5 | 256 | مقاومة لجميع الآزولات فقط | CgPDR1، CgCDR1، CgFLR1 | ||
| كمرل-8 | 0.5 | 0.03 | 0.008 | 0.06 | < 0.06 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 4 | عرضه للجميع | - | ||
| كمرل-9 | 1 | 0.03 | 0.015 | 0.25 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 1 | 16 | عرضه للجميع | - | ||
| كمرل-10 | 1 | 0.03 | < 0.008 | 0.5 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 16 | عرضه للجميع | - | ||
| كمرل-11 | 0.5 | 0.03 | < 0.008 | 0.03 | < 0.06 | 0.5 | 0.25 | 0.5 | 8 | عرضه للجميع | - | ||
| كمرل-12 | 0.5 | 0.03 | 0.015 | 0.06 | < 0.06 | > 8 | 2 | 8 | 128 | مقاومة لجميع الآزولات فقط | CgPDR1، CgCDR1، CgFLR1 | ||
| ATCC 90030 | 1 | 0.03 | 0.015 | 0.06 | < 0.06 | 1 | 0.5 | 0.5 | 8 | عرضه للجميع | - | ||
| المختصرات: هيئة التصنيع العسكري، تركيز المثبطة الدنيا؛ السفير، الامفوتريسين ب؛ العاني، أنيدولافونجين؛ الأكاديمية الصينية للعلوم، كاسبوفونجين؛ جبهة تحرير الكونغو، الفلوكونازول؛ ساحة التجارب الموحدة، الايتراكونازول؛ القوة المتعددة الجنسيات، ميكافونجين؛ نقاط البيع، بوساكونازولي؛ فكتوريا، فوريكونازولي؛ 5-إف سي، 5-فلوسيتوسيني. | |||||||||||||
الجدول 1- في المختبر قابلية 13 المبيضات صناعي يعزل بما في ذلك كمرل-1/كمرل-2، وعزل كمرل-3/كمرل-4 وكمرل-5/كمرل-6 أزواج الحصول عليها قبل وبعد العلاج بالأدوية المضادة للفطور
| المعايير | حجم قياسي الحمض النووي (ميكروليتر) | المخزن المؤقت X TE 1 | كاشف (ميكروليتر) | إجمالي في لوحة 96-جيدا (ميكروليتر) | تركيز الحمض النووي النهائي (ng/mL) |
| الأمراض المنقولة جنسياً-بيكو 1 | 8 (الحمض النووي القياسية أنبوب 100 ميكروغرام/مل) | 1992 | 100 | 200 | 1000 |
| الأمراض المنقولة جنسياً-بيكو 2 | 10 (من الأمراض المنقولة جنسياً-بيكو 1) | 90 | 100 | 200 | 100 |
| الأمراض المنقولة جنسياً-بيكو 3 | 5 (من الأمراض المنقولة جنسياً-بيكو 1) | 95 | 100 | 200 | 50 |
| الأمراض المنقولة جنسياً-بيكو 4 | 2 (من الأمراض المنقولة جنسياً-بيكو 1) | 198 | 100 | 200 | 10 |
| الأمراض المنقولة جنسياً-بيكو 5 | 10 (Std-بيكو 4) | 90 | 100 | 200 | 1 |
| فارغة | - | 100 | 100 | 200 | فارغة |
الجدول 2- بروتوكول لإعداد معايير لتوليد المنحنى المعياري للقياس الكمي الحمض النووي
الشكل 1 . تسلسل سير العمل: (أ) مخطط تفصيلي للخطوات التحليلية الرئيسية لإعداد مكتبة وتسلسلها في التسلسل benchtop. (ب) مكونات هامة لإعداد مكتبة الحمض النووي مثل (اليسار إلى اليمين) مؤشر لوحة الحامل لترتيب الأرقام القياسية خلال الفهرسة ورف المغناطيسي مع لوحة 96-بئر عميقة لحبه المغناطيسي على أساس تنظيف مكتبات الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| فهرس المجموعة أ |
N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S502 | عينة 1 | عينة 2 | نموذج 3 | نموذج 4 | نموذج 5 | نموذج 6 | نموذج 7 | نموذج 8 | نموذج 9 | نموذج 10 | نموذج 11 | نموذج 12 |
