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Developmental Biology

वैकल्पिक 2d संशोधन के साथ सुव्यवस्थित 3 डी अनुमस्तिष्क भेदभाव प्रोटोकॉल

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/56888
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics/Child Neurology, Amsterdam Neuroscience, VU University Medical Center, 2Department of Complex Trait Genetics, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

Summary

हम hPSCs के लिए एक सरलीकृत 3 डी भेदभाव प्रोटोकॉल का वर्णन, परिभाषित मध्यम और कम वृद्धि कारकों का उपयोग कर, जल्दी neuroepithelial संरचनाओं के साथ सेल समुच्चय पैदा करने में सक्षम है और अनुमस्तिष्क के लिए सकारात्मक-जुड़े मार्करों, साथ ही साथ एक वैकल्पिक 2 डी संशोधन के लिए एक monolayer के रूप में कोशिकाओं अंतर कार्यात्मक ंयूरॉंस उत्पंन करने के लिए ।

Abstract

जटिलता और भिंनता प्रोटोकॉल की लागत को कम करने के शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण है । यह ब्याज संभव अवांछित प्रभाव के बारे में चिंताओं के साथ फिट बैठता है कि बाह्य पैटर्न कारकों मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) मस्तिष्क विकास या मास्किंग रोग phenotype के रूप में pathophysiology, के मॉडल में पेश हो सकता है । यहां, हम hPSCs के लिए दो अनुमस्तिष्क भेदभाव प्रोटोकॉल, सरल स्टार्टअप विधि के साथ डिजाइन, कम पैटर्न कारकों, और पिछले प्रोटोकॉल से कम सामग्री आवश्यकताओं को पेश करते हैं । हाल ही में, हम संस्कृति प्रक्रियाओं है, जो मुक्त फ्लोटिंग 3 आयामी (3 डी) अंय मस्तिष्क "organoid" प्रोटोकॉल, जैसे कि उप/वेंट्रिकुलर क्षेत्र के रूप में मस्तिष्क विकास मॉडलिंग के लिए प्रासंगिक morphologies सहित के अनुरूप उत्पादों को विकसित-और rhombic होंठ संरचनाओं की तरह । दूसरा एक अनुयाई, 2d monolayer प्रक्रिया का उपयोग करता है भेदभाव को पूरा करने के लिए, जो कार्यात्मक अनुमस्तिष्क ंयूरॉंस पैदा करने में सक्षम दिखाया गया है, के रूप में उत्पादों अनुमस्तिष्क के लिए सकारात्मक-जुड़े मार्करों रहे हैं, और प्रदर्शन ंयूरॉन-कैल्शियम आमद की तरह । साथ में, इन प्रोटोकॉल वैज्ञानिकों विकल्पों में से एक विकल्प की पेशकश विभिंन अनुसंधान प्रयोजनों के लिए उपयुक्त है, साथ ही साथ एक बुनियादी मॉडल के रूप में सुव्यवस्थित तंत्रिका भेदभाव के अंय प्रकार के परीक्षण के लिए ।

Introduction

इन विट्रो में अनुमस्तिष्क वंश की ओर hPSCs अंतर के लिए प्रोटोकॉल शुरू में vivo अनुमस्तिष्क development1,2,3,4में नकल उतार के सिद्धांत पर संचालित । जैसे, वे विशिष्ट समय में पेश करने के लिए समर्थक अनुमस्तिष्क patterning और परिपक्वता ड्राइव कारकों की एक उत्तराधिकार की आवश्यकता है । इन के बीच प्रमुख थे WNT, बोन morphogenetic प्रोटीन (BMPs), और fibroblast विकास कारकों (FGFs) के मध्य hindbrain विकास और गठन में ज्ञात भूमिकाओं के साथ isthmic आयोजक5,6,7। बेशक, प्रत्येक अतिरिक्त कदम और कारक श्रम में वृद्धि-गहन जोड़तोड़ और शोधकर्ता के लिए अधिक से अधिक खर्च का मतलब है, और इतना सरल समान परिणाम प्राप्त करने में सक्षम प्रोटोकॉल विकासशील ब्याज की है । इस व्यावहारिक काल्पनिक सवाल के साथ अच्छी तरह से dovetails मुद्दा है, कि क्या कोशिकाओं को ऐसे तंग, बाहरी इन विट्रो मेंविकास पर नियंत्रण की आवश्यकता है ।

अनुमस्तिष्क भेदभाव के लिए, २०१५ में प्रकाशित एक प्रोटोकॉल केवल FGF2, FGF19 का उपयोग करके विकास कारकों की एक व्यापक संख्या का उपयोग करने की आवश्यकता को संबोधित किया, और stromal कोशिका व्युत्पंन कारक 1 (SDF1) प्रयोजनों के लिए8। यह अध्ययन भी पूर्व अनुमस्तिष्क प्रोटोकॉल से अलग, एक मुक्त-फ्लोटिंग 3 डी संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके । अनुमस्तिष्क मार्करों के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के उत्पादन के अलावा, मस्तिष्क "organoids" उनकी तकनीक द्वारा उत्पन्न इस तरह के rhombic होंठ की तरह संरचनाओं के रूप में प्रासंगिक आकृति विज्ञान, पारंपरिक 2d monolayer संस्कृतियों में अनुपलब्ध प्रदर्शन करने के लिए दिखाए गए थे. हालांकि विकास कारकों के संबंध में कम जटिल और महंगा है, ऐसी वर्दी embryoid निकायों के गठन के रूप में अंय सुविधाओं (EBs) और ९६ में संस्कृति-अच्छी तरह से प्लेट्स (96WPs), यह प्रारंभिक चरणों के दौरान प्रक्रियात्मक जटिल बना दिया । एक और 3 डी प्रोटोकॉल उसी वर्ष प्रकाशित, तंत्रिका आम और सस्ती सेल संस्कृति तकनीक9का उपयोग कर वंश को सफल भेदभाव की सूचना दी । हालांकि इस समूह अनुमस्तिष्क भेदभाव के बजाय cortical की जांच कर रहा था, अनुमस्तिष्क भेदभाव के लिए उनकी अवधारणा के आवेदन छूट नहीं किया जा सकता है ।

हमने हाल ही में एक 3 डी अनुमस्तिष्क भिंनता प्रोटोकॉल (अर्थात्, FGF2, 4, और 8) पैटर्न के एक कम संख्या का उपयोग कर रिपोर्ट, साथ ही साथ एक सरलीकृत सेटअप 6 में कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्लेटें (6WPs) मध्यम आवश्यकताओं को कम करने के लिए भर10। दाना कोशिकाओं के उत्पादन में सहायता करने के लिए, smoothened एगोनिस्ट (प्रसूता) अंतिम परिपक्वता कदम के दौरान इस्तेमाल किया गया था । प्रसूता सोनिक हेज हॉग (श्श्श), जो पहले अनुमस्तिष्क प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था करने के लिए एक कम खर्चीला रासायनिक विकल्प है, vivo1,2 मेंदाना सेल पुरोगामी (GCPs) के विकास को बढ़ावा देने में अपनी भूमिका के कारण है, 11,12,13. भेदभाव उत्पादों अंय 3 डी प्रोटोकॉल से उन लोगों के साथ संगत थे, अनुमस्तिष्क की उपस्थिति-आकृति प्रासंगिक संरचनाओं में संबंधित मार्करों8,9सहित । इस तरह के परिणाम पहले संदेश है कि vivo वातावरण में की विस्तृत नकल जटिल 3d इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक नहीं हो सकता है सुदृढ़ ।

3 डी प्रोटोकॉल के अलावा, इस रिपोर्ट में एक 2d प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, एक ही त्वरित सेटअप, बुनियादी सामग्री के साथ बनाया गया है, और वृद्धि कारकों की संख्या कम है । यह मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESCs) या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs), जल्दी तंत्रिका, अनुमस्तिष्क, और granules सेल पहचान के साथ जुड़े मार्करों के लिए सकारात्मक से कोशिकाओं का उत्पादन करने में सक्षम है । इसके अलावा, कैल्शियम इमेजिंग कार्यात्मक मानव न्यूरॉन्स की उपस्थिति को इंगित करता है. प्रोटोकॉल के बीच चयन करने की क्षमता, शोधकर्ताओं के लिए लचीलेपन का एक स्तर कहते हैं, या तो में रुचि रखने वालों के लिए: (1) विशिष्ट कोशिका प्रकार पैदा करने, (2) मॉडलिंग मानव मस्तिष्क विकास और संबद्ध संरचनाओं, (3) विश्लेषण monolayer में अनुकूलित सेटिंग्स (जैसे, पैच दबाना रिकॉर्डिंग), या (4) सेल-सेल बातचीत मिश्रित तंत्रिका संस्कृतियों में । उनकी सरल और कम लागत प्रकृति उन शोधकर्ताओं के लिए सुलभ बनाता है जो hPSC क्षेत्र के लिए नए हैं, या जरूरत आधार hPSC प्रक्रियाओं से जो आगे भेदभाव विकल्पों का पता लगाने के लिए.

