Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

פרוטוקול בידול אסטרוציטומה 3D יעיל בשינוי 2D אופציונלי

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/56888
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics/Child Neurology, Amsterdam Neuroscience, VU University Medical Center, 2Department of Complex Trait Genetics, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

Summary

אנו מתארים מדיום פרוטוקול מוגדרים hPSCs, באמצעות בידול 3D פשוטה, צמצום גורמי גדילה, מסוגל לייצר תא אגרגטים במבנים neuroepithelial מוקדם וחיובי אסטרוציטומה הקשורים סמנים, כמו גם אפשרי נוסף שינוי 2D עבור המבדילים תאים כמו טפט ליצירת נוירונים פונקציונלי.

Abstract

להפחית את המורכבות ואת העלות של בידול פרוטוקולים חשוב לחוקרים. עניין זה מתאים עם חששות לגבי תופעות לא מכוונות אפשריות המתבנת החיצוניים גורמים עשוי להציג לתוך תאי גזע pluripotent אנושי (hPSC) מודלים של התפתחות המוח או פתופיזיולוגיה, כגון מיסוך פנוטיפ המחלה. כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים בידול אסטרוציטומה עבור hPSCs, נועד עם שיטת ההפעלה פשוטה, גורמים פחות המתבנת, פחות דרישות החומרים ממספר הפרוטוקולים הקודמים. לאחרונה פיתחנו לתרבות הליכים, המניבות לתרשים תלת-ממדי (3D) מוצרים בקנה אחד עם פרוטוקולים "תא צורב" מוח אחרים, כולל מורפולוגיות הרלוונטיים דוגמנות התפתחות המוח כגון אזור sub/חדרית -, ומעוינים מבנים דמויי-שפתיים. השני משתמש הליך חד שכבתי חסיד, 2גרפיקה דו-ממדית כדי התמיינות להשלים, אשר מוצג מסוגל לייצר נוירונים אסטרוציטומה פונקציונלי, כפי חיוביים עבור סמני אסטרוציטומה הקשורים מוצרים, התערוכה נוירון כמו סידן influxes. יחד, פרוטוקולים אלה מציעים מדענים מגוון של אפשרויות מתאים למטרות מחקריות שונות, כמו גם מודל בסיסי לבדיקת סוגים אחרים של differentiations עצבית יעילה.

Introduction

במבחנה פרוטוקולים עבור המבדילים hPSCs לכיוון שושלות אסטרוציטומה בתחילה פעלו על עקרון מחקה ויוו פיתוח אסטרוציטומה1,2,3,4. וככזה, נדרש רצף של גורמים הציג במועדים ספציפיים לנהוג המתבנת pro-אסטרוציטומה ועם בגרות. בין אלה היו ונ ט, עצם morphogenetic חלבונים (BMPs), ו פקטורי גדילה פיברובלסט (FGFs) עם תפקידים ידוע בתחום הפיתוח hindbrain אמצע היווצרות של מארגן isthmic5,6,7. כמובן, כל צעד נוסף, גורם פירושו עלייה מניפולציות עתירי עבודה, הוצאות גדול עבור החוקר, אז פיתוח מסוגל בהשגת תוצאות שוות יותר פשוט פרוטוקולים הוא עניין. בעיה מעשית זו משתלב יפה עם השאלה ההיפותטית, אם תאים דרושה כזה חזק, חיצוני שליטה שלהם פיתוח חוץ גופית בתוך.

עבור בידול אסטרוציטומה, פרוטוקול שפורסם בשנת 2015 התייחס בצורך של באמצעות מספר רב של גורמי גדילה באמצעות רק FGF2, FGF19 ואת גורם לתא-derived סטרומה 1 (SDF1) עבור תכנים למטרות8. מחקר זה גם נבדל פרוטוקולים אסטרוציטומה מוקדמת, באמצעות מערכת תרבות לתרשים תלת-ממדי. בנוסף לייצור תאים חיובית עבור סמני אסטרוציטומה, המוח "organoids" שנוצר על ידי הטכניקה שלהם הוצגו שהפגינו מורפולוגיה הרלוונטיים, זמין בתרבויות מסורתיות טפט 2D, כגון מבנים דמויי-שפתיים ומעוינים. למרות פחות מורכבות ויקרות ביחס גורמי גדילה, תכונות אחרות כגון היווצרות אחיד embryoid (EBs) וגופי תרבות ב 96-ובכן צלחות (96WPs), עשה את זה לפי התהליכים מורכבים במהלך שלבים התחלתיים. פרוטוקול תלת-ממד נוסף שפורסם באותה השנה, דיווח על בידול מוצלחת שושלות עצביים באמצעות טכניקות תרבות תא נפוצה וזולה9. למרות קבוצה זו חקר קליפתי ולא בידול אסטרוציטומה, יישום של התפיסה שלהם עבור בידול אסטרוציטומה יכול לא להיות מוזלים.

לאחרונה דיווחנו פרוטוקול בידול אסטרוציטומה תלת-ממד באמצעות מספר מצומצם של גורמים המתבנת (כלומר, FGF2, 4 ו- 8), כמו גם התקנה פשוטה על ידי שמירה על תאים ב- 6-ובכן צלחות (6WPs) בכל כדי למזער את דרישות בינוני10. כדי לסייע ייצור תאי גרגר, smoothened אגוניסט (סאג) שימש במהלך השלב הסופי ההבשלה. סאג היא אלטרנטיבה כימי פחות יקר סוניק הקיפוד (ששש), אשר היה בשימוש לפני כן אסטרוציטומה בפרוטוקולים, בשל תפקידה לקדם את הצמיחה של גרגר תא מבשרי (GCPs) אין ויוו1,2, 11,12,13. בידול מוצרי היו בקנה אחד עם אלה של פרוטוקולים תלת-ממדיים אחרים, כולל הנוכחות של סמנים אסטרוציטומה הקשורים הרלוונטיים מורפולוגית מבנים8,9. תוצאות כאלה לחזק את המסר קודמות זה מפורט חיקוי של ה- ויוו הסביבה לא יהיה צורך מורכבים 3D במבחנה בידול פרוטוקולים.

בנוסף לפרוטוקול תלת-ממד, דו ח זה מתאר פרוטוקול 2D, נועד עם אותה התארגנות מהירה, חומרים בסיסיים, ואת מספר מופחת של גורמי גדילה. הוא מסוגל לייצר תאים של תאי גזע עובריים (hESCs) או המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs), חיובית עבור סמני המשויך מוקדם עצבית, אסטרוציטומה, גרגר תא זהויות. בנוסף, הסידן הדמיה מצביעה על הנוכחות של נוירונים אנושיים פונקציונלי. היכולת לבחור בין פרוטוקולים, מוסיפה רמה של גמישות לחוקרים, עבור מי שמעוניין גם: (1) ביצירת תאים מסוים יקליד, התפתחות המוח האנושי (2) דוגמנות ומקושרת מבנים, (3) ניתוח באופן חד שכבתי מיטבי הגדרות (למשל, תיקון-קלאמפ הקלטות), או אינטראקציות תא-תא (4) בתרבויות מעורבות עצבית. הטבע שלהם נמוכים ופשוט עושה אותם נגישים לחוקרים חדש בתחום hPSC, או צריך הליכים hPSC בסיס שממנו ניתן לחקור יותר אפשרויות בידול.

Protocol

1. תכשירים

הערה: עבור כל השלבים ראה טבלה של חומרים עבור פריטים ספציפיים.