| ب | S503 | نموذج 13 | نموذج 14 | نموذج 15 | نموذج 16 | نموذج 17 | نموذج 18 | عينة 19 | نموذج 20 | نموذج 21 | نموذج 22 | نموذج 23 | نموذج 24 |
| ج | S505 | نموذج 25 | نموذج 26 | نموذج 27 | نموذج 28 | نموذج 29 | نموذج 30 | نموذج 31 | نموذج 32 | نموذج 33 | نموذج 34 | عينة 35 | نموذج 36 |
| د | S506 | عينة 37 | نموذج 38 | نموذج 39 | نموذج 40 | نموذج 41 | نموذج 42 | عينة 43 | نموذج 44 | نموذج 45 | نموذج 46 | نموذج 47 | نموذج 48 |
| ه | S507 | عينة 49 | عينة 50 | نموذج 51 | نموذج 52 | نموذج 53 | نموذج 54 | نموذج 55 | نموذج 56 | نموذج 57 | نموذج 58 | نموذج 59 | نموذج 60 |
| و | S508 | نموذج 61 | عينة 62 | نموذج 63 | عينة 64 | عينة 65 | عينة 66 | عينة 67 | عينة 68 | عينة 69 | عينة 70 | نموذج 71 | عينة 72 |
| ز | S510 | عينة 73 | عينة 74 | عينة 75 | عينة 76 | عينة 77 | عينة 78 | نموذج 79 | نموذج 80 | عينة 81 | عينة 82 | عينة 83 | نموذج 84 |
| ح | S511 | نموذج 85 | عينة 86 | نموذج 87 | العينة 88 | عينة 89 | عينة 90 | 91 عينة | 92 عينة | 93 عينة | 94 عينة | 95 عينة | 96 عينة |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| فهرس مجموعة ب | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S502 | عينة 1 | عينة 2 | نموذج 3 | نموذج 4 | نموذج 5 | نموذج 6 | نموذج 7 | نموذج 8 | نموذج 9 | نموذج 10 | نموذج 11 | نموذج 12 |
| ب | S503 | نموذج 13 | نموذج 14 | نموذج 15 | نموذج 16 | نموذج 17 | نموذج 18 | عينة 19 | نموذج 20 | نموذج 21 | نموذج 22 | نموذج 23 | نموذج 24 |
| ج | S505 | نموذج 25 | نموذج 26 | نموذج 27 | نموذج 28 | نموذج 29 | نموذج 30 | نموذج 31 | نموذج 32 | نموذج 33 | نموذج 34 | عينة 35 | نموذج 36 |
| د | S506 | عينة 37 | نموذج 38 | نموذج 39 | نموذج 40 | نموذج 41 | نموذج 42 | عينة 43 | نموذج 44 | نموذج 45 | نموذج 46 | نموذج 47 | نموذج 48 |
| ه | S507 | عينة 49 | عينة 50 | نموذج 51 | نموذج 52 | نموذج 53 | نموذج 54 | نموذج 55 | نموذج 56 | نموذج 57 | نموذج 58 | نموذج 59 | نموذج 60 |
| و | S508 | نموذج 61 | عينة 62 | نموذج 63 | عينة 64 | عينة 65 | عينة 66 | عينة 67 | عينة 68 | عينة 69 | عينة 70 | نموذج 71 | عينة 72 |
| ز | S510 | عينة 73 | عينة 74 | عينة 75 | عينة 76 | عينة 77 | عينة 78 | نموذج 79 | نموذج 80 | عينة 81 | عينة 82 | عينة 83 | نموذج 84 |
| ح | S511 | نموذج 85 | عينة 86 | نموذج 87 | العينة 88 | عينة 89 | عينة 90 | 91 عينة | 92 عينة | 93 عينة | 94 عينة | 95 عينة | 96 عينة |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| فهرس مجموعة ج | N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S513 | عينة 1 | عينة 2 | نموذج 3 | نموذج 4 | نموذج 5 | نموذج 6 | نموذج 7 | نموذج 8 | نموذج 9 | نموذج 10 | نموذج 11 | نموذج 12 |