Protocol

1. तैयारी

नोट: सभी चरणों के लिए विशिष्ट आइटमों के लिए सामग्री की तालिका देखें ।

  1. तैयार ५०० एमएल hPSC संस्कृति के लिए hPSC संस्कृति माध्यम परिभाषित
    नोट: चरण 2.1-2.6 के लिए मध्यम का उपयोग करें ।
    1. गल hPSC मध्यम पूरक रात (o/n) 4 डिग्री सेल्सियस पर । मध्यम बोतल से hPSC बेस मीडियम के १२.५ मिलीलीटर को निकालें, फिर 10 मिलीलीटर पूरक और २.५ मिलीलीटर (बनाने १०० U/L) पेनिसिलिन/Streptomycin (पेन/Strep) की बोतल में डालें ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और 2 सप्ताह के भीतर का उपयोग करें ।
      नोट: hPSC माध्यम के लिए 10 µ एम रॉक अवरोध करनेवाला (आरआई) और 10% DMSO जोड़कर नीचे कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. 1 एल तंत्रिका रखरखाव मध्यम (NMM) भेदभाव संस्कृति के लिए तैयार
    नोट: चरण 3.1-4.4 के लिए मध्यम का उपयोग करें ।
    1. मिश्रण glutamine दृढ़ DMEM/F12 और तंत्रिका बुनियादी मध्यम (1:1 अनुपात) एक 1 एल बोतल में, फिर (1x) N2 पूरक के साथ पूरक, (1x) B27 पूरक, 5 µ जी/एमएल इंसुलिन, १.५ मिमी एल-glutamine, १०० µ मीटर गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA), १०० U/L कलम/Strep, और 10 µ मीटर बीटा-mercaptoethanol.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम स्टोर और 3 सप्ताह के भीतर का उपयोग करें ।
      नोट: मिश्रित बेसल माध्यम के लिए पूरक जोड़ने से पहले, स्टॉक सांद्रता के आधार पर जोड़ा घटकों की आवश्यक मात्रा के लिए समायोजित करने के लिए उपयुक्त मात्रा को हटा दें ।
  3. passaging hPSCs के लिए ०.५ mM EDTA वर्किंग सॉल्यूशन की ५०० एमएल तैयार करें
    नोट: चरण २.४ और २.५ के लिए माध्यम का उपयोग करें ।
    1. एक प्रवाह के तहत-डाकू, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए एक ५०० मिलीलीटर बाँझ पंजाबियों बोतल से फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के ४९ मिलीलीटर स्थानांतरण । ५० एमएल ट्यूब के लिए 0.5 मीटर EDTA और ०.९ ग्राम NaCl की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें । मिश्रण धीरे भंग करने के लिए ।
    2. फ़िल्टर-एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर समाधान निष्फल और ५०० मिलीलीटर बाँझ पंजाबियों बोतल को हस्तांतरण । कमरे के तापमान पर स्टोर (आरटी) ।
  4. hPSC कल्चर के लिए hPSC कल्चर प्लेट्स तैयार
    नोट: चरण 2.1-2.6 के लिए प्लेट का उपयोग करें ।
    1. hPSC-उपयुक्त अनुयाई कोटिंग (PAAC) के 50x कार्य समाधान करें: गल 4 ° c पर PAAC o/n की एक शीशी । DMEM/F12 और ४०० µ एल aliquots में १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के रूप में स्थानांतरण के साथ 1:1 अनुपात में PAAC पतला । -८० ° c पर 50x काम समाधान PAAC स्टोर ।
      नोट: (महत्वपूर्ण) PAAC जल्दी से आरटी पर जम, इसलिए यह आवश्यक है कि सभी घटकों (DMEM, ट्यूब, आदि) बर्फ पर रखा (या 4 डिग्री सेल्सियस पर) कर रहे हैं ।
    2. 50x के गल ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान PAAC, तो ठंडा DMEM में 50x पतला/ Add ७५० µ l/अच्छी तरह से पतला PAAC एक 6WP के लिए । ३७ डिग्री सेल्सियस से कम 1 घंटे के लिए थाली मशीन ।
      नोट: 1 h मशीन अवधि के बाद प्लेट लपेटकर PAAC प्लेट्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह के लिए संग्रहित किया जा सकता है । ३७ ° c करने के लिए गर्म थाली से पहले का उपयोग करें ।
  5. भेदभाव संस्कृति के लिए विरोधी चिपकने वाला (ए. ए.) प्लेट्स तैयार
    नोट: चरण 3.1-4.1 के लिए प्लेट का उपयोग करें ।
    1. बनाने 5 मिलीग्राम/एमएल पाली (2-hydroxyethyl methacrylate) (पाली-हेमा) ९५% इथेनॉल में समाधान । एक स्पष्ट समाधान प्राप्त होने तक ३७ ° c पर शेक o/ RT पर स्टोर.
      नोट: एक ०.२२ µm फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टरिंग undissolved पाली-हेमा निकाल सकते हैं ।
    2. पॉली-हेमा को कल्चरल प्लेट में जोड़ें ताकि यह हर कुआं के नीचे कवर हो । 2 दिनों के लिए ३७ ° c पर थाली मशीन, और प्लेट का निरीक्षण करने के लिए तरल की पूरी वाष्पीकरण/कुओं की वर्दी कोटिंग सुनिश्चित करें । ए. ए. प्लेटें लपेटा और आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  6. विभेदक संस्कृति के लिए पॉली-L-Ornithine/Laminin (पीएलओ/लाम) प्लेट्स तैयार करना
    नोट: चरण 4.2-4.4 के लिए प्लेट का उपयोग करें ।
    1. कोट कुओं की सतह क्षेत्र, 20 µ g/एमएल पीएलओ बाँझ पंजाब में भंग का उपयोग कर । ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली ओ/ महाप्राण पीएलओ और 3 बार पंजाबियों के साथ कुल्ला ।
      नोट: (वैकल्पिक) पीएलओ के साथ मशीनी प्लेट लपेटा जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब तक की जरूरत है ।
    2. कोट पीएलओ-लेपित कुओं की सतह क्षेत्रों, 10 µ g/एमएल लाम बाँझ पंजाब में भंग का उपयोग कर । 4 ° c पर ३७ ° c या o/n पर कम से कम 2 ज के लिए मशीन । लाम और वॉश वेल्स 2-3x को पंजाबियों के साथ निकालें, फिर तुरंत उचित माध्यम और/
      नोट: (वैकल्पिक) हटाया गया शास्त्रोक्त समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है और 2 बार तक पुनः उपयोग किया जाता है । (महत्वपूर्ण) लाम-लेपित सतहों को सूखने की अनुमति न दें; इसे रोकने के लिए तुरंत पंजाब या उपयुक्त माध्यम जोड़ें ।
       

2. प्रोटोकॉल 1: फीडर मुक्त hPSC संस्कृति

नोट: hESCs एक गैर वाणिज्यिक संगठन से प्राप्त किए गए थे (रेखा H01, सामग्री की तालिकादेखें) । तीन hiPSC नियंत्रण लाइनों (hvs51, ६०, और ८८) तीन स्वस्थ मानव रोगियों से fibroblasts reprogramming द्वारा उत्पंन किया गया (fibroblasts गुमनाम से व्युत्पंन थे, गैर पहचाने दाताओं और इसलिए आईआरबी अनुमोदन से छूट)10, 17.