  1. הכנת 500 מ"ל שהוגדרו hPSC תרבות בינוני לתרבות hPSC
    הערה: השתמש בינונית עבור שלבי 2.1-2.6.
    1. הפשרת hPSC בינוני תוספת בין לילה (o/n) ב 4 º C. להסיר מ"ל של מדיום הבסיס hPSC של בקבוק בינוני ולאחר מכן להוסיף 10 מ של תוספת ו- 2.5 מ ל (מה שהופך 100 U/L) פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת) של הבקבוק.
    2. לאחסן ב 4 ° C ולהשתמש בתוך 2 שבועות.
      הערה: המדיום hPSC עשוי לשמש כדי להקפיא את התאים על-ידי הוספת 10 מיקרומטר רוק מעכב (RI) ו-10% דימתיל סולפוקסיד.
  2. להכנת 1 ליטר תחזוקה עצבי בינוני (NMM) לתרבות בידול
    הערה: השתמש בינונית עבור שלבי 3.1-4.4.
    1. מיקס גלוטמין מועשר DMEM/F12, בינוני בסיסיות עצביים (יחס 1:1) 1 ליטר בקבוק, אז תוספת עם תוספת N2 (1 x) (1 x) תוספת B27, 5 אינסולין µg/mL, 1.5 מ מגלוטמין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות מיקרומטר 100 (NEAA), 100 U/L אפשרות למצוא עט, ו- 10 מיקרומטר בטא-mercaptoethanol.
    2. חנות בינונית ב 4 ° C ולהשתמש בתוך 3 שבועות.
      הערה: לפני הוספת תוספי תזונה מעורבת בינונית הבזליים, להסיר את אמצעי האחסון המתאים כדי לכוונן עבור אמצעי האחסון הנדרש של רכיבים שנוספו בהתבסס על ריכוזי מניות.
  3. להתכונן 500 מ"ל של 0.5 מ מ EDTA הפתרון עובד passaging hPSCs
    הערה: השתמש בינונית עבור שלבים 2.4 ו- 2.5.
    1. ברדס זרימה, להעביר 49 מ"ל של פוספט Buffered מלוחים (PBS) בקבוק 500 מ"ל PBS סטרילי שפופרת 50 מ. להוסיף הצינור 50 מ ל 0.5 מ של EDTA 0.5M ו- 0.9 g NaCl. מערבבים בעדינות כדי להמיס.
    2. מסנן-לעקר פתרון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22 העברה של הבקבוק PBS סטרילי 500 מ"ל. לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
  4. להכין hPSC צלחות תרבות hPSC תרבות
    הערה: השתמש לוחות עבור שלבי 2.1-2.6.
    1. להפוך 50 x הפתרון עובד של ציפוי חסיד המתאים hPSC (PAAC): הפשרת בקבוקון של PAAC o/n ב 4 º C. לדלל PAAC ביחס 1:1 עם DMEM/F12 והעברה כמו 400 µL aliquots לתוך צינורות 1.5 mL. חנות 50 x הפתרון עובד PAAC ב-80 מעלות צלזיוס.
      הערה: (חשוב) PAAC עפור במהירות-RT, לכן זה הכרחי כי כל הרכיבים (DMEM, צינורות, וכו ') נשמרים על קרח (או ב 4 ° C).
    2. הפשרת שפופרת של 50 x הפתרון עובד PAAC ב 4 ° C, ואז לדלל 50 x ב- DMEM קר/F12. להוסיף µL 750/טוב של PAAC מדוללת 6WP. דגירה לוח עבור פחות שעה ב 37 º C.
      הערה: צלחות PAAC ניתן לאחסן במשך שבוע 1-4 ° C, על ידי ליפוף את הצלחת לאחר תקופת דגירה 1 h. צלחת חמה כדי 37 ° C לפני השימוש.
  5. להכין פלטות אנטי דבק (AA) לתרבות בידול
    הערה: השתמש לוחות עבור שלבי 3.1-4.1.
    1. להפוך את 5 מ"ג/מ"ל פוליפוני (2-hydroxyethyl methacrylate) פתרון (פולי-המה) ב 95% אתנול. לנער o/n ב 37 ° C עד מתקבל פתרון ברור. החנות RT.
      הערה: סינון דרך מסנן מיקרומטר 0.22 באפשרותך להסיר פולי undissolved-המה.
    2. הוסף פולי-המה לצלחת תרבות כך שיכסה כל הבאר. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים, לבדוק את הצלחת כדי להבטיח אידוי מוחלט של ציפוי נוזלי/המדים של בארות. צלחות AA עשוי להיות עטוף ומאוחסנים ב RT.
  6. הכנת לוחות פולי-L-Ornithine/Laminin (אש ף/להרביץ) לתרבות בידול
    הערה: השתמש לוחות עבור שלבי 4.2-4.4.
    1. המעיל פני השטח של וולס, באמצעות 20 אש ף µg/mL מומס PBS סטרילי. דגירה של צלחת o/n ב- 37 מעלות צלזיוס. האחות אש ף ולשטוף 3 פעמים עם PBS.
      הערה: (אופציונלי) Incubated צלחת עם אש ף עלולה להיות עטוף ומאוחסנים ב 4 ° C עד שהוא נדרש.
    2. מעיל פני שטחים מן הבארות מצופי אש ף, באמצעות 10 µg/mL לאם מומס PBS סטרילי. תקופת דגירה של פחות 2 h ב 37 ° C או o/n ב 4 º C. הסר לאם, שטיפת בארות x 2-3 עם PBS, ואז מיד להוסיף בינוני מתאים ו/או תאים.
      הערה: פתרון (אופציונלי) הוסר לאם יכול להיות מאוחסן ב 4 ° C ומשמשת מחדש עד 2 פעמים. (חשוב) אל תאפשר משטחים מצופים לאם להתייבש; כדי למנוע זאת מיד להוסיף PBS או בינונית המתאימה.
       

2. פרוטוקול 1: מזין ללא hPSC תרבות

הערה: hESCs התקבלו מארגון מסחרי (קו H01, ראה טבלה של חומרים). שלושה קווי הבקרה hiPSC (hvs51, 60 ו- 88) נוצרו על ידי התכנות fibroblasts מחולים שלושה בני אדם בריא (fibroblasts היו נגזר מתורמים אנונימיים, בלתי ניתן לזיהוי, ולכן פטור אישור IRB)10, 17.