| ب | S515 | نموذج 13 | نموذج 14 | نموذج 15 | نموذج 16 | نموذج 17 | نموذج 18 | عينة 19 | نموذج 20 | نموذج 21 | نموذج 22 | نموذج 23 | نموذج 24 |
| ج | S516 | نموذج 25 | نموذج 26 | نموذج 27 | نموذج 28 | نموذج 29 | نموذج 30 | نموذج 31 | نموذج 32 | نموذج 33 | نموذج 34 | عينة 35 | نموذج 36 |
| د | S517 | عينة 37 | نموذج 38 | نموذج 39 | نموذج 40 | نموذج 41 | نموذج 42 | عينة 43 | نموذج 44 | نموذج 45 | نموذج 46 | نموذج 47 | نموذج 48 |
| ه | S518 | عينة 49 | عينة 50 | نموذج 51 | نموذج 52 | نموذج 53 | نموذج 54 | نموذج 55 | نموذج 56 | نموذج 57 | نموذج 58 | نموذج 59 | نموذج 60 |
| و | S520 | نموذج 61 | عينة 62 | نموذج 63 | عينة 64 | عينة 65 | عينة 66 | عينة 67 | عينة 68 | عينة 69 | عينة 70 | نموذج 71 | عينة 72 |
| ز | S521 | عينة 73 | عينة 74 | عينة 75 | عينة 76 | عينة 77 | عينة 78 | نموذج 79 | نموذج 80 | عينة 81 | عينة 82 | عينة 83 | نموذج 84 |
| ح | S522 | نموذج 85 | عينة 86 | نموذج 87 | العينة 88 | عينة 89 | عينة 90 | 91 عينة | 92 عينة | 93 عينة | 94 عينة | 95 عينة | 96 عينة |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| فهرس المجموعة د | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S513 | عينة 1 | عينة 2 | نموذج 3 | نموذج 4 | نموذج 5 | نموذج 6 | نموذج 7 | نموذج 8 | نموذج 9 | نموذج 10 | نموذج 11 | نموذج 12 |
| ب | S515 | نموذج 13 | نموذج 14 | نموذج 15 | نموذج 16 | نموذج 17 | نموذج 18 | عينة 19 | نموذج 20 | نموذج 21 | نموذج 22 | نموذج 23 | نموذج 24 |
| ج | S516 | نموذج 25 | نموذج 26 | نموذج 27 | نموذج 28 | نموذج 29 | نموذج 30 | نموذج 31 | نموذج 32 | نموذج 33 | نموذج 34 | عينة 35 | نموذج 36 |
| د | S517 | عينة 37 | نموذج 38 | نموذج 39 | نموذج 40 | نموذج 41 | نموذج 42 | عينة 43 | نموذج 44 | نموذج 45 | نموذج 46 | نموذج 47 | نموذج 48 |
| ه | S518 | عينة 49 | عينة 50 | نموذج 51 | نموذج 52 | نموذج 53 | نموذج 54 | نموذج 55 | نموذج 56 | نموذج 57 | نموذج 58 | نموذج 59 | نموذج 60 |
| و | S520 | نموذج 61 | عينة 62 | نموذج 63 | عينة 64 | عينة 65 | عينة 66 | عينة 67 | عينة 68 | عينة 69 | عينة 70 | نموذج 71 | عينة 72 |
| ز | S521 | عينة 73 | عينة 74 | عينة 75 | عينة 76 | عينة 77 | عينة 78 | نموذج 79 | نموذج 80 | عينة 81 | عينة 82 | عينة 83 | نموذج 84 |
| ح | S522 | نموذج 85 | عينة 86 | نموذج 87 | العينة 88 | عينة 89 | عينة 90 | 91 عينة | 92 عينة | 93 عينة | 94 عينة | 95 عينة | 96 عينة |
الجدول 3- قالب لترتيب فهرس مختلفة
الشكل 2 : رسم بياني قياسية التي تم إنشاؤها مع القيم المقطعية للمعايير- استخدام قيم التقاطع والمنحدر المنحنى المعياري لتحديد تركيز مكتبة المتوسط من قيمة الأشعة المقطعية لمكتبات العينة في التكرارات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المقاييس | القيم القياسية | القيم التي تم الحصول عليها (متوسط) |