  1. फीडर में hPSCs बनाए रखें संस्कृति से मुक्त
    1. गल और hPSC माध्यम में PAAC प्लेटों पर hPSCs चढ़ाना के बाद (२.२ कदम देखें), 5% सह के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर hPSCs बनाए रखें2। ताज़ा hPSC मध्यम दैनिक (२.३ कदम देखें), गल या passaging के बाद दिन छोड़कर, और माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच (उद्देश्य: 2.5 x/0.06, 5x/0.12 Ph0, 10x/0.25 Ph1) विकास दर का निरीक्षण करने के लिए और विभेद के संभावित क्षेत्रों की पहचान (चित्रा 3 , ऊपरी बाएँ पैनल भेदभाव के उदाहरण से पता चलता है).
    2. बीतने hPSCs हर 3-4 दिन, या जब संस्कृति > 80% संगम तक पहुंचता है । अगर कम से 5% कोशिकाओं के भेदभाव का प्रदर्शन, सामांय hPSC passaging विधि का उपयोग करें (२.४ कदम देखें), अंयथा कोमल विधि का उपयोग करें (चरण २.५ देखें) । जब संस्कृति में अब जरूरत है, hPSCs लंबी अवधि के भंडारण के लिए जमे हुए हो सकता है (२.६ कदम देखें) ।
  2. गल hPSCs hPSC मीडियम में
    1. hPSC माध्यम की आवश्यक मात्रा गल प्रक्रिया (9 एमएल/क्रायोजेनिक ट्यूब) के लिए बाँझ ट्यूबों के लिए और तैयार PAAC प्लेट को गल कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए स्थानांतरण । 10 µ एम आरआई के साथ दोनों ट्यूबों में मध्यम पूरक ।
    2. LN2 भंडारण और जगह सीधे एक पानी के स्नान (३७ डिग्री सेल्सियस) में से cryotube पुनः प्राप्त करें । जब केवल एक छोटे से बर्फ क्रिस्टल रहता है, पानी स्नान से हटा दें और गल प्रक्रिया के लिए ट्यूब के लिए क्रायोजेनिक ट्यूब की सामग्री (कुल मात्रा 10 मिलीलीटर) हस्तांतरण । आर टी पर 5 मिनट के लिए २९० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक
    3. PAAC प्लेट के कुएँ से PAAC हल निकालने के लिए एक सीरम पिपेट का प्रयोग करें (स्टेप १.४ देखें) इरादा कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, और 10 hPSC एम री के साथ µ मीडियम जोड़ें.
      नोट: (महत्वपूर्ण) एक सक्शन सुई के साथ PAAC समाधान महाप्राण नहीं है, या यह जमना और वैक्यूम पंप करने के लिए लाइनों को रोकना हो सकता है ।
    4. supernatant को ट्यूब से निकालें और hPSC मीडियम में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें 10 µ मी री के साथ । 6WP के 1 क्रायोजेनिक ट्यूब के अनुपात में गंतव्य प्लेट के लिए कोशिकाओं को वितरित. 5% CO2के साथ ३७ ° c पर मशीन, और 1 दिन के लिए मध्यम ताज़ा नहीं है ।
      नोट: 5% O2 पर कक्ष प्रारंभ करने से सेल की उत्तरजीविता बढ़ सकती है ।
  3. hPSC मीडियम को रिफ्रेश करें
    1. RT पर एक बाँझ ट्यूब में या एक पानी के स्नान में hPSC माध्यम की आवश्यक मात्रा गर्म; 6WP के 2 मिलीलीटर/
      नोट: (वैकल्पिक): hPSC माध्यम की एक अतिरिक्त राशि जोड़कर, hPSCs ताज़ा बिना एक अतिरिक्त दिन रह सकते हैं; हालांकि, यह अधिक से अधिक एक बार एक सप्ताह की अनुमति नहीं है ।
    2. hPSCs युक्त कुओं से मध्यम महाप्राण और ताजे hPSC माध्यम जोड़ें.
    3. संस्कृति ३७ ° c और 5% CO2पर एक मशीन में hPSCs ।
  4. hPSC माध्यम में गद्यांश hPSCs
    1. hPSC मध्यम की आवश्यक मात्रा बाँझ ट्यूबों के लिए स्थानांतरण, passaging प्रक्रिया के लिए और PAAC प्लेट की तैयारी के लिए पारित कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए. 10 µ एम आरआई के साथ गंतव्य प्लेट के लिए मध्यम पूरक । आर टी या एक पानी में स्नान में मध्यम ट्यूबों गर्म ।
      नोट: तैयारी और हैंडलिंग अगर एक वैकल्पिक कोटिंग सामग्री का उपयोग करते हुए एक सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध से अलग होगा ।
    2. PAAC प्लेट के कुएँ से PAAC हल निकालने के लिए एक सीरम पिपेट का प्रयोग करें (स्टेप १.४ देखें) इरादा कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, और 10 hPSC एम री के साथ µ मीडियम जोड़ें.
      नोट: (महत्वपूर्ण) एक चूषण सुई के साथ PAAC समाधान महाप्राण नहीं है, क्योंकि यह जमना और वैक्यूम पंप करने के लिए लाइनों को रोकना हो सकता है ।
    3. hPSCs के साथ कुओं से मध्यम महाप्राण, ०.५ mm EDTA के साथ दो बार कोशिकाओं को धोने, फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए ०.५ mm EDTA और मशीन जोड़ें ।
      नोट: 1 मिलीलीटर/6WP की अच्छी तरह से धोने और गर्मी के लिए EDTA का एक पर्याप्त मात्रा में है ।
    4. माइक्रोस्कोप के तहत कुओं की जाँच करें (उद्देश्य: 2.5 x/0.06, 5x/0.12 Ph0, 10x/0.25 Ph1) । यदि कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू कर रहे हैं, महाप्राण EDTA समाधान और फ्लश कोशिकाओं मुक्त hPSC माध्यम का उपयोग ।
      नोट: (महत्वपूर्ण) जब aspirating EDTA (पूरी कालोनियों को अलग कर रहे हैं जब तक इंतजार नहीं करते) पूरे hPSC कालोनियों को दूर करने के लिए ध्यान रखना । कोशिकाओं को अधिक से अधिक 5 बार फ्लश न करें क्योंकि इससे hPSCs को नुकसान पहुंच सकता है और pluripotency प्रभावित होता है । इसके अलावा, कोशिकाओं को कुओं से फ्लश करने से पहले आरआई के साथ hPSC माध्यम में खड़े होने न दें, क्योंकि वे प्लेट को फिर से पालन कर सकते हैं ।
    5. अनुभवजंय निर्धारण के आधार पर (आमतौर पर संगम से संबंधित, कालोनियों के आकार, और विकास दर), 1:4-1:16 के बंटवारे के अनुपात का उपयोग कर गंतव्य प्लेट के कुओं को hPSCs हस्तांतरण (यानी, 1 अच्छी तरह से मूल प्लेट से गंतव्य के 4 कुओं के लिए प्लेट). 5% CO2के साथ ३७ ° c पर मशीन, और 1 दिन के लिए मध्यम ताज़ा नहीं है ।
      नोट: 1:16-1:20 के रूप में उच्च के रूप में विभाजित अनुपात भीड़ को रोकने और कालोनियों की उपस्थिति में सुधार संभव है ।
  5. गद्यांश hPSCs का प्रयोग भद्र-विधि (G-method)
    1. hPSC मध्यम की आवश्यक मात्रा बाँझ ट्यूबों के लिए स्थानांतरण, passaging प्रक्रिया के लिए और PAAC प्लेट की तैयारी के लिए पारित कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए. 10 µ एम आरआई के साथ गंतव्य प्लेट के लिए मध्यम पूरक । आरटी पर गर्म मध्यम ट्यूबों, या ३७ डिग्री सेल्सियस पर पानी में स्नान ।
    2. PAAC प्लेट के कुओं से PAAC समाधान निकालने के लिए सीरम पिपेट का उपयोग करें (१.४ कदम देखें) कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए इरादा है, और 10 hPSC एम आरआई के साथ µ मध्यम जोड़ें ।
      नोट: (महत्वपूर्ण) एक चूषण सुई के साथ PAAC महाप्राण नहीं है, या यह जमना और वैक्यूम पंप करने के लिए लाइनों को रोकना हो सकता है ।
    3. hPSCs के साथ कुओं से महाप्राण मध्यम, और ०.५ mM EDTA का उपयोग कर दो बार कोशिकाओं को धो लें । दूसरी धोने पर, aspirating EDTA से पहले 30 एस प्रतीक्षा करें, फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4-9 मिनट के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर और मशीन जोड़ें । इंतजार करते हुए, पंजाब के 4 मिलीलीटर के साथ एक बाँझ ट्यूब तैयार करते हैं ।
      नोट: 1 मिलीलीटर/6WP की अच्छी तरह से धोने के लिए EDTA की पर्याप्त मात्रा है ।
    4. माइक्रोस्कोप के तहत कुओं की जाँच करें (उद्देश्य: 2.5 x/0.06, 5x/0.12 Ph0, 10x/0.25 Ph1) । कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू कर रहे हैं, ध्यान से मुक्त कालोनियों में मदद करने के लिए प्लेट के पक्षों को टैप करें । जब > कालोनियों के 50% मुक्त तैर रहे हैं, एक 5 मिलीलीटर सीरम पिपेट 4 मिलीलीटर पंजाबियों (triturate नहीं है) युक्त ट्यूब के लिए 1 मिलीलीटर पंजाब में कालोनियों हस्तांतरण करने के लिए उपयोग करें ।
      नोट: (महत्वपूर्ण) के बाद से उद्देश्य hPSC संस्कृति को साफ करने के लिए है, यह निर्धारित करने के लिए जांच करें कि क्या विभेदित कोशिकाओं थाली से जुड़े रहते हैं. इसके अलावा, यह एक अच्छी तरह से इस प्रक्रिया का उपयोग कर में सभी कालोनियों बीतने के लिए आवश्यक नहीं है, तो कालोनियों कि संलग्न रहने पीछे छोड़ दिया जा सकता है ।
    5. RT पर 5-10 मिनट के लिए ट्यूब में बसने के लिए प्रतीक्षा करें (केंद्रापसारक नहीं है) । पोर्न से महाप्राण पंजाबियों, ख्याल नहीं निकाल रहे बसे hPSCs. ध्यान से hPSC मध्यम में कोशिकाओं reसस्पेंड (triturate नहीं है), और गंतव्य प्लेट 1:4-1:16 के बंटवारे के अनुपात का उपयोग कर कोशिकाओं को हस्तांतरण । 5% CO2के साथ ३७ ° c पर मशीन, और 1 दिन के लिए मध्यम ताज़ा नहीं है ।
  6. hPSCs नीचे फ्रीज
    1. संगम पर निर्भर करता है, hPSCs के 1 कुआं का उपयोग करें, 2-3 दिनों में (अधिकतम) संस्कृति में, LN में भंडारण के लिए 1-2 cryopreservation शीशियों को भरने के लिए2।
    2. passaging (स्टेप २.५) के अंत में ५०० µ l या 1 एमएल के hPSC मीडियम का प्रयोग 1 अच्छी तरह से 6WP के 1 या 2 cryopreservation शीशियों में से कोशिकाओं को ट्रांसफर करने के लिए, क्रमशः (५०० µ l/ प्रत्येक ट्यूब के लिए, 2x ठंड hPSC मध्यम युक्त मध्यम, 20 µ एम आरआई, और 20% DMSO के ५०० µ एल जोड़ें ।
      नोट: (वैकल्पिक) कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर/शीशी में 1x ठंड मध्यम में सीधे हस्तांतरित किया जा सकता है ।
    3. एक क्रायोजेनिक कंटेनर में क्रायोजेनिक ट्यूबों प्लेस (युक्त isopropanol) 4 ° c करने के लिए पूर्व ठंडा, और तुरंत दुकान पर-८० ° c ।
    4. अगले दिन, क्रायोजेनिक ट्यूबों को लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक LN2 टैंक में स्थानांतरित करें ।