  1. לשמור על hPSCs בתרבות נטולת מזין
    1. אחרי מפשיר ו ציפוי hPSCs על גבי לוחות PAAC hPSC בינוני (ראה שלב 2.2), לשמור על hPSCs ב 37 ° C עם 5% CO2. רענן hPSC בינוני מדי יום (ראה שלב 2.3), למעט היום אחרי מפשיר או passaging, ולבחון תאים במיקרוסקופ (מטרות: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0.25 Ph1) כדי לבחון את הצמיחה לדרג וזהה אזורים אפשריים בידול (איור 3 , פאנל שמאלי עליון מראה דוגמה של בידול).
    2. המעבר hPSCs כל 3-4 ימים, או כאשר תרבות מגיע > 80% הנהרות. אם פחות מ 5% של תאים בנספח בידול, שימוש נורמלי hPSC passaging שיטה (ראה שלב 2.4), אחרת להשתמש בשיטת עדין (ראה שלב 2.5). כאשר אין בה צורך בתרבות, hPSCs יתכן מוקפאות לאחסון לטווח ארוך (ראה שלב 2.6).
  2. הפשרת hPSCs hPSC בינוני
    1. להעביר נפח בינוני hPSC נדרש כדי צינורות סטרילי עבור תהליך שהביקושים (9 מ ל/קריוגני tube), לצלחת PAAC מוכן לקבל תאים המופשרים. תוספת המדיום שני צינורות עם 10 מיקרומטר RI.
    2. לאחזר את cryotube LN2 אחסון ומקום ישירות לתוך אמבט מים (37 מעלות צלזיוס). כאשר רק קטן קרח שרידי קריסטל, להסיר את האמבט במים, להעביר את התוכן של הצינור קריוגני הצינור עבור מפשיר תהליך (נפח כולל 10 מ ל). Centrifuge את הצינור ב g x 290 דקות 5-RT.
    3. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להסיר את PAAC פתרון מן הבארות של צלחת PAAC (ראה שלב 1.4) נועדו לקבל תאים, ולהוסיף hPSC בינוני עם 10 מיקרומטר RI.
      הערה: (חשוב) האם לא וביופסיה פתרון PAAC עם מחט שאיבה, או עשויים לחזק, לסתום את הקווים משאבת ואקום.
    4. הסר את תגובת שיקוע ברכבת התחתית, resuspend תאים hPSC בינוני עם 10 מיקרומטר RI. להפיץ את התאים לצלחת היעד ביחס של 1 קריוגני צינור/טוב של 6WP. דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2, רענון בינוני ליום 1.
      הערה: מתחיל את התאים ב- 5% O2 עשוי להגדיל הישרדות cell.
  3. רענן hPSC בינוני
    1. לחמם את אמצעי האחסון הדרושים בינוני hPSC בשפופרת סטרילי-RT או באמבט מים; 2 מ ל/טוב של 6WP הוא הציע.
      הערה: (אופציונלי): על-ידי הוספת סכום נוסף של hPSC בינוני, hPSCs יכול להישאר יום נוסף ללא רענון; עם זאת, אינם מאפשרים זאת יותר מפעם בשבוע.
    2. האחות המדיום מבארות המכיל hPSCs ולהוסיף בינוני hPSC טריים.
    3. תרבות של hPSCs בתוך אינקובטור-CO 37 ° C ו-5%2.
  4. מעבר hPSCs hPSC בינוני
    1. העברה נדרשים נפח בינוני hPSC צינורות סטרילי, עבור תהליך passaging, הכנת צלחת PAAC לקבל passaged תאים. תוספת האמצעי עבור היעד לצלחת עם 10 מיקרומטר RI. הצינורות בינוני ב RT או באמבט מים חמים.
      הערה: הכנה וטיפול ישתנו אם שימוש של חומר ציפוי חלופי מאחד המופיעים בטבלה של חומרים.
    2. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להסיר את PAAC פתרון מן הבארות של צלחת PAAC (ראה שלב 1.4) נועדו לקבל תאים, ולהוסיף hPSC בינוני עם 10 מיקרומטר RI.
      הערה: (חשוב) האם לא לשאוב הפתרון PAAC עם יניקה מחט, כפי שהוא עשוי לחזק הסותמים את הקווים משאבת ואקום.
    3. האחות המדיום מבארות עם hPSCs להיות passaged, לשטוף תאים פעמיים עם 0.5 מ מ EDTA, ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ מ EDTA את תקופת דגירה של 2-5 דקות ב 37 º C.
      הערה: 1 mL/טוב של 6WP הוא נפח מספיק של EDTA כביסה, דגירה.
    4. בדוק את בארות תחת המיקרוסקופ (מטרות: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0.25 Ph1). אם התאים מתחילים לנתק, תשאף EDTA פתרון ותאים סומק חינם באמצעות hPSC בינונית.
      הערה: (חשוב) היזהרו לא להסיר hPSC כל המושבות כאשר כ רפה בעברית EDTA (לא לחכות כל המושבות הן ניתוק). לא התרוקן התאים יותר מ 5 פעמים זה עלול לפגוע hPSCs, להשפיע על pluripotency. כמו כן, אל תיתן תאים עומדת hPSC בינוני עם RI לפני השטיפה תאים מבארות, כפי שהם מחדש עלול לדבוק הצלחת.
    5. על סמך קביעה אמפירית (בדרך כלל קשורה הנהרות, גודל של המושבות ואת שיעור הצמיחה), להעביר hPSCs בארות של צלחת היעד באמצעות פיצול יחס של 1:4-1:16 (קרי, ובכן 1 מהצלחת המקורית 4 בארות היעד צלחת). דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2, רענון בינוני ליום 1.
      הערה: פיצול יחסי גבוה ככל 1:16-1:20 אפשריות למנוע צפיפות, לשפר את המראה של המושבות.
  5. המעבר hPSCs באמצעות שיטת העדין (G-שיטה)
    1. העברה נדרשים נפח בינוני hPSC צינורות סטרילי, עבור התהליך passaging, הכנת צלחת PAAC לקבל passaged תאים. תוספת האמצעי עבור היעד צלחת עם 10 מיקרומטר RI. צינורות בינוני חם RT, או באמבט מים בטמפרטורה 37 º c
    2. פיפטה סרולוגית שימוש לפתרון PAAC הסר מבארות צלחת PAAC (ראה שלב 1.4) נועדה לקבל תאים, ולהוסיף hPSC בינוני עם 10 מיקרומטר RI.
      הערה: (חשוב) האם לא וביופסיה PAAC עם מחט שאיבה, או עשויים לחזק, לסתום את הקווים משאבת ואקום.
    3. האחות בינוני מן הבארות עם hPSCs כדי להיות passaged, לשטוף את התאים פעמיים באמצעות 0.5 מ מ EDTA. -לשטוף את השני, חכה 30 s לפני כ רפה בעברית EDTA, ואז להוסיף 1 מ"ל ל- PBS, תקופת דגירה של 4-9 min ב- 37 מעלות צלזיוס. תוך כדי המתנה, הכן צינור סטרילי עם 4 מ"ל ל- PBS.
      הערה: 1 mL/טוב של 6WP הוא נפח מספיק של EDTA לרחצה.
    4. בדוק את הבארות במיקרוסקופ (מטרות: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0.25 Ph1). אם התאים מתחילים לנתק, בזהירות הקש על צידי הצלחת לעזור המושבות חינם. כאשר > 50% של המושבות חינם צף, להשתמש פיפטה סרולוגית 5 מ ל כדי להעביר מושבות ב 1 מ"ל PBS הצינור המכיל 4 מ"ל PBS (לא triturate).
      הערה: (חשוב) מאז המטרה היא לנקות את התרבות hPSC, כדי לקבוע אם הבדיל תאים להישאר מחובר לצלחת. גם, זה לא צורך המעבר כל מושבות ובכן באמצעות תהליך זה, כך מושבות זה יישארו מצורפים עלול להשכח.
    5. המתן 5-10 דקות ב RT עבור תאים להתיישב בצינור (לא צנטריפוגה). האחות PBS ברכבת התחתית מטפל להסיר hPSCs התיישבו. Resuspend בקפידה את התאים hPSC בינוני (לא triturate), ולהעביר את התאים לצלחת היעד באמצעות פיצול יחס של 1:4-1:16. דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2, רענון בינוני ליום 1.
  6. להקפיא את hPSCs
    1. בהתאם למפגש, השתמש 1 טוב של hPSCs, ב- 2-3 ימים (מכסימום) בתרבות, למילוי 1-2 מבחנות הקפאה קריוגנית לאחסון LN2.
    2. בסוף passaging (שלב 2.5), להשתמש 500 µL או 1 מ"ל של hPSC מדיום להעביר תאים בין 1 טוב של 6WP 1 או 2 מבחנות הקפאה קריוגנית, בהתאמה (500 µL המבחנה). כדי כל שפופרת, להוסיף 500 µL של 2 x קפוא בינוני בינוני hPSC המכיל 20 מיקרומטר RI, דימתיל סולפוקסיד 20%.
      הערה: ניתן להעביר תאים (אופציונלי) ישירות ב- 1 x קפוא בינוני-1 mL/מבחנה.
    3. מקום הצינורות קריוגני במיכל ההקפאה (המכיל אלכוהול איזופרופיל) טרום מקורר עד 4 ° C, ו החנות מיד ב-80 מעלות צלזיוס.
    4. ביום הבא, העברת הצינורות קריוגני טנק2 של LN לאחסון לטווח ארוך.