| العائد | 32.5-50 جيجابايت لإخراج منتصف | 42 غيغابايت لإخراج منتصف |
| 100-130 غيغابايت عالية المخرجات | 120 جيجابايت لمخرجات عالية | |
| النسبة المئوية Q30 | ≥ 75% | 80% |
| كثافة الكتلة | 170-230 ك/مم2، الأمثل في 200 ك/م2 | ك 210/مم2. |
| مجموعات تمرير مرشحات | > 70% | 89.09% |
| كثافة بدوره | فوق 1000 لكل بلاطة في فلووسيل | فوق 1500 لكل بلاطة في فلووسيل |
| نسبة الخطأ | أدناه 1.5 | 1.4 |
الجدول 4- المقاييس لتسلسل قياسي تشغيل في التسلسل Benchtop
الشكل 3 : ترتيب برامج تحليل البيانات. (أ) إنشاء سير عمل المطلوب بما في ذلك تسلسل التشذيب، ورسم الخرائط المرجعية والجودة على أساس الكشف عن البديل. تشغيل سير العمل عن طريق تحديد نماذج الملفات فاستق (الفرد أو عينات متعددة دفعة واحدة). (ب) قائمة بالمتغيرات الهيكلية عرض موقف المرجعية والتغطية وتغيير النوكليوتيدات وتغير الأحماض الأمينية التي تم الحصول عليها لتحليل عينة متواليات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| 1-تقليم متواليات | إعداد المستخدم |
| تقليم القواعد | الإعدادات الافتراضية |
| تصفية على طول مع الحد الأقصى لعدد النوكليوتيدات في ما يلي: | 1000 |
| تصفية على طول مع عدد أدنى من النوكليوتيدات في ما يلي: | 50 |
| 2-تعيين ما يلي للإشارة إلى | |
| المرجع المحدد | CBS138 |
| إخفاء المرجعية مع إخفاء الوضع | إخفاء لا |
| تعيين خيارات | الإعدادات الافتراضية |
| 3-المحلي التقويم | |
| إعدادات المحاذاة | الإعدادات الافتراضية |
| 4-الجودة على أساس الكشف عن البديل | |
| دائرة نصف قطرها حي | 5 |
| عد الفجوة وعدم تطابق الحد الأدنى | 2 |
| نوعية الأحياء الدنيا | 15 |
| الحد الأدنى من الجودة المركزية | 20 |
| قراءة عوامل التصفية | الإعدادات الافتراضية |
| الحد الأدنى من التغطية | 4 |
| تردد متغير الحد الأدنى (%) | 75 |
| مرشحات البديل | الإعدادات الافتراضية |
| الحد الأقصى المتوقع الآليلات (بلويدي) | 2 |
| الشفرة الجينية | القياسية |
الجدول 5- معلمات سير العمل والإعدادات في البرنامج
| موقف النوكليوتيدات البديل الهيكلية | الجينات | Drug(s) | وجدت في عدد يعزل |
يعزل مقاومة | يعزل عرضه | |
| SNP_Cg_95352_S629P_fks1 | CgFKS1 | الأكاديمية الصينية للعلوم، العاني، قوة الاعتراض المتعددة الجنسيات | 1 | كمرل-2 | - | |
| SNP_Cg_375361_S633P_fk2 | CgFKS2 | الأكاديمية الصينية للعلوم، العاني، قوة الاعتراض المتعددة الجنسيات | 1 | كمرل-4 | - | |
| SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 | CgFCY2 | 5-إف سي | 2 | كمرل-6 | كمرل-5 | |
| SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 | CgFCY2 | 5-إف سي | 2 | 0 | كمرل-1, كمرل-2 | |
| SNP_Cg_720995_C128F_erg9 | CgERG9 | جبهة تحرير الكونغو، نقاط البيع، فكتوريا، ساحة | 3 | كمرل-6 | 5-كمرل، كمرل-10 | |
| SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 | CgPDR1 | جبهة تحرير الكونغو، نقاط البيع، فكتوريا، ساحة | 1 | كمرل-6 | - | |
| SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 | CgPDR1 | جبهة تحرير الكونغو، نقاط البيع، فكتوريا، ساحة | 1 | كمرل-7 | - | |
| SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 | CgPDR1 | جبهة تحرير الكونغو، نقاط البيع، فكتوريا، ساحة | 1 | 0 | كمرل-11 | |
| SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 | CgPDR1 | جبهة تحرير الكونغو، نقاط البيع، فكتوريا، ساحة | 1 | كمرل-12 | - | |
| SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 | CgCDR1 | جبهة تحرير الكونغو، نقاط البيع، فكتوريا، ساحة | 5 | 6-كمرل، كمرل-12 | كمرل-5، 10-كمرل، كمرل-11 | |
| SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 | CgCDR1 | جبهة تحرير الكونغو، نقاط البيع، فكتوريا، ساحة | 1 | كمرل-7 | - | |
| SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 | CgCDR1 | جبهة تحرير الكونغو، نقاط البيع، فكتوريا، ساحة | 1 | كمرل-7 | - | |
| SNP_Cg_589884_I116V_flr1 | CgFLR1 | جبهة تحرير الكونغو، نقاط البيع، فكتوريا، ساحة | 4 | كمرل-7 | كمرل-1، 2-كمرل، كمرل-9 | |
| SNP_Cg_589470_V254I_flr1 | CgFLR1 | جبهة تحرير الكونغو، نقاط البيع، فكتوريا، ساحة | 1 | كمرل-12 | - | |
الجدول 6- تقرير الموقف المتغير الهيكلي في الجينات المرتبطة بالمقاومة للأدوية المضادة للفطور وجدت في عدد يعزل من جيم-صناعي
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحدد هذه الدراسة الجدوى والحدود الزمنية التقريبية والدقيقة الموجهة بالأفرقة العاملة للكشف عن مقاومة العقاقير في جيم-صناعي. وكان الزمنية (تأت) اللازمة لإعداد مكتبة وتسلسل أربعة أيام، والإبلاغ عن نتائج تحليل 1-2 يوما. ويقارن هذا مع على الأقل مبلغ مماثل تأت لفحوصات الحساسية من لوحات الثقافة وسانغر التسلسل مع رقم أعلى بكثير من العينات. نحو يمكن تسلسل جينوم صناعي جيم- 30-90 استناداً إلى تسلسل القدرة تدفق الخلية، مع تغطية تسلسل 80-100%. حيث تم إجراء التسلسل في إعداد مختبر WGS داخلية، الاحتياجات من الموارد/التكاليف في هذه الدراسة كان يعادل التكاليف الحالية سانجر فحوصات تتابعها والقائم على التحقيق بتكلفة تقديرية من 80-100 أسترالي كل عينة. قابلية لعزل جميع تحددها مجموعة أدوات تحليل تجاري التي تم قراءتها بصريا باستخدام مرآة قراءة. وأشارت بنمو ثقافة التغيير في مؤشر النمو قياس الألوان من الأزرق إلى اللون الوردي. وتليت هيئة التصنيع العسكري الزرقاء الأولى جيدا بعد سلسلة من الوردي (النمو) الآبار أي تركيز أقل من عامل مضاد فطري أن يكبح النمو إلى حد كبير. للأفرقة العاملة، أعدت المجينية الحمض النووي المكتبات باستخدام أدوات إعداد مكتبة. تم قياس كمية المكتبات عزل قبل قبكر. تم تجميع المكتبات كمياً للتسلسل النهائي تشغيل المنجز في التسلسل benchtop.