3. प्रोटोकॉल 2:3 डी "Organoid" भेदभाव

  1. संशोधित जी के साथ भेदभाव का सेटअप-hPSCs के passaging की विधि
    1. एक बाँझ ट्यूब करने के लिए गंतव्य कुओं की संख्या के लिए NMM की आवश्यक मात्रा स्थानांतरण. 4 एनजी/एमएल FGF2 और 10 µ एम आरआई के साथ पूरक । आर टी पर मध्यम ट्यूब, या ३७ डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में गर्म ।
      नोट: व्युत्पत्ति कुओं के संगम पर निर्भर करता है, hPSCs एक 2:1 या 3:1 अनुपात में गंतव्य थाली के लिए वितरण के दौरान केंद्रित कर रहे है (यानी, मूल थाली से 2 कुओं गंतव्य प्लेट के 1 अच्छी तरह से), २.५ मिलीलीटर की एक अंत मात्रा के साथ/ च्या 6WP.
    2. hPSCs युक्त कुओं से मध्यम महाप्राण, और ०.५ mM EDTA का उपयोग कर दो बार कोशिकाओं को धो लें । दूसरी धोने पर, aspirating EDTA से पहले 30 एस प्रतीक्षा करें, फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4-9 मिनट के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर और मशीन जोड़ें । इंतजार करते हुए, पंजाब के 4 मिलीलीटर के साथ एक बाँझ ट्यूब तैयार करते हैं ।
      नोट: 1 मिलीलीटर/6WP की अच्छी तरह से धोने के लिए EDTA की पर्याप्त मात्रा है । (महत्वपूर्ण) यह hPSCs का उपयोग करने के लिए बेहतर है कि पिछले बीतने के बाद संस्कृति में 3 दिन से अधिक नहीं थे, और कम से 1-2 मार्ग गल के बाद ।
    3. माइक्रोस्कोप के तहत कुओं की जाँच करें (उद्देश्य: 2.5 x/0.06, 5x/0.12 Ph0, 10x/0.25 Ph1) । कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू कर रहे हैं, थाली के किनारों पर कोमल दोहन से कोशिकाओं को मुक्त. कोशिकाओं एक 5 मिलीलीटर पिपेट के साथ 4 मिलीलीटर पंजाबियों युक्त ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
      नोट: (महत्वपूर्ण) लाइट निस्तब्धता और trituration को कालोनियों को तोड़ने और ढीली कोशिकाओं को इकट्ठा करने की अनुमति दी जाती है, लेकिन उन कोशिकाओं पर ध्यान न दें जो प्लेट का पालन करते रहते हैं ।
    4. ट्यूब आरटी पर 10 मिनट के लिए बैठने के लिए, गुरुत्वाकर्षण जुदाई के लिए अनुमति दें । वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को हल्के से केंद्रापसारक (कोई बड़ा RT पर २०० x g, 5 मिनट के लिए) यदि आवश्यक हो ।
    5. महाप्राण ट्यूब से पंजाबियों, ध्यान नहीं हटाने के लिए बसे hPSCs, 4 एनजी/एमएल FGF2 और 10 µ एम आरआई के साथ NMM में कोशिकाओं reसस्पेंड, और फिर ए. ए.-लेपित थाली में एक 2:1 या 3:1 अनुपात में वितरित । 5% CO2के साथ ३७ ° c पर मशीन, और 3 दिनों के लिए मध्यम ताज़ा नहीं है, जब तक आवश्यक (चरण 3.2.1 देखें) ।
      नोट: (वैकल्पिक) कोशिकाओं के हस्तांतरण की सुविधा के लिए, वितरण से पहले गंतव्य प्लेट के कुओं के लिए संस्कृति माध्यम के एक हिस्से को जोड़ने के लिए, और एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं reसस्पेंड. इसके अलावा, hPSCs दाग और सटीक शुरू सेल घनत्व को परिभाषित करने के लिए गिना जा सकता है । हालांकि, गंतव्य प्लेट में अंतिम मात्रा 6WP के २.५ एमएल/अच्छी तरह से होना चाहिए ।
  2. ३७ ° c (5% CO2) पर मुक्त-फ़्लोटिंग भिंनता संस्कृति बनाए रखें
    1. मध्यम रंग में परिवर्तन के लिए हर दिन प्लेटों की जांच, मृत कोशिकाओं के संचय, झुरमुट, और अच्छी तरह से नीचे से पालन ।
      1. वैकल्पिक: मध्यम परिवर्तन अनुसूची की परवाह किए बिना, ताज़ा (कोई ताज़ा के पहले 3 दिनों सहित) मध्यम अगर यह पीले रंग का हो गया है, और मध्यम परिवर्तन के लिए निर्देशों का पालन करें/ कोशिकाओं के बहुमत मृत दिखाई देते हैं, तो गुरुत्वाकर्षण जुदाई के साथ मध्यम परिवर्तन/ताज़ा करने के लिए निर्देशों का पालन करें (चरण ३.४) ।
        नोट: EBs के गठन और बड़े सेल समुच्चय में वृद्धि की उंमीद कर रहे हैं, लेकिन कोशिकाओं और सेल समुच्चय बड़े पैमाने पर एक साथ झुरमुट व्यक्तिगत विकास के कारण नहीं कर सकते है/ यदि यह मनाया जाता है, प्रकाश trituration को तोड़ने के लिए जनता की अनुमति है । यदि कोशिकाओं ए. ए.-प्लेट सतह का पालन करने के लिए शुरू, कुओं की शेष अस्थायी सामग्री नए कुओं को सीधे स्थानांतरित किया जा सकता है, या मध्यम परिवर्तन की प्रक्रिया के दौरान स्थानांतरित/ प्लेट का पालन किया है कि कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए प्रयास नहीं करते ।
    2. 3 दिन पर, माध्यम बदलने के लिए 4 एनजी/एमएल FGF2 के साथ NMM । मीडियम को हर दूसरे दिन रिफ्रेश करें ।
    3. 7 दिन पर, मध्यम बदलने के साथ NMM करने के लिए 1 µ एम Retinoic एसिड (आरए), १०० एनजी/एमएल FGF8B, और 4 एनजी/एमएल FGF2 । मीडियम को हर दूसरे दिन रिफ्रेश करें ।
      नोट: (महत्वपूर्ण) RA हल्का-संवेदी है । प्रकाश से रविंद्र संस्कृति के नमूनों को सुरक्षित रखें ।
    4. 14 दिन पर, १०० एनजी/एमएल FGF8B, १०० एनजी/एमएल FGF4, और 20 एनजी/एमएल FGF2 के साथ NMM करने के लिए मध्यम बदलें । मीडियम को हर दूसरे दिन रिफ्रेश करें ।
    5. 17 दिन पर, १०० एनजी/एमएल FGF8B के साथ NMM के माध्यम बदलने के लिए । मीडियम को हर दूसरे दिन रिफ्रेश करें ।
    6. 21 दिन पर, १०० एनजी/एमएल ब्रेन व्युत्पन्न Neurotrophic फैक्टर (बीडीएनएफ) और 10 एनजी/एमएल Glial व्युत्पन्न Neurotrophic फैक्टर (GDNF) के साथ NMM करने के लिए माध्यम बदल जाते हैं । मीडियम को हर दूसरे दिन रिफ्रेश करें ।
    7. 28 दिवस पर, माध्यम NMM करने के लिए १०० एनजी/एमएल बीडीएनएफ और 10 एनजी/एमएल GDNF, 3 एनजी/एमएल प्रसूता, १०० एनजी/एमएल Neurotrophic फैक्टर 3 (NT3), और 25 मिमी KCl के साथ बदलें । मीडियम को हर दूसरे दिन रिफ्रेश करें ।
    8. दिन ३५ पर, विश्लेषण के लिए 3d organoids लीजिए.
  3. 3 डी संस्कृति के लिए भिंनता मध्यम बदलें/
    1. उपयुक्त घटकों के साथ NMM के आवश्यक वॉल्यूम स्थानांतरित करें (देखें चरण 3.2.2-3.2.7 घटक शेड्यूल के लिए) बाँझ ट्यूब करने के लिए । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान गर्म ।
    2. टिप प्लेट और धीरे हिला जब तक कोशिकाओं कुओं के नीचे किनारों के लिए व्यवस्थित । सावधानी से एक सीरम पिपेट का उपयोग कर पुराने मध्यम के 2 मिलीलीटर निकालें, कोशिकाओं को हटाने से परहेज, फिर ताजा मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें । 5% CO2के साथ ३७ ° c पर मशीन ।
      नोट: (महत्वपूर्ण) अंत खंड 6WP के २.५ मिलीलीटर/ यदि वाष्पीकरण होता है, तो यह आगे कोशिका संस्कृतियों सूख जाएगा के रूप में पुराने माध्यम से 2 मिलीलीटर को दूर नहीं; इसके बजाय, अतिरिक्त माध्यम जोड़ें ।
  4. गुरुत्वाकर्षण पृथक्करण के साथ विभेदक माध्यम बदलें/
    1. एक बाँझ ट्यूब के लिए उपयुक्त घटकों के साथ NMM की आवश्यक मात्रा स्थानांतरण. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान गर्म ।
    2. एक बाँझ ट्यूब करने के लिए कुओं की सामग्री हस्तांतरण, और ट्यूब आरटी पर 10 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति देते हैं, गुरुत्वाकर्षण जुदाई के लिए.
    3. ट्यूब से पुराने माध्यम को दूर करने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें, देखभाल के लिए तय की कोशिकाओं को दूर नहीं, उचित घटकों के साथ NMM में reसस्पेंड, और फिर नए ए. ए. लेपित कुओं को वितरित । 5% CO2के साथ ३७ ° c पर मशीन ।
      नोट: (वैकल्पिक) सुविधा के लिए, संस्कृति माध्यम के एक हिस्से के गंतव्य कुओं में जोड़ा जा सकता है वितरण से पहले, अंतर कोशिकाओं को कम मात्रा में reसस्पैंड के साथ । अंत मात्रा 6WP के २.५ मिलीलीटर/