3. פרוטוקול 2: 3D "תא צורב" בידול

  1. כיוונון של בידול G-שיטת שונה של passaging של hPSCs
    1. להעביר את הנפח הנדרש של NMM עבור מספר היעד בארות צינור סטרילי. תוספת עם 4 FGF2 ng/mL ו- 10 מיקרומטר RI. לחמם את הצינור בינוני RT, או באמבט מים בטמפרטורה 37 º c
      הערה: בהתאם למפגש של הבארות נכנסות, hPSCs מרוכזים במהלך ההתפלגות לצלחת היעד ב- 2:1 או 3:1 יחס (קרי, בארות 2 מהצלחת המקורית 1 טוב של צלחת היעד), עם אמצעי קצה של 2.5 מ ל/טוב של 6WP.
    2. האחות המדיום מבארות המכיל hPSCs כדי להיות מבודלים, לשטוף את התאים פעמיים באמצעות 0.5 מ מ EDTA. -לשטוף את השני, חכה 30 s לפני כ רפה בעברית EDTA, ואז להוסיף 1 מ"ל ל- PBS, תקופת דגירה של 4-9 min ב- 37 מעלות צלזיוס. תוך כדי המתנה, הכן צינור סטרילי עם 4 מ"ל ל- PBS.
      הערה: 1 mL/טוב של 6WP הוא נפח מספיק של EDTA לרחצה. (חשוב) עדיף להשתמש hPSCs היו לא יותר מ 3 ימים בתרבות לאחר המעבר אחרון ומעברים לפחות 1-2 לאחר מפשיר.
    3. בדוק בארות תחת המיקרוסקופ (מטרות: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0.25 Ph1). אם התאים מתחילים לנתק, לשחרר את התאים על-ידי הקשה עדין בצדדים של הצלחת. העבר את התאים שפופרת המכילה 4 מ"ל PBS עם פיפטה 5 מ ל.
      הערה: שטיפה קלה (חשוב), trituration מותר לשבור את המושבות ואת איסוף תאים רופף, אבל להתעלם תאים שנותרו מודבקת לצלחת.
    4. לאפשר את הצינור לשבת 10 דקות ב RT, להפרדה הכבידה. לחלופין, centrifuge את התאים בקלילות (לא יותר מ 200 גרם x-RT, עבור 5 דקות), אם נדרש.
    5. וביופסיה PBS ברכבת התחתית מטפל להסיר התיישבו hPSCs, resuspend תאי NMM עם 4 ננוגרם למ"ל FGF2 ו- 10 מיקרומטר RI, ולאחר מכן תפיץ לצלחת מצופה AA ביחס 2:1 או 3:1. דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2ורענן לא המדיום במשך 3 ימים, אלא אם כן נדרש (ראה שלב 3.2.1).
      הערה: (אופציונלי) לנוחות של העברת תאים, להוסיף חלק של תרבות בינוני בארות של צלחת היעד לפני הפצה, וכן resuspend התאים אמצעי אחסון קטן יותר. בנוסף, hPSCs עשוי להיות מוכתם וספרתי להגדרת הצפיפות תא ההתחלה המדויקת. עם זאת, עוצמת הקול הסופי בצלחת היעד צריך להיות 2.5 מ ל/טוב של 6WP.
  2. לשמור על בידול לתרשים תרבות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO2)
    1. בדוק את הצלחות בכל יום לקראת שינויים צבע בינוני, הצטברות של תאים מתים, הצליעה ההקפדה טוב לחיים.
      1. אופציונלי: ללא קשר בינוני שינוי בלוח הזמנים, רענן (כולל 3 הימים הראשונים לא מרענן) המדיום אם צהוב, ובצע את ההוראות עבור שינוי בינוני/רענון (שלב 3.3). אם רוב התאים מופיעים מת, בצע את ההוראות עבור שינוי/רענון בינוני עם כוח הכבידה ההפרדה (שלב 3.4).
        הערה: היווצרות EBs וצמיחה לתוך תאים גדולים אגרגטים צפויים, אך תאים, תא אגרגטים יכולים להתאחד לתוך גושים גדולים לא בשל גידול בודדים/התפשטות. אם זה הוא ציין, trituration אור כדי לשבור את ההמונים מותר. אם תאים לדבוק פני השטח פלייט-AA, הנותרים צף התוכן של בארות עשוי להעביר ישירות בארות חדשות, או המועברים במהלך התהליך של שינוי בינוני/רענון. אל תנסו להעביר תאים יש דבקה הצלחת.
    2. יום 3, לשנות את המדיום NMM עם 4 ננוגרם למ"ל FGF2. רענן המדיום בכל יום אחר.
    3. יום 7, שינוי של המדיום כדי NMM עם 1 מיקרומטר Retinoic חומצה (RA), 100 ננוגרם למ"ל FGF8B ו- 4 ננוגרם למ"ל FGF2. רענן המדיום בכל יום אחר.
      הערה: RA (חשוב) היא רגישים לאור. להגן על רא תרבות דגימות מן האור.
    4. ביום 14, לשנות את המדיום NMM עם 100 ננוגרם למ"ל FGF8B, 100 ננוגרם למ"ל FGF4 20 ng/mL FGF2. רענן המדיום בכל יום אחר.
    5. ביום 17, לשנות את המדיום NMM עם 100 ננוגרם למ"ל FGF8B. רענן המדיום בכל יום אחר.
    6. ביום 21, לשנות את המדיום NMM עם 100 ננוגרם למ"ל המוח נגזר Neurotrophic פקטור (BDNF) ו- 10 ננוגרם למ"ל גליה נגזר Neurotrophic פקטור (GDNF). רענן המדיום בכל יום אחר.
    7. ביום 28, לשנות את המדיום NMM עם 100 ננוגרם למ"ל BDNF ו 10 ננוגרם למ"ל GDNF, 3 ננוגרם למ"ל סאג, 100 ננוגרם למ"ל Neurotrophic פקטור 3 (NT3) ו- 25 מ מ אשלגן כלורי. רענון המדיום בכל יום אחר.
    8. ביום 35, לאסוף את organoids 3D לניתוח.
  3. שינוי/רענון בידול בינוני לתרבות תלת-ממד
    1. העברה הנפח הנדרש של NMM עם הרכיבים המתאימים (ראה שלבים 3.2.2-3.2.7 של רכיב זמנים) צינור סטרילי. חם באמבט מים בטמפרטורה 37 º C
    2. עצה את הצלחת ומנערים בעדינות עד התאים ליישב את הקצוות התחתון של הבארות. בזהירות להסיר 2 מ של המדיום הישן באמצעות פיפטה סרולוגית, הימנעות להסרה של התאים, ולאחר מכן להוסיף 2 מיליליטר בינוני טריים. דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2.
      הערה: נפח (חשוב) הסוף צריך להיות 2.5 מ ל/טוב של 6WP. אם מתרחשת התאדות, אינם מסירים 2 מ"ל ישנים בינוני כמו זה עוד יותר להתייבש על תרביות תאים; במקום זאת, הוסף בינונית נוספת.
  4. שינוי/רענון בידול בינוני עם כוח הכבידה ההפרדה
    1. להעביר את אמצעי האחסון הדרושים של NMM עם הרכיבים המתאימים צינור סטרילי. חם באמבט מים בטמפרטורה 37 º C
    2. להעביר את התוכן של הבארות צינור סטרילי, ולאפשר את הצינור לשבת 10 דקות ב RT, להפרדה הכבידה.
    3. השתמש פיפטה כדי להסיר את המדיום הישן ברכבת התחתית, לדאוג להסיר התיישבו תאים, resuspend ב NMM עם רכיבים המתאים, ולאחר מכן תפיץ את בארות חדשות מצופים AA. דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2.
      הערה: (אופציונלי) עבור נוחות, חלק בינוני תרבות עשויים להתווסף היעד בארות מוקדמת הפצה, עם המבדילים תאים resuspended באמצעי אחסון נמוכה יותר. אמצעי האחסון סוף צריך להיות 2.5 מ ל/טוב של 6WP.