في تحليلنا، وجود بطانات في منح المقاومة في عزل الجينات ارتباطاً جيدا مع مرتفعة في المختبر هيئة التصنيع العسكري ضد المخدرات. الطفراتS629P في FKS1 و S663P في FKS2 المحددة كانت ترتبط بوضوح بمقاومة اتشينوكاندينس. كل الطفرات معروفة جيدا لمنح المقاومة المظهرية29،30. كما كشفت المتزامنة على نطاق الجينوم تسلسل الطفرات في الجينات المرتبطة إلى 5-فلوسيتوسيني (الجين FCY2) والمقاومة الازول (CgPDR1و CgCDR1 و CgFLR1) التي ترتبط مع المقاومة من خلال تفعيل/ أوفيريكسبريسيون ك efflux مضخات26،،من2728. ومع ذلك، يحلل آثار الطفرات في الجينات المرتبطة باحتياجات31 المقاومة الازول و 5-فلوسيتوسيني لتأكيد إضافية الفنية لتقييم مستوى التعبير الجيني. من المثير للاهتمام، كما عثر على عدد كبير من البرامج في جدار الخلية أدهيسينس في جميع يعزل32،33. نسبيا في كثير من الأحيان حدوث الطفرات في الجينات التصاق EPA6، الذي يقوم بترميز تشكيل بيوفيلم،33. بالإضافة إلى ذلك، يعزل كمرل-3, كمرل-4 وأنه يفتقر إلى الطفرات في جينات مقاومة الازول لا بطانات موثقة في24، EPA1 و EPA634كمرل-8. ومع ذلك، عموما، لا رابطة محددة بين بطانات في البلدان المتوسطة الدخل أدهيسينس والمخدرات تعذر العثور على بسبب العدد المنخفض لاختبار يعزل شملت.
تنفيذ WGS في علم الفطريات السريرية يتطلب تنفيذ نظام إدارة الجودة قوية. جودة عالية المجينية الحمض النووي ومراقبة الجودة نقاط التفتيش التي ترافق كل خطوة في هذه التجربة أمر ضروري للأفرقة العاملة نتيجة طيبة. قدم نقاء صناعي C. عينات الحمض النووي لإعداد مكتبة يمكن التحقق من صحتها باستخدام أسلوب امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (امتصاص في 260/280 شمال البحر الأبيض المتوسط، و شمال البحر الأبيض المتوسط 260/23025. في تجربتنا، جيم-صناعي الحمض النووي 260/280 من المتوقع أن تكون ضمن النطاق الموصى بها من 1.8-2 ول 260/230 بين 2، 2-2. إذا مقتطفات الحمض النووي لا تفي بهذه المتطلبات النوعية، يمكن إجراء تنقية إضافية بترسيب الإيثانول. تاجمينتيشن خطوة أساسية لإضافة تسلسلات الكود الشريطي فريدة من نوعها تسمى الإشعال مؤشر ذلك التفريق بين عينة متعددة أثناء تسلسل (الإرسال المتعدد) وتمكينه. ومن ثم، في عملية الفهرسة، يجب اتخاذ الحذر لتجنب التلوث المتبادل بين أنابيب الفهرس وعينات من أجل الحفاظ على الطابع الفريد لهذه المؤشرات. التطبيع في تسلسل يضمن أن يتم القضاء على أي خلافات تنشأ في المكتبات عينة الحمض النووي التي قد يدخل التحيز في تسلسل البيانات. تطبيع الخطوة تستخدم عادة ما يسمح حبة على أساس تنظيف إزالة الزائدة مكتبة شظايا من الحمض النووي والتغيرات في حجم المكتبة التي قد تنشأ أثناء إعداد المكتبة. ولذلك أمر حاسم لكثافة الكتلة الأمثل الحضانة و 30 دقيقة. كثافة الكتلة الذي هو