4. प्रोटोकॉल 3: वैकल्पिक 2 डी विभेद संस्कृति

  1. प्रारंभ करें और 3 डी प्रोटोकॉल के लिए दिन 12 के माध्यम से धारा 3 के अनुसार कदम का उपयोग संस्कृति को बनाए रखने
    1. चरणों का पालन करें 3.1-3.2.3 और परिवर्तन/ताज़ा करने के लिए चरणों के अनुसार ३.३ और ३.४ ।
  2. के लिए स्विच और 2 डी monolayer संस्कृति के रूप में बनाए रखने
    1. विभेद के 13 दिन, परिवर्तन के लिए निर्देशों का पालन करें/ताज़ा करने के लिए गुरुत्वाकर्षण पृथक्करण के साथ मध्यम (चरण ३.४), केवल पीएलओ/लाम लेपित प्लेट करने के लिए कक्षों/समुच्चय वितरित (चरण १.६) २.५ मिलीलीटर/6WP के एक अंत मात्रा के साथ देखें ।
      नोट: माध्यम से पालन और कोशिकाओं के अस्तित्व में मदद करने के लिए प्रारंभिक चढ़ाना के दौरान 10 µ एम आरआई के साथ पूरक हो सकता है । (महत्वपूर्ण) यह समान रूप से कुओं में कोशिकाओं का प्रसार करने के लिए वांछनीय है, कम घनत्व या प्लेटों पर भीड़ से बचने के लिए, और पारित करने के लिए (चरण ४.४ देखें) के रूप में आवश्यक है । पीएलओ/लाम लेपित प्लेटों (जैसे, 6WP, 12WP, आदि) का पसंदीदा आकार, सेल लाइन के लिए प्रसार दर के आधार पर empirically निर्धारित किया जाना चाहिए, और उत्पाद के लिए प्रयोजन । निर्देश 6WP के लिए संस्करणों दे देंगे, और अच्छी तरह से प्रत्येक दोहरीकरण के लिए halving द्वारा परिवर्तित किया जा सकता है (यानी, 6WP के लिए, 2 मिलीलीटर/अच्छी तरह से 12WP के लिए, 1 मिलीलीटर/
    2. 14 दिन पर, १०० एनजी/एमएल FGF8B, १०० एनजी/एमएल FGF4, और 20 एनजी/एमएल FGF2 के साथ NMM करने के लिए मध्यम बदलें । मध्यम हर दूसरे दिन ताज़ा ४.३ चरण में वर्णित के रूप में ।
    3. 17 दिन पर, १०० एनजी/एमएल FGF8B के साथ NMM के माध्यम बदलने के लिए । मध्यम हर दूसरे दिन ताज़ा ४.३ चरण में वर्णित के रूप में ।
    4. 21 दिन पर, १०० एनजी/एमएल बीडीएनएफ और 10 एनजी/एमएल GDNF के साथ NMM के माध्यम बदलने के लिए । मध्यम हर दूसरे दिन ताज़ा ४.३ चरण में वर्णित के रूप में ।
    5. 28 दिवस पर, माध्यम NMM करने के लिए १०० एनजी/एमएल बीडीएनएफ और 10 एनजी/एमएल GDNF, 3 एनजी/एमएल प्रसूता, १०० एनजी/एमएल NT3, और 25 मिमी KCl के साथ बदलें । चरण ४.३ में वर्णित के रूप में प्रत्येक दूसरे दिन मध्यम ताज़ा करें ।
    6. दिन ३५ पर, विश्लेषण के लिए कक्षों को एकत्रित करें, या विस्तारित संस्कृति के लिए चरण 4.2.5 के रूप में एक ही माध्यम में बनाए रखें (संभावित सीमा का परीक्षण नहीं किया गया).
  3. 2d संस्कृति के लिए भेदभाव मध्यम बदलें/
    1. उपयुक्त घटकों के साथ NMM की आवश्यक मात्रा स्थानांतरित करें (देखें चरण 4.2.2-4.2.5 घटक शेड्यूल के लिए) बाँझ ट्यूब करने के लिए । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान गर्म ।
    2. कुओं से मध्यम महाप्राण, फिर २ मिलीलीटर नए माध्यम जोड़ें. 5% CO2के साथ ३७ ° c पर मशीन ।
      नोट: (वैकल्पिक) अंत मात्रा 6WP के २.५ मिलीलीटर/अच्छी तरह से रखा जा सकता है, एक पिपेट का उपयोग कर पुराने मध्यम के 2 मिलीलीटर को दूर करने और ताजा माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ने । कुओं में पुराने माध्यम के एक हिस्से को बचाकर, और वायु संपर्क से कोशिकाओं को रोकने, परिवर्तन चरणों के दौरान कोशिकाओं को सदमे को कम कर सकते हैं ।
  4. गद्यांश 2 डी विभेद संस्कृति
    1. उचित घटकों के साथ NMM की आवश्यक मात्रा हस्तांतरण (देखें कदम 4.2.2-4.2.5 घटक अनुसूची के लिए) बाँझ ट्यूबों के लिए, passaging प्रक्रिया के लिए और, अलग से, पीएलओ/लाम लेपित प्लेट प्राप्त करने के लिए पारित कोशिकाओं को तैयार करने के लिए । 10 µ एम आरआई के साथ गंतव्य प्लेट के माध्यम के पूरक । आर टी पर मध्यम ट्यूबों, या ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान में गर्म । घटकों पर सहेजने के लिए, यह passaging प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को धोने के लिए अकेले NMM का उपयोग करने के लिए संभव है ।
      नोट: (महत्वपूर्ण) यदि उत्पादों कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा, 2-6 दिनों के बीच अंतर के अंत से पहले कोशिकाओं के बीच बीतने के लिए सुनिश्चित करें ।
    2. कुओं से यम महाप्राण. जोड़ें ३०० µ trypsin-आधारित पृथक्करण एजेंट ( सामग्री की तालिकादेखें), भंवर प्लेट कुओं को कवर करने के लिए, तो तुरंत पृथक्करण एजेंट को हटा दें ।
    3. प्लेट आरटी में 2 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति दें, तो प्लेट के किनारों पर दोहन से कोशिकाओं को ढीला । जोड़ें ६०० µ एल/अच्छी तरह से परिभाषित trypsin अवरोध करनेवाला (DTI) और DTI में कोशिकाओं को हस्तांतरण करने के लिए एक बाँझ ट्यूब के साथ 5 मिलीलीटर NMM.
    4. महाप्राण मध्यम पर 15 मिनट के लिए २९० x जी पर ट्यूब केंद्रापसारक और एक और ट्यूब के लिए 5 मिलीलीटर NMM जोड़ें ।
    5. आर टी महाप्राण पर 15 मिनट के लिए २९० x g पर ट्यूब मध्यम और उचित माध्यम से आरआई युक्त में कोशिकाओं reसस्पेंड ।
    6. 1:1-1:12 के बंटवारे के अनुपात का उपयोग कर पीएलओ/लाम प्लेट पर कोशिकाओं को वितरित, प्रारंभिक संगम पर निर्भर करता है, प्रसार दर, और गंतव्य थाली के लिए मूल में आकार विभेदक, और बनाए रखने के साथ ३७ ° c 5% CO2।

Representative Results

कम वृद्धि कारक 2d और 3 डी अनुमस्तिष्क भेदभाव प्रोटोकॉल के दृश्य सिंहावलोकन
चित्रा 1 2d और 3 डी अनुमस्तिष्क भेदभाव प्रोटोकॉल के लिए समग्र समय से पता चलता है, बाह्य कारकों और चढ़ाना के समय की पहचान । 3 डी अनुमस्तिष्क भेदभाव के दौर से गुजर hPSCs के लिए ठेठ प्रगति चित्रा 2में चित्रित किया गया है: hESC लाइन दिन में फीडर मुक्त संस्कृति में कालोनियों के रूप में शुरू H01 0 (ऊपरी चित्रा के बाएं); 2 दिवस (ऊपरी मध्य) द्वारा EB गठन के दौर से गुजर; स्पष्ट लुमेन के साथ बड़ा सेल समुच्चय में बढ़ रहा है आरए और 14 दिन में FGF8 के साथ तंत्रिका प्रेरण निंनलिखित (ऊपरी दाएं); 28 दिन में अलग आकार और आकार के समुच्चय के गठन (कम बाएं); एक ही कुल के विभिंन संरचनाओं के साथ जटिलता में विकसित 28 दिन में संकेत (निंन मध्य); और ३५ दिन में ही संरचनाओं के लिए जारी रूपात्मक परिवर्तन के साथ (कम सही) । 2 डी अनुमस्तिष्क भेदभाव के दौर से गुजर hPSCs के लिए ठेठ प्रगति चित्रा 3में दर्शाया गया है: फीडर में कालोनियों के रूप में hESC लाइन H01-दिन 0 पर मुक्त संस्कृति (चित्रा के ऊपरी बाएं, चक्र के साथ hESC कालोनियों के बीच विभेदित कोशिकाओं के क्षेत्र का संकेत) ; 2 दिवस (ऊपरी मध्य) द्वारा EB गठन के दौर से गुजर; स्पष्ट लुमेन के साथ बड़ा सेल समुच्चय में बढ़ रहा है आरए और 13 दिन में FGF8 के साथ तंत्रिका प्रेरण निंनलिखित (ऊपरी दाएं); 14 दिन में चढ़ाना के बाद अनुयाई कोशिकाओं के रूप में proliferating (कम बाएं); और फिर कम (निचले मध्य) और उच्च आवर्धन के तहत दिन ३५ पर अधिक जटिल/परिपक्व आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं के एक monolayer के रूप में (कम सही) ।

3 डी उत्पादों को प्रदर्शित मार्करों और जल्दी Neuroepithelium की संरचनाओं
चित्र 2 (निचली बाईं छवि) और चित्रा 4 , विकास और/या परिपक्वता दरों, साथ ही stochastic विलय या समुच्चय के अलावा तोड़ने के कारण, संवर्धन भर में देखा 3d समग्र आकृति विज्ञान के विविधता दिखा । विविधता के बावजूद, प्रत्येक भिंनता अनुमस्तिष्क granules मार्कर ZIC1 सहित जल्दी तंत्रिका और ंयूरॉंस मार्करों, प्रदर्शन समुच्चय का उत्पादन, के रूप में immunocytochemistry द्वारा संकेत (आईसीसी) चित्रा 5में धुंधला । इससे भी महत्वपूर्ण बात, चित्रा 5 और चित्रा 6 सुझाव है कि एक सरल 3 डी संस्कृति, कम वृद्धि कारकों के साथ, जैसे जल्दी neuroepithelium और rhombic होंठ के रूप में मस्तिष्क विकास से संबंधित जटिल संरचनाओं के साथ समुच्चय पैदा करने में सक्षम है ।

2d उत्पादों प्रदर्शन अनुमस्तिष्क मार्करों और कार्यात्मक ंयूरॉंस गतिविधि
जबकि 2 डी संस्कृतियों जटिल 3 डी संरचनाओं प्रतिलिपि नहीं कर सकते, वे अनुमस्तिष्क granules सेल मार्कर ZIC1 सहित जल्दी तंत्रिका और ंयूरॉंस मार्करों का प्रदर्शन कोशिकाओं पैदा करने में सक्षम हैं, के रूप में आईसीसी द्वारा संकेत आंकड़ा 7में धुंधला । आर टी-पीसीआर के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, के रूप में चित्रा 8में देखा, आईसीसी धुंधला परिणाम का समर्थन करता है, हालांकि जल्दी दाना सेल मार्कर ATOH1 की उपस्थिति प्रयोगों और लाइनों के बीच चर रहा है । कैल्शियम इमेजिंग और अधिक आसानी से 2d संस्कृति में संभाला है । के रूप में चित्रा 9, पूरक वीडियो 1में देखा, और पूरक वीडियो 2, विद्युत उत्तेजित कोशिकाओं कैल्शियम आमद कि न्यूरॉन फायरिंग पैटर्न की विशिष्ट हैं दिखाने के लिए, कार्यात्मक न्यूरॉन्स की पीढ़ी का सुझाव.

Figure 1
चित्रा 1: भेदभाव प्रोटोकॉल की समयरेखा (भेदभाव के 0 दिन में शुरू) । ठोस लाइन बक्से संकेत जब विशिष्ट कारकों संस्कृति माध्यम में जोड़ रहे हैं, और बिंदीदार रेखा बक्से वैकल्पिक 2d संशोधन के लिए थाली कोटिंग संकेत मिलता है । FGF2 के लिए, नीचे तीर कम सांद्रता को संदर्भित करता है (4 एनजी/एमएल), और ऊपर तीर उच्च सांद्रता को संदर्भित करता है (20 एनजी/ यह आंकड़ा होम्स और Heine10से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2:3 डी प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि brightfield छवियों. d0 में hESC कालोनियां, d2 पर EBs, d14 में प्रेरण के बाद समुच्चय, d28 में विभिंन आकार और आकृति विज्ञान (गिने 1-5) के समुच्चय, अद्वितीय, पहचाने जाने योग्य सुविधाओं के साथ एक समग्र (अक्षर से संकेत मिलता है -c) d28 पर, और d35 पर एक ही सुविधाओं में दिखाई परिवर्तन । स्केल बार = १०० µm । यह आंकड़ा होम्स और Heine10से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि brightfield 2d प्रोटोकॉल की छवियां । hESC एक d0, d13 में प्रेरण के बाद d2 पर EBs, समुच्चय, d14 में समुच्चय के बाद, d35 पर परिपक्वता के बाद के रूप में 5x आवर्धन पर देखा, और 20x इज़ाफ़ा । ऊपरी बाएँ पैनल में सफेद चक्र hESC कालोनियों के बीच विभेदित कोशिकाओं के क्षेत्र से पता चलता है. स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4:3 डी संस्कृति में अलग आकार और जटिलता दिखा Brightfield छवियों. समुच्चय पर (A) 8 दिन (hESCs), और (B) d35 (hiPSCs) । उत्तरार्द्ध छवि तीन अलग छवियों से बना है करने के लिए पूरे समग्र दिखाओ । दोनों समुच्चय संरचनाओं के छोटे समुच्चय या हानि (बंद तोड़ने) के विलय से प्रभावित हो सकता है । स्केल बार = २०० µm । यह आंकड़ा होंस और Heine10से पुनर्प्रकाशित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5:3 डी उत्पादों के आईसीसी छवियों प्रासंगिक मार्करों और संरचनाओं दिखाएँ. संस्कृति d35 पर, 3 डी उत्पादों का प्रदर्शन: PAX6 (हरा) और TBR2 (लाल) लुमेन द्वारा तंत्रिका rosette की तरह गठन (पहली पंक्ति); DCX (हरा) और NeuN (लाल) बाहरी किनारे वेंट्रिकुलर जोन (VZ) से फैल-संरचना (दूसरी पंक्ति) की तरह; KIRREL2, अनुमस्तिष्क neuroepithelium (तीसरी पंक्ति, बाएं) के साथ जुड़े मार्कर; और अनुमस्तिष्क granules कोशिकाओं (तीसरी पंक्ति, सही) के साथ जुड़े मार्कर ZIC1 । प्रयोग कई बार चार अलग hPSC लाइनों का उपयोग किया गया: hESC लाइन H01 (एन = 5), और iPSC लाइनों hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), और hvs51 (n = 1) । तीर Rhombic होंठ (आर एल)-संरचना की तरह बात करते हैं । स्केल बार = १०० µm । यह आंकड़ा होंस और Heine10से पुनर्प्रकाशित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6:3 डी उत्पाद में बड़े पैमाने वेंट्रिकुलर क्षेत्र की तरह संरचना. संस्कृति d35 में, एक hESC-व्युत्पंन कुल PAX6 (हरी) और TBR2 (लाल) सामांयतः वेंट्रिकुलर क्षेत्रों (VZs) और subventricular क्षेत्रों (SVZs), vivo मेंके भीतर पाया जल्दी ंयूरॉंस के साथ जुड़े के लिए सकारात्मक है । शीर्ष) एक तारांकन चिह्न (*) शिखर की ओर एक VZ-like क्षेत्र, VZ/SVZs के गहराई/विभाजन का संकेत कोष्ठक के साथ कुल की बढ़त के साथ चल रहे चिह्नित करता है । (मध्य) विलय संकेत PAX6 के बिखरे हुए वर्गों दिखा +/TBR2-ऊपरी दाएँ छोर की ओर आकार में वृद्धि कोशिकाओं VZ की । नीचे) मध्य पैनल में आयत द्वारा दर्शाई गई अनुभाग की उच्च आवर्धन छवि । स्केल बार = १०० µm । यह आंकड़ा होम्स और Heine10से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7:2 डी उत्पादों की आईसीसी छवियों प्रासंगिक मार्करों दिखाएँ. संस्कृति d35 पर, 2d उत्पादों का प्रदर्शन, hESCs से (शीर्ष पंक्ति) और hiPSCs (नीचे पंक्ति), के लिए सकारात्मक कोशिकाओं: granules सेल मार्कर ZIC1 और प्रवासी अनुमस्तिष्क ंयूरॉन मार्कर TAG1 (बाएं कॉलम); और ंयूरॉंस मार्कर neurofilament (NF) और TAG1 (दायां कॉलम) । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: RT-2d उत्पादों की पीसीआर. mRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण hESC लाइन H01 (शीर्ष पंक्ति) और hiPSC लाइन hvs60 (नीचे पंक्ति) 2d प्रोटोकॉल के अंत में के लिए जेल ट्रो के साथ उत्पादों से पता चलता है: granules सेल मार्कर ZIC1, दाना सेल मार्कर ATOH1, प्रवासी अनुमस्तिष्क ंयूरॉन मार्कर TAG1, Purkinje सेल मार्कर Calbindin (CALB), वोल्टेज पर निर्भर कैल्शियम चैनल CACNA1A (सी-1a), CACNA1E (सी-1E), गामा-aminobutyric एसिड (गाबा) बी रिसेप्टर 1 (जी-Br1), और गृह व्यवस्था जीन EIF4G2).