4. פרוטוקול 3: תרבות אלטרנטיבית בידול 2D

  1. להתחיל ולשמור על תרבות באמצעות השלבים לפי סעיף 3 עבור פרוטוקול 3D דרך יום 12
    1. בצע צעדים 3.1-3.2.3 שינוי/רענון בינוני לפי שלבים 3.3 ו- 3.4.
  2. לעבור ולתחזק כתרבות טפט 2D
    1. ביום 13 של בידול, בצע את ההוראות עבור שינוי/רענון בינוני עם כוח הכבידה ההפרדה (שלב 3.4), רק להפיץ התאים/מצרפי לצלחת מצופה אש ף/לאם (ראה שלב 1.6) עם אמצעי קצה של 2.5 מ ל/טוב של 6WP.
      הערה: המדיום עשויים להיות בתוספת 10 מיקרומטר RI במהלך ציפוי ראשוני כדי לסייע להתמדה של הישרדות של תאים. (חשוב) רצוי למרוח באופן שווה התאים הבארות, כדי למנוע צפיפות נמוכה או הצפיפות על הלוחות, המעבר (ראה שלב 4.4) במידת הצורך. הגודל המועדף של אש ף/לאם מצופה לוחות (קרי, 6WP, 12WP, וכו ') מדעית להיקבע, המבוסס על קצב התפשטות עבור שורת תאים, ואת המטרה עבור המוצר. ייתן אמצעי אחסון עבור 6WP והוראות ניתן להמיר התמקחו על כל הכפלה של מספר טוב (כלומר, 2 מ ל/טוב 6WP, 1 מ"ל/טוב עבור 12WP, וכד')
    2. ביום 14, לשנות את המדיום NMM עם 100 ננוגרם למ"ל FGF8B, 100 ננוגרם למ"ל FGF4 20 ng/mL FGF2. רענן המדיום בכל יום כפי שמתואר בשלב 4.3.
    3. ביום 17, לשנות את המדיום NMM עם 100 ננוגרם למ"ל FGF8B. רענן המדיום בכל יום כפי שמתואר בשלב 4.3.
    4. ביום 21, לשנות את המדיום כדי NMM עם 100 ננוגרם למ"ל BDNF ו 10 ננוגרם למ"ל GDNF. רענן המדיום בכל יום כפי שמתואר בשלב 4.3.
    5. ביום 28, לשנות את המדיום NMM עם 100 ננוגרם למ"ל BDNF ו 10 ננוגרם למ"ל GDNF, 3 ננוגרם למ"ל סאג, 100 ננוגרם למ"ל NT3 25 מ מ של אשלגן כלורי. רענון המדיום בכל יום כפי שמתואר בשלב 4.3.
    6. ביום 35, לאסוף תאים לניתוח, או לשמור על מדיום אותה כשלב 4.2.5 לתרבות מורחבת (פוטנציאל מוגבל לא בדקה).
  3. שינוי/רענון בידול בינוני לתרבות 2D
    1. להעביר את הנפח הנדרש של NMM עם רכיבים המתאימים (ראה שלבים 4.2.2-4.2.5 של רכיב זמנים) צינור סטרילי. חם באמבט מים בטמפרטורה 37 º C
    2. תשאף המדיום בארות, ולאחר מכן להוסיף בינוני חדש 2 מ"ל. דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2.
      הערה: נפח (אופציונלי) הסוף ניתן לשמור ב- 2.5 מ ל/טוב של 6WP, בעזרת פיפטה כדי להסיר 2 מ של המדיום הישן והוספת 2 מיליליטר בינוני טריים. את הזמנת חלק ישנים בינוני בארות, וכן מניעת תאים מן האוויר קשר, עשוי להפחית הלם על התאים במהלך השלבים לשינוי.
  4. המעבר בידול 2D תרבות
    1. להעביר את הנפח הנדרש של NMM עם הרכיבים המתאימים (ראה שלבים 4.2.2-4.2.5 של רכיב זמנים) צינורות סטרילי, עבור passaging תהליך, בנפרד, כדי להכין את אש ף/לאם מצופה לוח עבור קבלת תאים passaged. תוספת המדיום של צלחת היעד עם 10 מיקרומטר RI. לחמם את הצינורות בינוני RT, או באמבט מים בטמפרטורה 37 º c כדי לשמור על רכיבים, זה ניתן להשתמש NMM לבד לניקוי התאים במהלך תהליך passaging.
      הערה: (חשוב) אם המוצרים ישמש בתחום ההדמיה סידן ניסויים, להבטיח לתאים המעבר בין 2-6 ימים לפני סוף בידול.
    2. האחות המדיום מבארות כדי להיות passaged. להוסיף µL 300/טוב של הסוכן מבוסס-טריפסין דיסוציאציה (ראה טבלה של חומרים), צלחת מערבולת כדי לכסות את וולס ולאחר מכן להסיר לאלתר את הסוכן דיסוציאציה.
    3. לאפשר את הצלחת לשבת למשך 2 דקות ב RT, ולאחר מכן שחרר את התאים על ידי הקשה על הצדדים של הצלחת. להוסיף מעכבי טריפסין מוגדר µL/טוב 600 (DTI) ולהעביר התאים DTI צינור סטרילי עם 5 מ ל NMM.
    4. Centrifuge את הצינור ב 290 x g למשך 15 דקות ב- RT. וביופסיה המדיום ולהוסיף עוד 5 מ"ל NMM ברכבת התחתית.
    5. Centrifuge את הצינור ב 290 x g למשך 15 דקות ב- RT. וביופסיה המדיום, resuspend התאים המדיום המתאים המכיל RI.
    6. להפיץ את התאים על הצלחת אש ף/לאם באמצעות פיצול יחס של 1:1-1:12, בהתאם למפגש הראשוני, קצב התפשטות, ולגודל דיפרנציאלית במקורם לצלחת היעד, ולתחזק ב 37 ° C עם 5% CO2.

Representative Results

מבט כולל ויזואלי על צמיחה מופחת גורם פרוטוקולים בידול אסטרוציטומה 2D and 3D
איור 1 מציג את ציר הזמן הכולל עבור הפרוטוקולים בידול אסטרוציטומה 2D and 3D, זיהוי גורמים extrinsic והשעה של ציפוי. התקדמות אופיינית עבור hPSCs שעברו התמיינות אסטרוציטומה 3D מתוארת באיור2: עם קו hESC H01 החל בתור מושבות בתרבות נטולת מזין ביום 0 (השמאלית העליונה של דמות); בתהליך היווצרות EB ביום 2 (האמצעי העליון); גדל לתוך אגרגטים תאים גדולים עם לומן לכאורה בעקבות אינדוקציה עצביים עם RA ו FGF8 ביום 14 (מימין); ויוצרים אגרגטים של משתנה גודל וצורה -28 יום (השמאלית התחתונה); פיתוח של מורכבות עם מבנים שונים של צבירה יחיד, ציין ביום 28 (באמצע התחתון); והמשיך עם שינויים מורפולוגיים למבנים באותו יום 35 (הימנית התחתונה). התקדמות אופיינית עבור hPSCs שעברו התמיינות אסטרוציטומה 2D מתואר באיור3: עם hESC קו H01 בתור מושבות בתרבות נטולת מזין ביום 0 (השמאלית העליונה של דמות עם מעגל המציין אזור של תאים הבדיל בין מושבות hESC) ; בתהליך היווצרות EB ביום 2 (האמצעי העליון); גדל לתוך אגרגטים תאים גדולים עם לומן לכאורה בעקבות אינדוקציה עצביים עם RA ו FGF8 ביום 13 (מימין); מתרבים כמו תאים חסיד לאחר ציפוי ביום 14 (השמאלית התחתונה); ואז כמו טפט של תאים עם יותר בוגר/מתחם מורפולוגיה ביום 35 תחת נמוך (באמצע התחתון), בהגדלה (הימנית התחתונה).