كثافة المجموعات الاستنساخ للمكتبات عينة المتولدة عن التضخيم الهائل خلال تسلسل التأثيرات البيانات النوعية مثل عشرات Q30 وبيانات إجمالي الناتج. بينما أونديركلوستيرينج قد تعطي بيانات عالية الجودة، سيؤدي أيضا إلى أدنى بيانات الإخراج بينما أوفيركلوستيرينج منخفض Q30 عشرات. مكتبات الحمض النووي ينبغي أن يكون خاليا من بقايا حبة المغناطيسي أثناء تنظيف بكر والتطبيع كالتي يمكن أن تتداخل مع تسلسل نوعية البيانات. ينبغي إجراء قبكر على المكتبات عينة قليلة على الأقل بما في ذلك سلالة مرجعية كعنصر تحكم إيجابية (سلالة ATCC من جيم-التركيز في هذه الحالة) من مجموعة معينة من الأرقام القياسية. يجب أن تكون القيم المقطعية المتوسط بين 15-18 دورات. أي نموذج داخل هذا النطاق يعتبر مقبولاً لتشغيل التسلسل. ومع ذلك، إذا كانت القيم المقطعية خارج هذا النطاق ينبغي تكرار qPCR. عينات يمكن أن تفشل أحياناً qPCR أما بسبب تدني نوعية المدخلات الحمض النووي أو خطأ أثناء إعداد المكتبة. بناء على حسابات من مراقبة إيجابية، ينبغي تركيز الحد الأدنى من المكتبات التي سوف تنتج بيانات تسلسل جيدة. باستخدام متوسط التركيزات من المكتبات التي تم الحصول عليها من قبكر، ويمكن حساب حجم مكتبة النهائي تضاف للتسلسل. وهذا ينبغي أن ينتج تركيز مكتبة النهائي الموصى به بين 1.4-01:08 م. للمكتبات جيم-صناعي ، وكان النطاق Ct المنشأة باستخدام عزل ATCC جيم-صناعي بين 16-18 دورات مع مكتبة متوسط تركيز يتراوح بين 300-500 م. وكان حجم المقابلة مكتبات الحمض النووي التشويه والتحريف المجمعة ضمن المجموعة من 60-65 ميليلتر لنطاق كثافة كتلة بين 200-250 ك/مم2.
وينبغي أن ديمولتيبليكسيد ملفات تسلسل البيانات قبل إجراء مزيد من التحليل. هذا يمكن أن يتحقق بالفرز في مكتباتها الخاصة استخدام هذه الرموز الشريطية بعد حدث التسلسل. يمكن تنفيذ خطوة اختيارية للتشذيب نوعية الملفات فاستق قبل تحليل البيانات. حللت ما يلي تسلسل من يعزل من الأفرقة العاملة لاستخدام سير عمل مخصص تم إنشاؤه في مجموعة من برامج قياسية. هذا يسمح للتشذيب من يقرأ منخفضة الجودة، وثم تعيين إلى مرجع الجينوم المبيضات . تم تحميلها من قاعدة بيانات الجينوم المبيضات (رودمان) الجينوم المرجع، CBS138، والمرتبطة بسير العمل قبل التحليل. وجود الحمض النووي ويكرر في الجينوم المبيضات (على سبيل المثال، لديها جينات أدهيسين تكرار الحمض النووي) قد يؤدي إلى تعقيد محاذاة تسلسلات قصيرة للقراءة واستدعاء SNP. ويمكن تحسين هذا بإعادة الاصطفاف محلية إضافية لتسلسل معين. وكان الإخراج من سير العمل قائمة متغيرات هيكلية التي قدمت الجينات المشروح مع مواقف الحزب الوطني اﻻسكتلندي والتغطية غير مترادفين ومرادفه. وكان يستخدم هذا لتحديد بطانات في الجينات للفائدة وإعداد تقرير التحليل النهائي يعزل (الجدول 6).