Figure 9
चित्र 9:2 डी उत्पादों का कैल्शियम इमेजिंग/ संस्कृति d35 में, hPSC भिंनता उत्पादों 2 मिनट के लिए माइक्रोस्कोप के तहत दर्ज किए गए, fluor5 डाई के साथ गर्मी के बाद । 30 एस में, कोशिकाओं को बिजली 10 हर्ट्ज पर एस के लिए प्रेरित किया गया । (क) अभी भी छवियां 0 एस में hESCs (बाएं) और 30 एस (दाएं) में विद्युत उत्तेजना के शुरू होने के बाद दिखाओ । तीर कैल्शियम की आमद के विश्लेषण के लिए ब्याज के क्षेत्र (ROI) का संकेत देते हैं. (ख) चित्रमय प्रतिदीप्ति रॉय के लिए समय बनाम सापेक्ष में परिवर्तन दिखा विश्लेषण (प्रतिदीप्ति में परिवर्तन = (f-f0)0, जहां f0 = (∑ f1-n)/n), ंयूरॉन के साथ पहले होने वाली spikes की तरह, के दौरान, और उसके बाद उत्तेजना. काली पट्टी विद्युत उत्तेजना की लंबाई को इंगित करता है । स्केल बार (white) = ५० µm. hESC के लिए पूर्ण रिकॉर्डिंग (के रूप में यहां देखा) और एक hiPSC लाइन (नहीं दिखाया गया है) में उपलब्ध है अनुपूरक वीडियो 1 और अनुपूरक वीडियो 2, क्रमशः । रिकॉर्डिंग AVI प्रारूप में हैं, 4x गति पर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक वीडियो 1: hESC लाइन H01 से 2 डी उत्पाद की कैल्शियम इमेजिंग वीडियो । संस्कृति d35 में, hESC लाइन H01 से भेदभाव उत्पादों fluor5 डाई के साथ मशीन के बाद माइक्रोस्कोप के तहत 2 मिनट के लिए दर्ज किए गए थे । 30 एस में, कोशिकाओं को बिजली 10 हर्ट्ज पर एस के लिए प्रेरित किया गया । रिकॉर्डिंग 2 तख्ते पर किए गए थे/s, और पर AVI वीडियो में संसाधित ~ 7 फ़्रेम/s, एक स्थाई वीडियो का निर्माण ~ 30 s, पर ~ 4x गति । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

पूरक वीडियो 2: hiPSC लाइन hvs51 से 2 डी उत्पाद के कैल्शियम इमेजिंग वीडियो. संस्कृति d35 में, hiPSC लाइन hvs51 से भेदभाव उत्पादों fluor5 डाई के साथ मशीन के बाद माइक्रोस्कोप के तहत 2 मिनट के लिए दर्ज किए गए थे । 30 एस में, कोशिकाओं को बिजली 10 हर्ट्ज पर एस के लिए प्रेरित किया गया । रिकॉर्डिंग 2 तख्ते पर किए गए थे/s, और पर AVI वीडियो में संसाधित ~ 7 फ़्रेम/s, एक स्थाई वीडियो का निर्माण ~ 30 s, पर ~ 4x गति । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

जटिलता और लागत स्टेम सेल शोधकर्ताओं के लिए प्रासंगिक कारक है जब चुनने या भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित कर रहे हैं । यह विशेष रूप से सच है क्योंकि यह कितना बाह्य नियंत्रण के लिए वांछित सेल प्रकार उत्पंन करने की आवश्यकता है की एक खुला सवाल है, या-यह अलग मुद्रा-कैसे सक्षम hPSCs अपने विकास के वातावरण का निर्माण कर रहे हैं, अगर पर्याप्त के साथ खुद को छोड़ दिया पोषक. इन विट्रो में बाह्य कारकों का परिचय बहुत अच्छी तरह से वांछित सेल उत्पादों का उत्पादन हो सकता है, लेकिन वे भी vivo मेंप्रदर्शन किया होता आंतरिक विकास क्षमताओं कोशिकाओं के साथ हस्तक्षेप कर सकता है. इस तरह के विचार महत्वपूर्ण हैं, विशेष रूप से यदि लक्ष्य रोगी की बीमारी मॉडलिंग के लिए व्युत्पंन iPSCs का उपयोग है । पैटर्न और/या विकास कारकों का व्यापक उपयोग रोग phenotypes मुखौटा सकता है । इस रिपोर्ट में विस्तृत प्रोटोकॉल पिछले अध्ययनों की प्रवृत्ति का पालन करने के लिए जटिलता को कम करने, लागत, और/या बाह्य patterning कारकों में से8,9का उपयोग करें ।

परिणाम Muguruma एट अल द्वारा रिपोर्ट के आधार पर, और हमारे अपने हाल के अध्ययन, ऐसा लगता है कि यह है कि यह संभव है कि vivo स्थिति में पुन: पेश करने के लिए प्रयत्न के बिना अनुमस्तिष्क भाग्य के प्रति भेदभाव को प्राप्त करने के रूप में पहले अध्ययन किया है 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. पेचीदा हिस्सा है कि दो अध्ययनों के विकास कारकों के विभिंन सेट करते थे, सुझाव है कि न तो सेट आवश्यक थे, हालांकि दोनों FGF2 इस्तेमाल किया । हम अतिरिक्त परीक्षण, जहां FGFs चुनिंदा प्रोटोकॉल से बाहर रखा गया, और पता चला कि कोशिकाओं को बाह्य FGFs10के बिना एक ही उत्पाद पैदा करने में सक्षम थे. हमारे अध्ययन के बीच मतभेद तथ्य यह है कि हम अलग hPSC लाइनों और संस्कृति के तरीकों, आरए के साथ तंत्रिका भेदभाव प्रेरित करते थे द्वारा योग्य थे, और granules सेल अस्तित्व और परिपक्वता का समर्थन करने के लिए घटक शामिल (बीडीएनएफ, GDNF, प्रसूता, और KCL)11 -14. इसके अलावा, एक कम जटिल स्टार्टअप विधि, Muguruma एट अलकी तुलना में, कार्यरत था । 96WPs में यूनिफॉर्म EBs पैदा करने से उनका प्रोटोकॉल शुरू हुआ, जो उन्हें शारीरिक और रासायनिक रूप से एक-दूसरे से अलग करते हैं । यहां प्रोटोकॉल सभी पीएससी अपेक्षाकृत 6WPs में एक साथ EB गठन के दौरान भीड़ थी, जो उंहें स्वतंत्र रूप से बातचीत करने की अनुमति दी । यह कैसे अंतर हो सकता है EBs के भौतिक और रासायनिक पर्यावरण और बाद में organoids (संकेतन यौगिकों के आंतरिक उत्पादन सहित), अज्ञात है और पता लगाया जा सकता है प्रभावित । इसके अलावा, जब हम के साथ जुड़े जीन की अभिव्यक्ति दिखाने-और इतना विचारोत्तेजक-अनुमस्तिष्क मूल, संरचनाओं के भीतर स्थित Muguruma एट अलद्वारा रिपोर्ट उन लोगों के समान आकृति., हम उत्पादन के बाहर नहीं कर सकते है ंयूरॉंस की तरह संरचनाओं कि गैर-अनुमस्तिष्क पहचान के हैं. भविष्य के अध्ययन, Muguruma एट अल द्वारा सूचना दी उन जैसे एंटीबॉडी के एक बड़े पैनल का उपयोग कर । (यानी, ATOH1, CALB, आदि) ऐसे कार्य करना होगा, और दोनों प्रोटोकॉल के उत्पादों के बीच तुलना, और अधिक निर्णायक ।

3 डी प्रोटोकॉल के भीतर, यह महत्वपूर्ण है के साथ शुरू करने और संस्कृति में कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या को बनाए रखने के लिए विश्लेषण के लिए अंत उत्पादों की पर्याप्त संख्या सुनिश्चित करते हैं । महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल में जल्दी मर बंद दिया, हम अनुशंसा करते है अधिक से अधिक के साथ शुरू ५०० EBs/अच्छी तरह से संस्कृति में पहले 3 दिनों के दौरान (चित्र 1) । इस फीडर में hPSCs के लिए दिया कॉलोनी आकार मुक्त संस्कृति को प्राप्त करने के लिए मुश्किल नहीं होना चाहिए, लेकिन अभी भी फीडर पर निर्भर तरीकों का उपयोग कर के लिए के रूप में आसान नहीं हो सकता है । कोशिकाओं की बड़ी संख्या को देखते हुए, यह माध्यम में रंग बदलने के लिए देखना महत्वपूर्ण है (पीएच परिवर्तन का संकेत), और मृत कोशिकाओं के संचय । दोनों को संस्कृति के पतन को रोकने के लिए सही किया जाना चाहिए । वहां भी बड़े पैमाने पर संरचनाओं में कोशिकाओं और समुच्चय का झुरमुट हो सकता है । हालांकि यह अभी भी समुच्चय है कि विश्लेषण किया जा सकता है में परिणाम हो सकता है, उत्पाद मात्रा बहुत कम हो जाएगा, तो उंहें कोमल trituration के साथ छोटे समुच्चय में टूट उपयोगी हो सकता है । हालांकि, सामांय समुच्चय है, जो खुद को बड़े आकार (चित्रा 4) को विकसित कर सकते है परेशान से बचें । यदि समुच्चय भी विरल बन जाता है, तो कुओं को संयोजित करने की सिफारिश की जाती है ताकि समुच्चय पूरी तरह से अलग न हो । उत्पाद परिवर्तनशीलता (संख्या, आकार और आकृति विज्ञान) में 3d कक्ष संस्कृति में एक प्रसिद्ध समस्या है, जिसमें उन प्रोटोकॉल को पृथक, समरूप EB गठन चरणों के साथ प्रारंभ करने के लिए शामिल किया गया है, सुझाव देते हुए कि कम जटिल स्टार्टअप प्रक्रिया (जैसे यहां वर्णित प्रोटोकॉल ) और अधिक व्यावहारिक हो सकता है8,15। हालांकि इस विविधता कुछ शोधकर्ताओं को ध्यान में रखने की जरूरत है, विशेष रूप से विश्लेषण के दौरान, रिपोर्ट प्रोटोकॉल अंय 3 डी प्रोटोकॉल8,9,15में पाया उन लोगों के साथ सुसंगत उत्पादों उत्पंन । आकार और आकृति विज्ञान के आधार पर, वे मस्तिष्क organoid को तंत्रिका rosette की सीमा के भीतर गिर, के रूप में Kelava और Lancaster15द्वारा हाल ही में एक समीक्षा में वर्णित है, सबसे फिटिंग अंडाकार के वर्गीकरण के साथ । विशेष रूप से उल्लेखनीय है, 3d संरचनाओं लुमेन के साथ तंत्रिका rosettes के विचारोत्तेजक, (उप) वेंट्रिकुलर क्षेत्रों की उपस्थिति रहे हैं, और rhombic-सुविधाओं की तरह होंठ (चित्रा 5 और चित्रा 6) के रूप में अंय समूहों द्वारा की पहचान8 , 15 , 16 , 17. के बाद से हर प्रयोग ख्यात VZ/SVZs और अनुमस्तिष्क-संबद्ध मार्करों (ZIC1, KIRREL2), उन एक 3 डी के साथ हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग कर भेदभाव की सफलता का निर्धारण करने के लिए उपयोगी मानदंड है के साथ कम से एक समग्र का उत्पादन किया आरएल की तरह अतिरिक्त सहायता प्रदान करने वाली सुविधाएँ. संस्कृति की लंबाई का विस्तार पिछले ३५ दिनों का परीक्षण नहीं किया गया था, लेकिन विकास, जटिलता की अधिकतम सीमा निर्धारित करने के लिए पीछा किया जा सकता है, और परिपक्वता इस तकनीक से अनुमति दी ।