סמני תערוכת מוצרים תלת-ממד ומבנים של Neuroepithelium מוקדם
איור 2 (התמונה השמאלית התחתונה) ולהראות את הטרוגניות 3D מורפולוגיה צבירה לראות בכל רחבי culturing, משתנה צמיחה ו/או המחירים ההבשלה, כמו גם מיזוג סטוכסטי או מתפרקת של אגרגטים של איור 4 . למרות הטרוגניות, בידול כל מפיק אגרגטים מפגין סמנים עצביים ו עצביים מוקדם, כולל גרגר אסטרוציטומה סמן ZIC1, כפי שמציין immunocytochemistry (ICC) צביעת באיור5. וחשוב מכך, איור 5 ו- 6 איור מראים כי תרבות 3D פשוטה, עם גורמי גדילה מופחתת, הוא מסוגל לייצר אגרגטים עם מבנים מורכבים הקשורים להתפתחות המוח כגון neuroepithelium מוקדם, שפתיים ומעוינים.

סמני אסטרוציטומה של התערוכה מוצרים 2D ופעילות. עצבית תפקודית
בעוד תרבויות 2D לא יכול לשחזר מבנים תלת-ממדיים מורכבים, הם מסוגל לייצר תאים מפגין סמנים עצביים ו עצביים מוקדם, כולל גרגר אסטרוציטומה סמן תא ZIC1, כפי שמציין ICC מכתים איור7. ניתוח ביטוי גנטי באמצעות RT-PCR, כפי שניתן לראות באיור 8, תומך תוצאות מכתימים ICC, למרות נוכחותם של גרגר מוקדם תא סמן ATOH1 הוא משתנה בין ניסויים וקווים. הדמיית סידן מתבצע בקלות רבה יותר בתרבות 2D. כפי שניתן לראות באיור 9, משלימה Video 1ו 2 הסרטונים משלימה, תאים חשמלית מגורה להראות influxes סידן האופייניים של דפוסי הירי עצביים, רומז הדור של נוירונים פונקציונלי.

Figure 1
איור 1: ציר הזמן של פרוטוקול בידול (החל מיום התמיינות 0). קו מלא תיבות מציינות כאשר גורמים ספציפיים נוספים המדיום תרבות, קו מנוקד תיבות מצביעים על הצלחת ציפוי ולשנותן 2D אופציונלי. עבור FGF2, החץ למטה מתייחס ריכוז נמוך יותר (4 ng/mL), ואת החץ למעלה מתייחס ריכוז גבוה (20 ng/mL). דמות זו שונתה הולמס ואת היינה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נציג brightfield תמונות של פרוטוקול 3D. hESC המושבות ב d0, EBs-d2, אגרגטים בעקבות אינדוקציה d14, אגרגטים של גודל שונה, מורפולוגיה (ממוספרים 1-5)-d28, צבירה יחיד עם ייחודי, המאפשר זיהוי תכונות (שצוין על-ידי האותיות –c) d28, ו השינויים גלויים ב- אותן תכונות ב- d35. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. דמות זו שונתה הולמס ואת היינה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: נציג brightfield תמונות של פרוטוקול 2D- hESC המושבות d0, EBs-d2, אגרגטים לאחר אינדוקציה-d13, לאחר ציפוי אגרגטים-d14, לאחר ההבשלה-d35 כפי שניתן לראות ב 5 x הגדלה, 20 x הגדלה. העיגול הלבן בחלונית השמאלית העליונה מציגה האזור של תאים בין מושבות hESC. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: תמונות Brightfield מציג בגדלים והמורכבות בתרבות 3D. (א) ביום 8 (hESCs), אגרגטים (B) d35 (hiPSCs). התמונה השנייה מורכבת משלוש תמונות נפרדות כדי להציג את כל הצבירה. שניהם אגרגטים שסבורים כי הושפעו על-ידי מיזוג של אגרגטים קטנים יותר או אובדן (שובר) של מבנים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. איור זה פרסום מחדש של הולמס והיינה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: ICC תמונות של מוצרים תלת-ממד מראים סמנים רלוונטיות ומבנים. על התרבות d35, תערוכת מוצרים תלת-ממד: PAX6 (ירוק), TBR2 (אדום) על ידי לומן היווצרות שושנת עלים דמויי עצבית (בשורה הראשונה); DCX (ירוק), NeuN (אדום) הפצת מאזור חדרית הקצה החיצוני (VZ)-כמו מבנה (שורה שנייה); KIRREL2, סמן המשויך neuroepithelium אסטרוציטומה (שורה שלישית נשאר); ZIC1 סמן המשויך גרגר אסטרוציטומה תאים (שורה שלישית, נכון). הניסוי נערך פעמים רבות באמצעות ארבע שורות hPSC שונים: קו hESC H01 (n = 5), ואת iPSC קווים hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), ו- hvs51 (n = 1). חצים הצבע לשפה ומעוינים (RL)-כמו מבנה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. איור זה פרסום מחדש של הולמס והיינה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: בקנה מידה גדול, כמו אזור חדרית המבנה במוצר 3D. תרבות d35, צבירה הנגזרות hESC הוא חיובי PAX6 (ירוק), TBR2 (אדום) הקשורים בדרך כלל מוקדם נוירונים בתוך אזורי חדרית (VZs) ואזורי subventricular (SVZs), בתוך vivo. (למעלה) כוכבית (*) מסמן את הצד הפסגה של אזור VZ דמוי פועל בשולי הצבירה, עם סוגריים המציינת את עומק/חלוקת VZ / SVZs-(באמצע) ממוזג אותות הראה פזורים סעיפים PAX6 / TBR2-תאים הגדלת גודל לכיוון לקצה הימני העליון של VZ. (למטה) תמונת הגדלה גבוהה יותר של המקטע המצוין על-ידי מלבן בחלונית האמצעית. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. דמות זו שונתה הולמס ואת היינה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: ICC תמונות של מוצרים 2D הצג סמני רלוונטי. על התרבות d35, בתערוכה למוצרי 2D, hESCs (שורה עליונה), hiPSCs (שורה תחתונה), תאים חיובית: סמן תא גרגר ZIC1 וסמן נוירון אסטרוציטומה נודדות TAG1 (העמודה משמאל). ו neurofilament סמן עצביים (NF) ו TAG1 (בעמודה הימנית). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: RT-PCR של מוצרים 2D- ניתוח ביטוי mRNA של hESC קו H01 (שורה עליונה) ו- hiPSC קו hvs60 (שורה תחתונה) בסוף דו-ממדי פרוטוקול מציגה מוצרים עם אלקטרופורזה בג'ל עבור: גרגר תא סמן ZIC1, גרגר סמן תא ATOH1, נוירון אסטרוציטומה נודדות סמן TAG1, Purkinje סמן תא Calbindin (CALB), סידן תלוית מתח ערוץ CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), קולטן B גאמא אמינו בוטירית (GABA) 1 (G-Br1), ואת משק הגן EIF4G2).