ينبغي الاعتراف ببعض القيود للدراسة والنهج. لدينا تقرير يستند إلى عدد صغير من يعزل ولا توجد ريسيستومي الفطرية القياسية قاعدة بيانات للفطريات الإكلينيكية. على الرغم من أن تسلسل "الحمض النووي سانجر" حاليا أكثر يسرا للمختبرات السريرية، محدودة القدرة على اكتشاف عدة طفرات الجينات التي تمنح المقاومة للعقاقير في المبيضات spp. في نفس الوقت (> 20 الطفرات FKS على اتشينوكاندين المقاومة وحدها). مع دمج خدمات علم الأمراض وتناقص تكاليف التسلسل، الطابع العملي لاستخدام وغس عبر سانغر التسلسل، من المحتمل أن يزداد. ومع ذلك، هو اعتبار هام الإعداد المختبرية الأولية وتكلفة تنفيذ الصك الأفرقة العاملة وكذلك تدريب المستخدم النهائي لموظفي المختبرات. وستشمل أساسا التكاليف طويلة الأجل، شراء مجموعات كاشف التسلسل، والملحقات. تأت أعلى من تكاليف إضافية ويتوقع أن إذا كان الصك WGS ليست داخلية. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي إلى تعقيد وجود تكرار تسلسل الحمض النووي في جينومات محاذاة تسلسلات قصيرة للقراءة واستدعاء SNP. توافر جينومات الإشارة عالية الجودة باستخدام التسلسل الطويل-قراءة التكنولوجيات سيساعد على الحفاظ على جودة تحديد SNP.
في المستقبل، من المتوقع WGS تحقيق تحسينات في العلاج السريري بالتتبع السريع وقت الإبلاغ في إعدادات التشخيص التي يمكن الوصول إليها بسهولة وتفسرها الأطباء20،22. هذا يمكن أن يتحقق مع التنمية المنسق وحديثة WGS مقاومة العقاقير المضادة للفطور قواعد الرواية والطفرات المؤكدة للاستدلال المقاومة المضادة للفطور. جينومات المزيد من الخمائر ذات الصلة سريرياً قابلية المخدرات المظهرية المعروفة تصبح متاحة للتحليل، آليات المقاومة للأدوية المضادة للفطور وعلامات الرواية من المحتمل أن يتم اكتشافها. هذه التطورات إلى حد كبير سيقلل من مخاطر فشل العلاج بسبب المقاومة للأدوية المتعددة وسمية العقاقير. وفي الختام، تمكن تسلسل الجيل القادم مع بروتوكولات إدارة الجودة المناسبة على نطاق الجينوم كشف الطفرات منح المقاومة في صناعي المبيضات التي يمكن زيادة اختبار المظهرية في مختبرات علم الفطريات. الأفكار المقدمة من تسلسل الجينوم السريعة ذات الصلة سريرياً spp المبيضات أساسا يمكن أن تغير فهمنا لآليات المقاومة لفئات مختلفة من العوامل المضادة للفطور وتحسين الإدارة للمرضى الذين يعانون من الغازية الأمراض الفطرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب المصالح المالية ولا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل المركز للأمراض المعدية وعلم الأحياء المجهرية، والصحة العامة. المؤلفين لم تتلق أي تمويل آخر لهذه الدراسة. يشكر المؤلفون Drs أليسيا ارنوت، باخمان ناثان ورانجيتا مينون لمشورة الخبراء والمساعدة مع التجربة تسلسل الجينوم كله.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , USA. Fourth Informational Supplement (M27-S4) (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R.
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J.
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al.
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