2d प्रोटोकॉल एक ही गैर अनुयाई EB गठन और 3 डी प्रोटोकॉल के रूप में तंत्रिका प्रेरण प्रक्रिया का उपयोग करता है और इसलिए ऊपर टिप्पणी भी लागू होते हैं । एक बार चढ़ाया, विचार का एक अलग सेट पर विचार किया जाना चाहिए । EBs कोशिकाओं के लिए जल्दी से पालन करना चाहिए प्लेट पर जावक पैदा । यदि पालन के साथ समस्या है, आरआई के अलावा (यदि पहले से ही इस्तेमाल नहीं), मध्यम, या पीएलओ/लाम एकाग्रता में प्रयोगात्मक परिवर्तन की कम मात्रा लागू किया जा सकता है । यह भी घने या विरल बढ़ रही से कोशिकाओं को रखने के लिए महत्वपूर्ण है (अधिमानतः 20-80% के बीच उगाया) कुओं में प्रवाह; दैनिक निगरानी और समय पर passaging, अधिक प्रभावित या अस्थायी कोशिकाओं से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । 3 डी प्रोटोकॉल के विपरीत, वहां महत्वपूर्ण नहीं होना चाहिए मर संस्कृति के दौरान बंद है, हालांकि गरीब विकास, या प्रसार दर की एक धीमा के क्षेत्रों में हो सकता है । Passaging कोशिकाओं की परिपक्वता स्थिति को प्रभावित करता है (उदाहरण के लिए, सेल प्रक्रियाओं को हटाने और कोशिकाओं के बीच विकसित नेटवर्क) और अंक जहां कोशिकाओं को एकत्र किया जाएगा या किसी तरह से विश्लेषण आ जब मन में रखा जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, कैल्शियम इमेजिंग के लिए यह विश्लेषण करने से पहले 2-6 दिनों के बीच कोशिकाओं बीतने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । Passaging भी विश्लेषण करने के लिए बंद मतलब हो सकता है कोशिकाओं को कनेक्ट करने के लिए समय नहीं था और/या परिपक्व, और बहुत दूर कोशिकाओं में भीड़ परिणाम हो सकता है, इमेजिंग मुश्किल बना । हालांकि प्रयोगों के बीच परिवर्तनशीलता मौजूद हो सकता है, परिणाम प्रारंभिक 2d अनुमस्तिष्क प्रोटोकॉल1,2में रिपोर्ट उन लोगों के साथ संगत कर रहे हैं । आईसीसी धुंधला और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण पुष्टि दाना सेल मार्कर ZIC1 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की उपस्थिति, जबकि भी अन्य तंत्रिका और अनुमस्तिष्क पहचान के साथ जुड़े मार्करों की पहचान (चित्रा 7 और चित्रा 8). कैल्शियम इमेजिंग, जो fluor5 डाई के साथ मशीन की कोशिकाओं की बिजली की उत्तेजना शामिल है, संकेत कार्यात्मक ंयूरॉन गतिविधि (चित्रा 9, पूरक चित्रा 1, और पूरक चित्रा 2), हालांकि यह पुष्टि नहीं है अगर इन granules कोशिकाओं थे । यह यकीनन है कि कोशिकाओं को और अधिक समय देने के द्वारा परिपक्व संस्कृति की लंबाई का विस्तार पिछले ३५ दिन, कार्यात्मक न्यूरॉन गतिविधि की मात्रा में वृद्धि करनी चाहिए. भविष्य में इस क्षमता का पता लगाया जा सके ।

अनुसंधान की तर्ज के अलावा ऊपर का सुझाव दिया, यह ब्याज की होगी के लिए उत्पाद पहचान में अंतर निर्धारित (मात्रा और गुणवत्ता) 2d और 3 डी प्रोटोकॉल के बीच । बाह्य FGFs के महत्व 2 डी प्रोटोकॉल में परीक्षण नहीं किया गया था, और यह चढ़ाना के बाद 3 डी संरचना की कमी है, और इसलिए जुड़े संकेतन रास्ते, उन जल्दी पैटर्निंग यौगिकों पर 2 डी संस्कृतियों अधिक या कम निर्भर करना होगा पता करने के लिए उपयोगी होगा । और अधिक छीन-नीचे प्रोटोकॉल (जैसे, कोई आरए, बीडीएनएफ, प्रसूता) आगे की जांच के लिए समान रूप से प्रशंसनीय लाइनें हैं । अंत में, भविष्य के अध्ययन के नए अनुसंधान उपकरण से बेहतर विशेषताएं (और उत्पादन की क्षमता का आकलन) मानव-विशिष्ट अनुमस्तिष्क ंयूरॉंस उपप्रकार का लाभ हो सकता है ।

मन में दिया निरंतर के साथ, दोनों की रिपोर्ट प्रोटोकॉल अनुमस्तिष्क भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विभिंन प्रयोजनों के लिए अनुकूल उत्पादों के साथ । वे प्रायोगिक अध्ययन का संचालन शोधकर्ताओं के लिए व्यावहारिक प्रारंभिक अंक के रूप में सेवा कर सकते हैं, ऐसे भेदभाव के लिए सेल लाइनों की व्यवहार्यता परीक्षण, या लक्षित तंत्रिका भेदभाव के अंय प्रकार के लिए एक बुनियादी मॉडल के रूप में ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Gerbren याकूब और Jurjen Broeke के लिए उनके विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं, Prisca Leferink पीढ़ी और दो नियंत्रण iPSC लाइनों के लक्षण वर्णन करने के लिए, और हमारी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए लिसा Gasparotto के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12+Glutamax Gibco 31331-028 glutamine fortified DMEM/F12
Neurobasal medium Gibco 21103-049 neural basic medium
N2 supplement Gibco 17502-048
B27 supplement Gibco 17504001
Insulin Imgen PT468-B
L-glutamine Gibco 25030-024
Non-essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
beta-mercaptoethanol Gibco 21985-023
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma P3932 aka Poly-Hema
Laminin Sigma L2020
E8 medium and supplement Gibco A1517001 hPSC medium and supplement
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Sodium Chloride Sigma S-5886
y-27632 (ROCK inhibitor) SelleckChem S1049-10mg
DMSO Sigma D-2650
Geltrex Gibco A1413302 hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)
0,5M EDTA Gibco 15575-020
0.2 um filter VWR 28145-77
1.5 mL Eppendorf tube VWR 525-0130
DMEM/F12 Gibco 21331-020
Ethanol VWR 83804360
Parafilm Sigma PM996 wrap for culture plates
cryotubes ThermoFisher 368632
TrypLE Gibco 12563-029 trypsin-based dissociation agent
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) Gibco R-007-100
FGF-2 Peprotech 100-18B
FGF-4 R&D Systems 100-31
FGF-8B Peprotech 100-25
Retinoic Acid Sigma R2625
Brain Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-02
Glial Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-10
Potassium Chloride Sigma P5405
Neurotrophic Factor 3 Peprotech 450-03
Smoothened Agonist (SAG) Cayman 11914 CAS 912545-86-9
Axiovert 40C microscope Zeiss Brightfield imaging microscope
Axiocam Zeiss Brightfield imaging - image aquisition
Eppendorf Centrifuge 5810 Eppendorf 521-0996 centrifuge for cell culture
PBS (gebufferde natrium oplossing) Braun Medical 3623140
5 ml Serological pipets VWR 612-4950
10 ml Serological pipets VWR 612-4951
6-wells culture plates VWR 734-2323
12-wells culture plates VWR 734-2324
hESCs WiCELL line H01

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३० 3d organoid pluripotent स्टेम सेल सेरिबैलम दाना सेल प्रांतस्था
वैकल्पिक 2d संशोधन के साथ सुव्यवस्थित 3 डी अनुमस्तिष्क भेदभाव प्रोटोकॉल
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Holmes, D. B., Heine, V. M.… More

Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification. J. Vis. Exp. (130), e56888, doi:10.3791/56888 (2017).

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