Figure 9
איור 9: סידן הדמיה/ניתוח של מוצרים 2D- על התרבות d35, hPSC בידול מוצרי נרשמו למשך 2 דקות תחת המיקרוסקופ, לאחר דגירה עם צבע fluor5. 30 s, התאים היו מגורה חשמלית 10 s-10 Hz. (א) תמונות סטילס הצג hESCs ב 0 s (משמאל) ואחרי תחילת גירוי חשמלי 30 s (מימין). חיצים מציינים אזור בעל עניין (ROI) לניתוח של סידן זרם. שינוי מראה גרפי ניתוח (B) זריחה היחסי לעומת הזמן של רועי (שינוי פלורסצנטיות = /F (F-F0)0, איפה F0 = (∑F1-n) / n), עם קוצים כמו נוירון המתרחשים לפני, במהלך, ואחרי גירוי. פס שחור מציין אורך גירוי חשמלי. קנה המידה של בר (לבן) = 50 מיקרומטר. מלאה הקלטה עבור hESC (כפי שניתן לראות כאן) קו hiPSC (לא מוצג) הינם זמינים משלים Video 1 ו- 2 וידאו משלימים, בהתאמה. הקלטות הם בפורמט AVI, במהירות 4 x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלימה 1 וידאו: סידן הדמיה וידאו של 2D המוצר מקו hESC H01. על התרבות d35, בידול מוצרים מקו hESC H01 הוקלטו 2 דקות תחת המיקרוסקופ, לאחר דגירה עם fluor5 לצבוע. 30 s, התאים היו מגורה חשמלית 10 s ב- 10 Hz. הקלטות היו נעשים ב- 2 מסגרות/s, מעובד וידאו AVI-~ 7 מסגרות/s, הפקת וידאו שנמשך ~ 30 s, במהירות x ~ 4. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה 2 וידאו: סידן הדמיה וידאו של 2D המוצר של hiPSC קו hvs51. על התרבות d35, בידול מוצרי hiPSC קו hvs51 נרשמו למשך 2 דקות תחת המיקרוסקופ, לאחר דגירה עם צבע fluor5. 30 s, התאים היו מגורה חשמלית 10 s ב- 10 Hz. הקלטות היו נעשים ב- 2 מסגרות/s, מעובד וידאו AVI-~ 7 מסגרות/s, הפקת וידאו שנמשך ~ 30 s, במהירות x ~ 4. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

המורכבות עלויות הגורמים הרלוונטיים עבור תא גזע חוקרים בעת בחירת או לפתח פרוטוקולים בידול בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. דבר זה נכון במיוחד כפי שהיא שאלה פתוחה של כמה שליטה חיצוני נדרש כדי ליצור סוגי התאים הרצוי, או — לדגמן את זה אחרת – כמה hPSCs המוסמכת לייצר סביבה התפתחותית משלהם, אם עזב אל עצמם עם מספיק חומרים מזינים. הקדמה של גורמים extrinsic במבחנה היטב יכולות להפיק מוצרים התא הרצוי, אך הם גם עלולה להפריע עם הקיבולות התפתחותי מהותי תאים שכישוריי ויוו. שיקולים כאלה הם חשובים, במיוחד אם המטרה היא שימוש iPSCs החולה-derived עבור מידול המחלה. שימוש נרחב המתבנת ו/או גורמי גדילה יכול להסוות מחלה פנוטיפים. הפרוטוקולים המפורטים בדוח זה להמשך המגמה של מחקרים קודמים כדי להפחית את המורכבות, עלות, ו/או השימוש המתבנת החיצוניים גורמים8,9.

בהתבסס על תוצאות שדווחו על-ידי. Muguruma et al., והלימוד האחרונה שלנו, נראה שאפשר להשיג בידול כלפי גורלם אסטרוציטומה ללא מאמצים למיגור להתרבות ויוו תנאים, כפי שעשו מחקרים מוקדמים יותר 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. החלק מסקרן הוא שמשתמשים המחקרים שני סטים שונים של גורמי גדילה, רומז כי אף קבוצה היו נחוצים, אם כי שניהם להשתמש FGF2. . הרצנו בדיקות נוספות, איפה FGFs היו באופן סלקטיבי נכללו הפרוטוקול, הראה כי התאים היו מסוגל לייצר את אותם מוצרים ללא FGFs חיצוני10... ההבדלים בין המחקרים שלנו היו מוסמכים על ידי העובדה כי אנחנו בשימוש קווים hPSC שונים ופעולות תרבות המושרה בידול עצביים עם RA, כולל רכיבים כדי לתמוך הישרדות cell גרגר ועם בגרות (BDNF GDNF, סאג, אשלגן כלורי)11 –14. בנוסף, שיטת ההפעלה פחות מורכב, בהשוואה ל- Muguruma. et al., הועסק. פרוטוקול שלהם החלה על ידי יצירת EBs אחיד ב- 96WPs, אשר מבודדים אותם פיזית, כימית אחד מהשני. הפרוטוקול פה היה מגירסה יחסית צפוף יחד 6WPs במהלך היווצרות EB, אשר אפשרה להם לפעול בחופשיות. איך זה ייתכן באופן שונה השפיעו על סביבה הפיסיקליות והכימיות של EBs מאוחר יותר organoids (כולל ייצור מהותי של איתות תרכובות) אינה ידועה, יכולה להיחקר. בנוסף, בעוד אנו מציגים את הביטוי של גנים הקשורים — ו שבחבורה של — מקור אסטרוציטומה, ממוקם בתוך מבנים מורפולוגית דומים לאלה שדווחו על-ידי Muguruma. et al., אנחנו לא יכולים להוציא מהדור עצביים כמו מבני זה הן זהות שאינה אסטרוציטומה. מחקרים עתידיים, באמצעות פאנל גדול של נוגדנים כאלה שדווחו על-ידי. Muguruma et al. (כלומר, ATOH1, CALB, וכו) יעשה כזה הקצאות, השוואה בין מוצרים של פרוטוקולים, יותר חד משמעיות.

בתוך פרוטוקול 3D, זה חשוב כדי להתחיל עם, לשמור על מספר מספיק של תאים בתרבות כדי להבטיח מספר מספיק של מוצרי קצה לניתוח. בהתחשב die-off משמעותי מוקדם בפרוטוקול, מומלץ להתחיל עם יותר מ-500 EBs/טוב במהלך 3 הימים הראשונים בתרבות (איור 1). זה לא צריך להיות בקשיים להשיג המושבה נתון גדלים עבור hPSCs בתרבות נטולת מזין, אבל לא יכול להיות קל עבור אלה עדיין בשיטות תלויי-מזין. לאור המספר הגדול של תאים, חשוב לשמור על שינוי הצבע בינוני (המציין שינוי ה-pH), ואת הצטברות של תאים מתים. שניהם חייבים לתקן כדי למנוע התמוטטות של התרבות. יתכן שיש גם הצליעה של תאים, אגרגטים לתוך מבנים גדולים. למרות שזה עלול לגרום עדיין אגרגטים מסוגל לנתח, כמות המוצר תהיה פחותה בהרבה, כך נפרדים אותם לתוך אגרגטים קטנים יותר עם trituration עדין יכול להיות שימושי. אולם, להימנע מטרידה אגרגטים נורמלי, אשר עצמם יכולים לגדול במידות גדולות (איור 4). אם אגרגטים להיות דליל מדי, מומלץ לשלב בארות כך אגרגטים אינם מבודדים לגמרי. המוצר השתנות (ב מספר, גודל ומורפולוגיה) זו בעיה ידועה היטב בתרבות תא תלת-ממד, לרבות עבור פרוטוקולים אלה החל שלבי היווצרות EB מבודדת, אחיד, המציעה כי הליך הפעלה פחות מורכבים (כגון פרוטוקול המתוארים כאן ) יכול להיות יותר מעשי8,15. הטרוגניות זו אמנם משהו החוקרים צריכים לזכור, במיוחד במהלך ניתוח, פרוטוקול דיווח שנוצר מוצרים בקנה אחד עם אלה שנמצאו9,8,15אחרים פרוטוקולים 3D. בהתבסס על גודל, מורפולוגיה, הם נופלים בטווח של רוזט עצבית תא צורב המוח כפי שתואר בסקירה האחרונה על ידי Kelava ו לנקסטר15, עם הכי מתאים את הסיווג של ספרואיד. בולטים במיוחד, הן הנוכחות של מבנים תלת-ממד רמיזות של עצבי רוזטות עם לומן, אזורי חדרית (sub) ומעוינים-lip כמו תכונות (איור 5 ו איור 6) כפי שזוהו על ידי קבוצות השני8 , 15 , 16 , 17. מאז בכל ניסוי המיוצר לפחות אחד צבירה עם VZ בשם/SVZs אסטרוציטומה הקשורים סמנים (ZIC1, KIRREL2), אלו קריטריונים שימושי לקביעת ההצלחה של הבחנה תלת-ממד באמצעות הפרוטוקול שלנו עם דמוי-RL כולל מתן תמיכה נוספת. להאריך את משך תרבות העבר 35 ימים לא נבחנה, אבל יכול להיות נרדף לקבוע את גודל מרבי של צמיחה, מורכבות ובגרות מורשה על-ידי טכניקה זו.

פרוטוקול 2D משתמש באותה צורה EB שאינם מחסידי ותהליך אינדוקציה עצביות כמו פרוטוקול תלת-ממד, אז חלים גם דבריו לעיל. ברגע מצופה, קבוצה שונה של שיקולים שיש לשקול. EBs צריך לדבוק במהירות עבור תאים להתרבות החוצה לצלחת. אם יש בעיות עם הדבקות, תוספת של RI (אם כבר לא בשימוש), צמצום נפח בינוני, או ניתן להחיל שינויים ניסיוני בריכוז אש ף/לאם. זה חשוב לשמור תאים לגדול מדי צפוף או דלילים (רצוי בוגר בין 20-80% confluency) ב הבארות; פיקוח יומי, בזמן passaging חשוב להימנע תאים מעל-confluency או צף. בניגוד פרוטוקול תלת-ממד, לא אמור die-off משמעותית במהלך תרבות, אם כי ייתכנו אזורים של צמיחה המסכן, או על האטה של התפשטות המחירים. Passaging משפיע על המדינה ההבשלה של תאי (לדוגמה, הסרת התא תהליכי ורשתות המפותח בין תאים), יש לשמור בראש כשאתם מתקרבים נקודות איפה שנאסף או ניתח בצורה כלשהי תאים. לדוגמה, עבור סידן הדמיה זה חשוב מאוד לתאים המעבר בין 2-6 ימים לפני הניתוח. Passaging קרוב ניתוח המשמעות של תאים לא הספיקו כדי לחבר ו/או בוגר, רחוק מדי עלולה לגרום בתאים צפיפות יתר, מקשה על הדמיה. למרות השתנות בין ניסויים יכול להתקיים, התוצאות הן עקביות ביחס לאלה דיווח ראשוני פרוטוקולים אסטרוציטומה 2D1,2. ICC מכתים ג'ין ביטוי וניתוח לאמת את נוכחותם של תאים חיוביים עבור סמן תא גרגר ZIC1, בזמן גם זיהוי סמנים המשויך זהויות עצבית, אסטרוציטומה אחרות (איור 7 , איור 8). הדמיית סידן, אשר מערבת גירוי חשמלי של תאים מודגרות עם צבע fluor5, ציינו פונקציונלי פעילות. עצבית (איור 9 משלימה איור 1, משלימה איור 2), למרות שזה לא נכון אם אלה היו תאים גרגר. לנתיחה על ידי מתן התאים יותר זמן להבשיל על-ידי הרחבת האורך של תרבות העבר 35 ימים, מידת פעילות. עצבית תפקודית צריך להגדיל את זה פוטנציאל זה יכול להיחקר בעתיד.

בנוסף השורות של מחקר שהוצעו לעיל, זה יהיה עניין לקבוע הבדלים זהויות המוצר (בכמות ובאיכות) בין הפרוטוקולים 2D and 3D. חשיבותה של FGFs החיצוניים לא נבדקה בפרוטוקול 2D, וזה יהיה שימושי לדעת אם חוסר במבנה התלת-ממדי לאחר ציפוי, אז משויך איתות המסלולים, יגרום תרבויות 2D פחות או יותר תלוי אלה מוקדם תכנים תרכובות. פרוטוקולים בפרשן יותר (למשל, לא רה, BDNF, סאג) הם באותה מידה סביר קוי לחקירה נוספת. בסופו של דבר, מחקרים עתידיים עשויים להפיק תועלת כלי מחקר חדש כדאי לאפיין (והערכת יעילות הדור) יחוברו עצביים אסטרוציטומה אדם ספציפי.

עם ההליכים נתון בראש, שניהם דיווח פרוטוקולים עשוי לשמש differentiations אסטרוציטומה, עם מוצרים המותאמים למטרות שונות. הם עשויים לשמש נקודות המוצא מעשי לחוקרים מחקרים פיילוט, בדיקות הכדאיות של שורות תאים כאלה differentiations, או כמודל בסיסי עבור סוגים אחרים של בידול עצבית יישוב.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנחנו אסירי תודה ג'ייקובס Gerbren, Jurjen Broeke לקבלת סיוע טכני מומחה שלהם, כדי Prisca Leferink עבור תרומה של דור ואפיון של שתי שורות iPSC שליטה, וכדי ליסה Gasparotto הממחיש את הנהלים שלנו

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12+Glutamax Gibco 31331-028 glutamine fortified DMEM/F12
Neurobasal medium Gibco 21103-049 neural basic medium
N2 supplement Gibco 17502-048
B27 supplement Gibco 17504001
Insulin Imgen PT468-B
L-glutamine Gibco 25030-024
Non-essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
beta-mercaptoethanol Gibco 21985-023
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma P3932 aka Poly-Hema
Laminin Sigma L2020
E8 medium and supplement Gibco A1517001 hPSC medium and supplement
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Sodium Chloride Sigma S-5886
y-27632 (ROCK inhibitor) SelleckChem S1049-10mg
DMSO Sigma D-2650
Geltrex Gibco A1413302 hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)
0,5M EDTA Gibco 15575-020
0.2 um filter VWR 28145-77
1.5 mL Eppendorf tube VWR 525-0130
DMEM/F12 Gibco 21331-020
Ethanol VWR 83804360
Parafilm Sigma PM996 wrap for culture plates
cryotubes ThermoFisher 368632
TrypLE Gibco 12563-029 trypsin-based dissociation agent
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) Gibco R-007-100
FGF-2 Peprotech 100-18B
FGF-4 R&D Systems 100-31
FGF-8B Peprotech 100-25
Retinoic Acid Sigma R2625
Brain Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-02
Glial Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-10
Potassium Chloride Sigma P5405
Neurotrophic Factor 3 Peprotech 450-03
Smoothened Agonist (SAG) Cayman 11914 CAS 912545-86-9
Axiovert 40C microscope Zeiss Brightfield imaging microscope
Axiocam Zeiss Brightfield imaging - image aquisition
Eppendorf Centrifuge 5810 Eppendorf 521-0996 centrifuge for cell culture
PBS (gebufferde natrium oplossing) Braun Medical 3623140
5 ml Serological pipets VWR 612-4950
10 ml Serological pipets VWR 612-4951
6-wells culture plates VWR 734-2323
12-wells culture plates VWR 734-2324
hESCs WiCELL line H01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).
  2. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. , Chapter 1, Unit 1H 5 (2012).
  3. Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells. Dev Biol. 290, 287-296 (2006).
  4. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).
  5. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development. Trends Genet. 12, 15-20 (1996).
  6. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).
  7. Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities. Fetal and Neonatal Physiology. , 5th ed, (2017).
  8. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Rep. 10, 537-550 (2015).
  9. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12, 671-678 (2015).
  10. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6, 402-406 (2017).
  11. Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened. Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).
  12. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).
  13. Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  14. Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129, 1435-1442 (2002).
  15. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).
  16. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).
  17. Englund, C., et al. Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J Neurosci. 25, 247-251 (2005).
  18. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, 782-789 (2011).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 130 3D תא צורב תאי גזע pluripotent המוח הקטן גרגר תא קורטקס
פרוטוקול בידול אסטרוציטומה 3D יעיל בשינוי 2D אופציונלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holmes, D. B., Heine, V. M.… More

Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification. J. Vis. Exp. (130), e56888, doi:10.3791/56888 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter