Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Strømlinjeformet 3D lillehjernen differensiering protokoll med valgfri 2D modifikasjon

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/56888
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics/Child Neurology, Amsterdam Neuroscience, VU University Medical Center, 2Department of Complex Trait Genetics, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

Summary

Vi beskriver en forenklet 3D differensiering protokoll for hPSCs, bruker definert medium og redusert vekst faktorer, generere celle aggregat med tidlig neuroepithelial strukturer og positivt for lillehjernen-assosiert markører, samt en valgfri 2D modifisering for å skille celler som en monolayer til å generere functional nerveceller.

Abstract

Redusere kompleksiteten og kostnaden av differensiering protokoller er viktig for forskerne. Denne interessen passer med bekymringer om mulige utilsiktede virkninger som ytre mønstre faktorer kan introdusere i menneskelig pluripotent stilk cellen (hPSC) modeller av hjernens utvikling eller patofysiologi, for eksempel maskering sykdom fenotypen. Her presenterer vi to lillehjernen differensiering protokoller for hPSCs, designet med enklere oppstartsmetoden, færre mønstre faktorer, og mindre materielle krav enn tidligere protokoller. Nylig har utviklet vi kultur prosedyrer, som genererer frittflytende 3-dimensjonale (3D) produkter samsvar med andre hjernen "organoid" protokoller, inkludert morphologies gjelder modellering hjernens utvikling som sub/ventrikkel sone- og rhombic leppe-lignende strukturer. Andre bruker en tilhenger, 2D monolayer prosedyre å fullstendig differensiering, som vises i stand til å generere funksjonelle lillehjernen neurons, som er positivt for lillehjernen-assosiert markører, og viser Nevron som kalsium influxes. Sammen tilbyr disse protokollene forskere et utvalg av muligheter egnet til forskjellige forskningsformål, samt en grunnleggende modell for å teste andre typer strømlinjeformet nevrale atskillinger.

Introduction

In vitro protokoller for å skille hPSCs mot lillehjernen linjene først drives på prinsippet om mimicking i vivo lillehjernen utvikling1,2,3,4. Som sådan, krevde de en rekke faktorer introdusert til bestemte tider kjøre pro-lillehjernen mønstre og modning. Chief blant disse var WNT, bein Morfogenetiske proteiner (BMP), og fibroblast vekstfaktorer (FGFs) med kjente roller i midten av hindbrain utvikling og dannelsen av isthmic organizer5,6,7. Selvfølgelig hver ekstra trinn og faktor betyr en økning i arbeidskrevende manipulasjoner og større regning for forskeren, og så utvikling enklere oppnå like resultater er av interesse. Dette praktiske problemet føyer seg sammen pent med den hypotetiske spørsmålet, om cellene trenger slike stramt, ekstern kontroll over deres utvikling i vitro.

For lillehjernen differensiering adressert en protokoll publisert i 2015 bruk av et omfattende antall vekstfaktorer med bare FGF2, FGF19 og stromal cell-derived faktor 1 (SDF1) for mønstre formål8. Denne studien også skilte seg fra tidligere lillehjernen protokoller, ved hjelp av en frittflytende 3D kultur-systemet. I tillegg produserer celler positivt for lillehjernen markører, ble hjernen "organoids" generert av deres teknikk vist å vise relevante morfologi, utilgjengelig i tradisjonelle 2D monolayer kulturer, som rhombic leppe-lignende strukturer. Selv om mindre kompliserte og kostbare forhold til vekstfaktorer, andre funksjoner som dannelsen av uniform embryoid organer (EBs) og kultur i 96-brønnen plater (96WPs), du gjorde det Prosedyremessig komplekse under innledende skritt. En annen 3D protokoll utgitt samme år, rapporterte vellykkede differensiering å nevrale linjene med felles og rimelig celle kultur teknikker9. Selv om denne gruppen ble undersøkt kortikale enn lillehjernen differensiering, kunne anvendelse av sitt konsept for lillehjernen differensiering ikke bli nedsatte.

Vi har nylig rapportert en 3D lillehjernen differensiering protokoll med et redusert antall mønstre faktorer (nemlig FGF2, 4 og 8), og en forenklet oppsett ved å holde cellene i 6-vel plater (6WPs) gjennom å minimere medium krav10. Hjelp produksjon av granule celler, ble smoothened Agonistiske (SAG) brukt under det endelige modning trinnet. SAG er en billigere kjemiske alternativ soniske pinnsvin (SSH), som hadde blitt brukt i tidligere lillehjernen protokoller sin viktige rolle i å fremme veksten av granule celle prekursorer (GCPs) i vivo1,2, 11,12,13. Differensiering produkter var i samsvar med de fra andre 3D protokoller, inkludert tilstedeværelse av lillehjernen-assosiert markører i morphologically relevante strukturer8,9. Slike resultater forsterke tidligere budskapet som detaljerte etterligner for vivo miljø ikke være nødvendig for komplekse 3D i vitro differensiering protokoller.

I tillegg til 3D protokollen, denne rapporten beskriver en 2D protokoll, designet med samme Hurtigstartguide, grunnleggende materialer, og redusert antall vekstfaktorer. Det produsere celler fra menneskelige embryonale stamceller (hESCs) eller indusert pluripotent stamceller (hiPSCs), positivt for markører knyttet tidlig nevrale, lillehjernen, og granule celle identiteter. I tillegg indikerer kalsium imaging tilstedeværelse av funksjonell menneskelige neurons. Muligheten til å velge mellom protokoller, legger til et nivå av fleksibilitet for forskere, for de som er interessert i enten: (1) genererer bestemt celle skriver, (2) modellering menneskelige hjernens utvikling og tilhørende strukturer, (3) analyse optimalisert i monolayer innstillinger (f.eks, patch-klemme opptak), eller (4) celle-celle interaksjoner i blandet nevrale kulturer. Deres enkel og rimelig natur gjør dem tilgjengelig for forskere som er nye til feltet hPSC, eller trenger base hPSC prosedyrer å utforske videre differensiering alternativer.

Protocol

1. forberedelser

Merk: For alle trinnene se Tabellen for materiale for bestemte elementer.

  1. Forberede 500 mL definert hPSC kultur medium hPSC kultur
    Merk: Bruk medium for trinn 2.1-2.6.
    1. Tine hPSC middels supplement natten (o/n) på 4 ° C. Fjerne 12.5 mL hPSC base medium fra middels flaske, og deretter legge 10 mL supplement og 2,5 mL (gjør 100 U/L) Penicillin/Streptomycin (penn/Strep) i flasken.
    2. Lagre på 4 ° C og bruk innen 2 uker.
      Merk: HPSC mediet kan brukes til å fryse ned celler ved å legge 10 µM ROCK Inhibitor (RI) og 10% DMSO.
  2. Forberede 1 L nevrale vedlikehold medium (NMM) for differensiering kultur
    Merk: Bruk medium for trinn 3.1-4.4.
    1. Mix glutamin befestet DMEM/F12 og nevrale grunnleggende medium (1:1 ratio) i en 1 L flaske, deretter supplere med (1 x) N2 supplement, (1 x) B27 supplement, 5 µg/mL insulin, 1,5 mM L-glutamin, 100 µM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 100 U/L penn/Strep og 10 µM Beta-mercaptoethanol.
    2. Lagre medium på 4 ° C og bruk innen 3 uker.
      Merk: Før du legger kosttilskudd til blandet basale medium, ta riktige volumet justere for nødvendig antall ekstra komponenter basert på lager konsentrasjoner.
  3. Forberede 500 mL 0,5 mM EDTA fungerende løsning for passaging hPSCs
    Merk: Bruk medium for trinn 2.4 og 2.5.
    1. Under en flyt-hette, overføre 49 mL av fosfat bufret saltvann (PBS) fra en 500 mL steril PBS flaske til en 50 mL tube. Legge til 0,5 mL 0,5 M EDTA og 0.9 g NaCl 50 mL tube. Bland forsiktig å oppløse.
    2. Filter-sterilisere løsning ved hjelp av et 0.22 µm filter og overføring til 500 mL steril PBS flasken. Lagre ved romtemperatur (RT).
  4. Forberede hPSC kultur plater for hPSC kultur
    Merk: Bruk plater for trinn 2.1-2.6.
    1. Gjøre 50 x fungerende løsning av hPSC-passende tilhenger belegg (PAAC): tine ampuller med PAAC o/n på 4 ° C. Fortynn PAAC i 1:1 ratio med DMEM/F12 og overføre som 400 µL dele inn 1,5 mL rørene. Lagre 50 x fungerende løsning PAAC på-80 ° C.
      NOTE (viktig) PAAC stivner raskt på RT, derfor er det nødvendig at alle komponenter (DMEM, rør, etc.) holdes på is (eller 4 ° C).
    2. Tine tube 50 x fungerende løsning PAAC på 4 ° C, og fortynne 50 x i kalde DMEM/F12. Legge til 750 µL/godt av fortynnet PAAC en 6WP. Inkuber plate minst 1t på 37 ° C.
      Merk: PAAC plater lagres for 1 uke på 4 ° C, ved å pakke platen etter 1t inkubasjonstid. Varme platen til 37 ° C før bruk.
  5. Forberede anti-lim (AA) plater differensiering kultur
    Merk: Bruk plater for trinn 3.1-4.1.
    1. Gjøre 5 mg/mL Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (poly-HEMA) løsning i 95% etanol. Rist o/n på 37 ° C til en klar løsning oppnås. Butikken på RT.
      Merk: Filtrering gjennom et 0.22 µm filter kan fjerne fra ikke poly-HEMA.
    2. Legge til poly-HEMA kultur plate slik at det dekker nederst hver brønn. Inkuber platen på 37 ° C for 2 dager, og kontroller platen for å sikre fullstendig fordampning av væske/uniform belegg brønner. AA plater kan være pakket og lagret på RT.
  6. Forberede Poly-L-Ornithine/Laminin (PLO/LAM) plater differensiering kultur
    Merk: Bruk plater for trinn 4.2-4.4.
    1. Coat arealet av brønner, bruker 20 µg/mL PLO oppløst i sterilt PBS. Inkuber plate o/n på 37 ° C. Sug opp PLO og skyll 3 ganger med PBS.
      Merk: (Valgfritt) Incubated plate med PLO kan være pakket og lagret på 4 ° C til nødvendig.
    2. Pels flater av PLO-belagt, bruker 10 µg/mL LAM oppløst i sterilt PBS. Inkuber for minst 2 h på 37 ° C eller o/n på 4 ° C. Fjerne LAM og vask brønner 2-3 x med PBS, deretter umiddelbart legge aktuelle mediet og/eller celler.
      Merk: (Valgfritt) fjernet LAM løsning kan lagres på 4 ° C og gjenbrukes opptil 2 ganger. (Viktig) Ikke Tillat LAM-belagt overflater tørke ut; for å forhindre dette umiddelbart legge PBS eller passende medium.
       

2. protocol 1: Mater-fri hPSC kultur

Merk: hESCs var oppnådd fra en ikke-kommersiell organisasjon (linje H01, se Tabellen for materiale). Tre hiPSC kontrollen linjer (hvs51, 60 og 88) ble generert av omprogrammering fibroblaster fra tre sunne menneskelige pasienter (fibroblaster var avledet fra anonyme, ikke-identifiserbar givere og derfor fritatt IRB godkjenning)10, 17.

  1. Opprettholde hPSCs i arkmateren-fri kultur
    1. Etter tining og plating hPSCs på PAAC plater i hPSC medium (se trinn 2.2), opprettholde hPSCs ved 37 ° C med 5% CO2. Oppdatere hPSC medium daglig (se trinn 2.3), bortsett fra dagen etter tining eller passaging og undersøke celler under microscope (mål: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1) å observere veksten rate og identifisere potensielle differensiering (Figur 3 , øvre venstre panel viser eksempel på differensiering).
    2. Passasje hPSCs hver 3-4 dager, eller når kultur når > 80% samløpet. Hvis mindre enn 5% av celler utstillingen differensiering, bruk normal hPSC passaging metoden (se trinn 2.4), ellers bruk mild metoden (se trinn 2.5). Når du ikke lenger trenger i kultur, hPSCs kan fryses for langtidslagring (se trinn 2.6).
  2. Tine hPSCs hPSC medium
    1. Overføre et bestemt volum av hPSC medium sterilt rør for tiner prosessen (9 mL/kryogene rør) og forberedt PAAC plate å motta tinte celler. Supplere mediet i begge rør med 10 µM RI.
    2. Hente cryotube fra LN2 lagring og sted direkte i et vannbad (37 ° C). Når bare en liten is krystall restene, fjerne fra vannbad og overføre innholdet i Kryogenisk røret til røret for tining prosessen (totalt volum 10 mL). Sentrifuge røret 290 x g i 5 min på RT.
    3. Bruk en serologisk pipette for å fjerne PAAC løsning fra brønnene av PAAC plate (se trinn 1.4) skal motta celler og legge hPSC medium med 10 µM RI.
      Merk: (viktig) gjør ikke leveringstanken PAAC løsning med en suge nål, eller det kan stivne og tette linjer til vakuumpumpe.
    4. Fjern nedbryting fra røret og resuspend celler i hPSC medium med 10 µM RI. Distribuere cellene til destinasjon plate på forholdet mellom 1 kryogene rør/godt av 6WP. Ruge på 37 ° C med 5% CO2, og ikke Oppdater medium for en dag.
      Merk: Starte opp celler på 5% O2 kan øke celle overlevelse.
  3. Oppdatere hPSC medium
    1. Varm den nødvendige mengden hPSC medium i et sterilt rør på RT eller i et vannbad; 2 mL/godt av 6WP er foreslått.
      Merk: (Valgfritt): legger til en ekstra mengde hPSC medium, hPSCs kan være en ekstra dag uten oppdaterer; men ikke la dette mer enn en gang i uken.
    2. Sug opp mediet brønner som inneholder hPSCs og legge til frisk hPSC medium.
    3. Kultur hPSCs i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
  4. Passasjen hPSCs hPSC medium
    1. Overføre et bestemt volum av hPSC medium til sterilt rør, passaging prosessen og forberedelse av PAAC plate å motta passaged celler. Supplere mediet for destinasjon plate med 10 µM RI. Varm middels rør RT eller i et vannbad.
      Merk: Forberedelse og håndtering vil variere hvis bruker en alternativ belegg enn oppført i Tabell for materiale.
    2. Bruk en serologisk pipette for å fjerne PAAC løsning fra brønnene av PAAC plate (se trinn 1.4) skal motta celler og legge hPSC medium med 10 µM RI.
      Merk: (viktig) gjør ikke leveringstanken PAAC løsningen med en sugekopp nål, da den kan forsterke og tette linjer til vakuumpumpe.
    3. Sug opp mediet brønner med hPSCs å være passaged, vaske celler to ganger med 0,5 mM EDTA, deretter legge til 0,5 mM EDTA og ruge i 2-5 min på 37 ° C.
      NOTE 1 mL/godt av 6WP er et tilstrekkelig antall EDTA for vask og inkubasjon.
    4. Sjekk brønnene under mikroskopet (mål: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Hvis celler begynner å løsne, Sug opp EDTA løsning og flush celler gratis ved hjelp av hPSC medium.
      Merk: (viktig) ta vare ikke å fjerne hele hPSC kolonier når aspirating EDTA (ikke vent til hele kolonier er koble). Spyl ikke celler mer enn 5 ganger da dette kan skade hPSCs og påvirke pluripotency. Også, ikke la celler stå i hPSC medium med RI før spyling celler fra brønner, som de kan re overholde platen.
    5. Basert på empiriske fastsettelse (vanligvis knyttet til samløpet, størrelsen på koloniene, og veksten), overføre hPSCs brønner av destinasjon plate med splitting forholdet 1:4-1:16 (dvs., 1 godt fra den originale platen 4 brønner på målet plate). Ruge på 37 ° C med 5% CO2, og ikke Oppdater medium for en dag.
      Merk: Splitting prosenter idet høy idet 1:16-1:20 er mulig å forhindre trengsel og forbedre utseende kolonier.
  5. Passasjen hPSCs med mild-metoden (G-metoden)
    1. Overføre et bestemt volum av hPSC medium til sterilt rør, passaging prosessen og forberedelse av PAAC plate å motta passaged celler. Supplere mediet for destinasjon plate med 10 µM RI. Varm middels rør RT eller i vannbad på 37 ° C.
    2. Bruk serologisk Pipetter til fjern PAAC løsning fra brønner PAAC plate skal (se trinn 1.4) motta celler og legge hPSC medium med 10 µM RI.
      Merk: (viktig) gjør ikke leveringstanken PAAC med en suge nål, eller det kan stivne og tette linjer til vakuumpumpe.
    3. Sug opp medium fra brønnene med hPSCs å være passaged, og vask cellene to ganger med 0,5 mM EDTA. På den andre vasken, vent 30 s før aspirating EDTA, deretter legger 1 mL av PBS og ruge i 4-9 min på 37 ° C. Mens du venter, forberede et sterilt rør med 4 mL PBS.
      NOTE 1 mL/godt av 6WP er tilstrekkelig volum av EDTA for vask.
    4. Sjekk brønnene under mikroskop (mål: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Hvis celler begynner å løsne, forsiktig trykk sidene av platen å gratis kolonier. Når > 50% av koloniene fritt flytende, bruk en 5 mL serologisk pipette overføre koloniene i 1 mL PBS til røret som inneholder 4 mL PBS (ikke triturate).
      Merk: (viktig) siden hensikten er å rydde opp i hPSC kultur, sjekk for å fastslå om differensierte celler forblir knyttet til plate. Også, det er ikke nødvendig å passasje alle koloniene i en godt med denne prosessen så koloniene som være knyttet blir liggende igjen.
    5. Vent 5-10 minutter til RT for cellene å bosette seg i røret (ikke sentrifuge). Sug opp PBS fra tuben, ta vare ikke for å fjerne utlignet hPSCs. Nøye resuspend cellene i hPSC medium (ikke triturate), og overføre cellene til destinasjon plate med splitting forholdet 1:4-1:16. Ruge på 37 ° C med 5% CO2, og ikke Oppdater medium for en dag.
  6. Fryse ned hPSCs
    1. Avhengig av samløpet, bruker du 1 godt av hPSCs, 2-3 dager (maks) i kultur, fylle 1-2 kryonisk bevaring hetteglass for lagring i LN2.
    2. På slutten av passaging (trinn 2.5), bruke 500 µL eller 1 mL av hPSC medium til å overføre celler fra 1 godt av 6WP til 1 eller 2 kryonisk bevaring ampuller, henholdsvis (500 µL/medisinglass). Legge til 500 µL av 2 x frysing middels inneholder hPSC medium, 20 µM RI og 20% DMSO hver tube.
      Merk: (Valgfritt) celler kan overføres direkte i 1 x frysing medium på 1 mL/hetteglass.
    3. Plass kryogene rør i Kryogenisk beholder (inneholder isopropanol) pre avkjølt 4 ° C, og store umiddelbart på-80 ° C.
    4. På dagen kan du overføre kryogene rør til en LN2 tank for langtidslagring.

3. protocol 2: 3D "Organoid" differensiering

  1. Oppsett av differensiering endret G-metode for passaging av hPSCs
    1. Overføre et bestemt volum av NMM for antall mål som ble til et sterilt rør. Supplere med 4 ng/mL FGF2 og 10 µM RI. Varme middels røret RT eller i vannbad på 37 ° C.
      Merk: Avhengig av samløpet av opprinnelse, hPSCs er konsentrert i fordelingen av destinasjon platen i en 2:1 eller 3:1 ratio (dvs., 2 brønner fra den originale platen 1 godt av destinasjon plate) med en slutt volum på 2,5 mL/godt av 6WP.
    2. Sug opp mediet brønner som inneholder hPSCs til differensieres og vaskes cellene to ganger med 0,5 mM EDTA. På den andre vasken, vent 30 s før aspirating EDTA, deretter legger 1 mL av PBS og ruge i 4-9 min på 37 ° C. Mens du venter, forberede et sterilt rør med 4 mL PBS.
      NOTE 1 mL/godt av 6WP er tilstrekkelig volum av EDTA for vask. (Viktig) Det anbefales å bruke hPSCs som var ikke lenger enn 3 dager i kultur etter siste passering, og minst 1-2 ganger etter tining.
    3. Sjekk brønner under mikroskopet (mål: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Hvis celler begynner å løsne, gratis cellene ved milde trykke på sidene av platen. Overføre cellene til et rør som inneholder 4 mL PBS med en 5 mL pipette.
      Merk: (viktig) lys rødme og føden er tillatt å bryte opp kolonier og samle løs celler, men ignorerer celler som er adhered til platen.
    4. At røret for å sitte i 10 min på RT, for tyngdekraften separasjon. Eventuelt sentrifuge cellene lett (ikke større enn 200 x g ved RT, i 5 min) om nødvendig.
    5. Leveringstanken PBS fra tuben, ta vare ikke for å fjerne utlignet hPSCs, resuspend cellene i NMM med 4 ng/mL FGF2 og 10 µM RI, og deretter distribuere til AA-belagt plate i forholdet 2:1 eller 3:1. Ruge på 37 ° C med 5% CO2, og ikke Oppdater medium for 3 dager, med mindre det kreves (se trinn 3.2.1).
      Merk: (Valgfritt) For bekvemmelighet overfører celler, legger en del av kultur medium brønner av destinasjon platen før distribusjon og resuspend cellene i et mindre volum. HPSCs kan også farget og regnet for å definere nøyaktig start celle tetthet. Men bør det siste bindet i destinasjon platen være 2,5 mL/godt av 6WP.
  2. Opprettholde frittflytende differensiering kultur på 37 ° C (5% CO2)
    1. Sjekk plater hver dag for endringer i middels farge, akkumulering av døde celler, klumper og overholdelse av vel bunner.
      1. Valgfritt: Uansett medium endring planen, oppdatere (inkludert de første 3 dagene av nei forfriskende) medium hvis den har slått gul, og følger instruksjonene for middels endre/oppdatere (trinn 3.3). Hvis fleste cellene vises døde, følger du instruksjonene for middels endre/oppdatere med tyngdekraften separasjon (trinn 3.4).
        Merk: Formasjon på EBs og veksten i stor celle aggregater er forventet, men celler og celle aggregater kan clump sammen i store massene ikke på grunn av personlige vekst/spredning. Hvis dette er observert, er lys føden å bryte opp massene tillatt. Hvis celler overholder AA-tallerken overflaten, kan de resterende flyter innholdet brønner overføres direkte til nye brønner, eller overført under prosessen med middels endre/oppdatere. Ikke forsøk å overføre celler som har levd opp til platen.
    2. Dag 3, endre mediet til NMM med 4 ng/mL FGF2. Oppdater medium annenhver dag.
    3. På dag 7, endre mediet til NMM med 1 µM Retinoic Acid (RA), 100 ng/mL FGF8B og 4 ng/mL FGF2. Oppdater medium annenhver dag.
      Merk: (viktig) RA er lys-sensitive. Beskytte RA kultur prøver fra lys.
    4. På dag 14, endre mediet til NMM med 100 ng/mL FGF8B, 100 ng/mL FGF4 og 20 ng/mL FGF2. Oppdater medium annenhver dag.
    5. På dag 17, endre mediet til NMM med 100 ng/mL FGF8B. Oppdater medium annenhver dag.
    6. På dag 21, endre medium NMM med 100 ng/mL hjernen avledet nevrotropisk faktor (BDNF) og 10 ng/mL Glial avledet nevrotropisk faktor (GDNF). Oppdater medium annenhver dag.
    7. På dag 28, endre mediet til NMM med 100 ng/mL BDNF og 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL SAG, 100 ng/mL nevrotropisk faktor 3 (NT3) og 25 mM KCl. Oppdater medium annenhver dag.
    8. På dag 35, samle den 3D organoids for analyse.
  3. Endre/oppdatere differensiering medium for 3D kultur
    1. Overføre et bestemt volum av NMM med riktige komponentene (se trinn 3.2.2-3.2.7 for komponent tidsplan) til et sterilt rør. Varme i et vannbad på 37 ° C.
    2. Tips platen og rist forsiktig til cellene avgjøre til nedre kant av brønnene. Nøye fjerne 2 mL gamle mediet bruker en serologisk pipette, unngå fjerning av celler, og deretter legge 2 mL av fersk medium. Ruge på 37 ° C med 5% CO2.
      Merk: (viktig) slutten volumet bør være 2,5 mL/godt av 6WP. Hvis fordampning, Fjern ikke 2 mL av gamle som dette vil ytterligere tørke ut cellekulturer; i stedet legge ekstra medium.
  4. Endre/oppdatere differensiering medium med tyngdekraften separasjon
    1. Overføre et bestemt volum av NMM med de riktige komponentene til et sterilt rør. Varme i et vannbad på 37 ° C.
    2. Overføre innholdet i brønnene som et sterilt rør, og la røret for å sitte i 10 min på RT, for tyngdekraften separasjon.
    3. Bruk en pipette for å fjerne gamle medium fra røret, å ta vare ikke å fjerne avgjort celler, resuspend i NMM med riktige komponentene, og deretter distribuere nye AA-belagt brønner. Ruge på 37 ° C med 5% CO2.
      Merk: (Valgfritt) For bekvemmelighet, en del av kultur medium kan legges til målet brønner før distribusjon, med differensiering cellene resuspended i lavere volum. Slutten volumet bør være 2,5 mL/godt av 6WP.

4. protokoll 3: Alternativ 2D differensiering kultur

  1. Starte og vedlikeholde kultur ved hjelp av trinn som avsnitt 3 for 3D protokollen gjennom dag 12
    1. Følg trinnene 3.1-3.2.3 og endre/Oppdater medium som trinn 3.3 og 3.4.
  2. Bytt til og opprettholde som 2D monolayer kultur
    1. På dag 13 i differensiering, følg instruksjonene for å endre/oppdatere medium med tyngdekraften separasjon (trinn 3.4), bare fordele celler/aggregater PLO/LAM belagt platen (se trinn 1.6) med et slutten volum på 2,5 mL/godt av 6WP.
      Merk: Medium kan suppleres med 10 µM RI under den innledende plating å etterlevelse og overlevelse av celler. (Viktig) Det er ønskelig å jevnt spredt cellene i brønnene, unngå lav tetthet eller trengsel på plater og passasje (se trinn 4.4) etter behov. Foretrukket størrelsen av PLO/LAM belagt plater (dvs., 6WP, 12WP, etc.) må være empirisk fastsatt, basert på spredning satsen for cellen linjen og formål for produktet. Instruksjoner vil gi volumer for 6WP, og kan konverteres ved halvere for hver dobling av brønn nummer (dvs.2 mL/godt for 6WP, 1 mL/godt for 12WP, etc.)
    2. På dag 14, endre mediet til NMM med 100 ng/mL FGF8B, 100 ng/mL FGF4 og 20 ng/mL FGF2. Oppdater medium annenhver dag som beskrevet i trinn 4.3.
    3. På dag 17, endre mediet til NMM med 100 ng/mL FGF8B. Oppdater medium annenhver dag som beskrevet i trinn 4.3.
    4. På dag 21, endre mellomlang til NMM med 100 ng/mL BDNF og 10 ng/mL GDNF. Oppdater medium annenhver dag som beskrevet i trinn 4.3.
    5. På dag 28, endre mediet til NMM med 100 ng/mL BDNF og 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL SAG, 100 ng/mL NT3 og 25 mM KCl. Oppdater medium annenhver dag som beskrevet i trinn 4.3.
    6. På dag 35, samle celler for analyse eller opprettholde den samme medium som skritt 4.2.5 for utvidet kultur (potensielle grense ikke testet).
  3. Endre/oppdatere differensiering medium for 2D kultur
    1. Overføre et bestemt volum av NMM med riktige komponentene (se trinn 4.2.2-4.2.5 for komponent tidsplan) til et sterilt rør. Varme i et vannbad på 37 ° C.
    2. Sug opp mediet brønner, deretter legge 2 mL nytt medium. Ruge på 37 ° C med 5% CO2.
      Merk: (Valgfritt) slutten volum kan holdes på 2,5 mL/godt av 6WP, bruke en pipette fjerne 2 mL gammelt medium og legge til 2 mL av fersk medium. Reserverer en del av gamle kan medium i brønner og hindre celler fra luften kontakt, minske sjokk til cellene i endre trinnene.
  4. Passasjen 2D differensiering kultur
    1. Overføre et bestemt volum av NMM med riktige komponentene (se trinn 4.2.2-4.2.5 for komponent tidsplan) til sterilt rør, for passaging prosessen, og separat, for å forberede PLO/LAM belagt plate for mottak av passaged celler. Supplere medium for destinasjon platen med 10 µM RI. Varme middels rør RT eller i et vannbad på 37 ° C. For å spare på komponenter, er det mulig å bruke NMM alene for vask celler under passaging prosessen.
      Merk: (viktig) hvis produkter skal brukes i kalsium bildebehandling eksperimenter, sikre passasje celler mellom 2-6 dager før slutten av differensiering.
    2. Sug opp mediet brønner for å være passaged. Legge til 300 µL/vel trypsin-baserte dissosiasjon agent (se Tabell for materiale), virvel plate å dekke brønner, deretter umiddelbart fjerne dissosiasjon agent.
    3. La platen til å sitte i 2 minutter på RT, så løsne cellene ved å trykke på sider av platen. Legg til 600 µL/godt definerte trypsin hemmer (DTI) og overføre cellene i DTI til et sterilt rør med 5 mL NMM.
    4. Sentrifuge røret 290 x g i 15 min på RT. leveringstanken mediet og legge en annen 5 mL NMM til røret.
    5. Sentrifuge røret 290 x g i 15 min på RT. leveringstanken mediet og resuspend cellene i det aktuelle mediet som inneholder RI.
    6. Distribuere cellene i PLO/LAM platen bruker splitting forholdet 1:1-1:12, avhengig av den første samløpet, spredning hastighet og størrelse differensial opprinnelse av destinasjon platen, og opprettholde på 37 ° C med 5% CO2.

Representative Results

Visuell oversikt over redusert vekst faktor 2D og 3D lillehjernen differensiering protokoller
Figur 1 viser samlede tidslinjen for 2D- og 3D lillehjernen differensiering protokollene, identifisere extrinsic faktorer og tid ved plating. Typisk fremdriften for hPSCs gjennomgår 3D lillehjernen differensiering er avbildet i figur 2: med hESC linje H01 som kolonier i mater-fri kultur på dag 0 (øverst til venstre i figur); gjennomgår EB dannelsen av dag 2 (øvre midten); vokse til større celle aggregater med tilsynelatende lumen etter neural induksjon RA og FGF8 på dag 14 (øverst til høyre); danner aggregater av varierende størrelse og form på dag 28 (nedre venstre); utvikle i kompleksitet med ulike strukturer i en enkelt samlet angitt i dag 28 (lavere midten); og fortsatt morfologiske endringer i de samme strukturene på dag 35 (nederst til høyre). Typisk fremdriften for hPSCs gjennomgår 2D lillehjernen differensiering er avbildet i Figur 3: med hESC linje H01 som kolonier i mater-fri kultur på dag 0 (øverst til venstre i figuren sirkel angir området av differensierte celler blant hESC kolonier) ; gjennomgår EB dannelsen av dag 2 (øvre midten); vokse til større celle aggregater med tilsynelatende lumen etter neural induksjon RA og FGF8 på dag 13 (øverst til høyre); proliferating som tilhenger celler etter plating på dag 14 (nedre venstre); og da som en monolayer av celler med mer komplekse passer morfologi på dag 35 under lav (lavere midten) og forstørring (nederst til høyre).

3D produkter Exhibit markører og strukturer av tidlig Neuroepithelium
Figur 2 (nedre venstre bilde) og Figur 4 viser heterogenitet av 3D samlet morfologi sett hele dyrking, på grunn av varierende vekst og/eller modning priser, samt Stokastisk sammenslåing eller bryte fra hverandre av aggregater. Til tross for heterogenitet produserer hver differensiering aggregater viser tidlig nevrale og neuronal markører, inkludert lillehjernen granule markør ZIC1, som angitt av immunocytochemistry (ICC) flekker i figur 5. Enda viktigere, foreslår figur 5 og figur 6 at en enkel 3D kultur, med redusert vekst faktorer, er generere aggregater med komplekse strukturer knyttet til hjernens utvikling som tidlig neuroepithelium og rhombic leppe.

2D produkter Exhibit lillehjernen markører og funksjonelle Neuronal aktivitet
2D kulturer ikke kan reprodusere komplekse 3D strukturer, er de i stand til å generere celler viser tidlig nevrale og neuronal markører, inkludert lillehjernen granule cellen merket ZIC1, som angitt av ICC flekker i figur 7. Gene expression analyse via RT PCR, støtter som vist i Figur 8, ICC flekker resultater, men tidlig granule celle markør ATOH1 er variabel mellom eksperimenter og. Kalsium imaging håndteres lettere i 2D kultur. Som vist i figur 9, supplerende Video 1og supplerende Video 2, Vis elektrisk stimulert celler kalsium influxes som er typiske for neuronal avfyring mønstre, foreslå generasjon functional nerveceller.

Figure 1
Figur 1: tidslinje av differensiering protokollen (starter på dag 0 av differensiering). Heltrukket linje bokser angir når spesifikke faktorer legges til kultur medium, og prikket linje bokser angir plate belegg for valgfrie 2D endring. Hvis FGF2, pil ned refererer til lave konsentrasjoner (4 ng/mL) og pil opp refererer til høyere konsentrasjoner (20 ng/mL). Dette tallet er endret fra Holmes og Heine10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representant brightfield bilder av 3D protokollen. hESC kolonier i d0, EBs på d2, samler etter induksjon d14, aggregater av forskjellig størrelse og morfologi (nummerert 1-5) på d28, en enkelt samlet med unik, identifiserbare funksjoner (angitt med bokstaver en-c) på d28, og synlige endringer i de samme funksjonene på d35. Skala bar = 100 µm. Dette tallet er endret fra Holmes og Heine10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representant brightfield bilder av 2D protokollen. hESC kolonier en d0, EBs på d2, samler etter innledningen på d13, etter plating tilslag på d14, etter modning på d35 sett på 5 x forstørrelse og 20 x forstørrelse. Den hvite sirkelen i øvre venstre panel viser området av differensierte celler blant hESC kolonier. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Brightfield bilder viser av varierende størrelse og kompleksitet i 3D kultur. Aggregater på (A) dag 8 (hESCs) og (B) d35 (hiPSCs). Det siste bildet består av tre separate bilder å vise hele samlet. Begge aggregater kan ha blitt påvirket av sammenslåing av mindre mengder eller tap (bryte ut) av strukturer. Skala bar = 200 µm. Dette tallet er publiseres fra Holmes og Heine10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: ICC bilder av 3D vise relevante indikatorer og strukturer. På kultur d35, 3D produkter utstilling: PAX6 (grønn) og TBR2 (rød) av lumen av nevrale rosett-lignende formasjon (1.p); DCX (grønn) og NeuN (rød) sprer seg fra ytterkanten ventrikkel sone (VZ)-som struktur (andre rad); KIRREL2, en markør tilknyttet lillehjernen neuroepithelium (tredje rad, venstre); og ZIC1 en tilknyttet lillehjernen granule celler (tredje rad, høyre). Eksperimentet ble gjennomført flere ganger med fire ulike hPSC linjer: hESC linje H01 (n = 5), og iPSC linjer hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), og hvs51 (n = 1). Piler peker til Rhombic leppe (RL)-som struktur. Skala bar = 100 µm. Dette tallet er publiseres fra Holmes og Heine10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: storskala ventrikkel sone-lignende struktur i 3D produktet. Kultur d35 er en hESC-avledet samlet positivt for PAX6 (grønn) og TBR2 (rød) vanligvis forbindes med tidlig neurons innen ventrikkel soner (VZs) og subventricular soner (SVZs), i vivo. (Øverst) En stjerne (*) markerer den apikale siden av VZ som regionen kjører langs kanten av mengdeberegningen, med parenteser som angir dybde/deling av VZ / SVZs. (midten) fusjonerte signaler Vis spredte delene av PAX6 / TBR2-celler øker i størrelse til øvre høyre av VZ. (Nederst) Høyere forstørrelse bilde av avsnittet angitt med et rektangel i midtre panelet. Skala bar = 100 µm. Dette tallet er endret fra Holmes og Heine10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: ICC bilder av 2D produkter Vis relevante indikatorer. På kultur d35, 2D produkter exhibit, fra hESCs (øverste rad) og hiPSCs (nederste rad), celler positivt for: granule celle trådkorsmarkør ZIC1 og vandrende lillehjernen neuron TAG1 (venstre kolonne); og neuronal markør neurofilament (NF) og TAG1 (høyre kolonne). Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: RT PCR 2D produkter. mRNA uttrykk analyse av hESC linje H01 (øverste rad) og hiPSC linje hvs60 (nederste rad) på slutten av 2D protokoll viser produkter med gel geleelektroforese for: granule cellen merket ZIC1, granule cellen merket ATOH1, vandrende lillehjernen Nevron markør TAG1, Purkinje cellen markør Calbindin (CALB), spenning-avhengige kalsium kanal CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), gamma - aminobutyric acid (GABA) B reseptor 1 (G-Br1), og housekeeping genet EIF4G2).

Figure 9
Figur 9: kalsium bildebehandling/analyse av 2D. På kultur d35, ble hPSC differensiering produkter registrert i 2 minutter under mikroskopet, etter inkubasjon med fluor5 farge. 30 s, celler var påtrykkes for 10 s på 10 Hz. (A) stillbilder Vis hESCs på 0 s (venstre) og etter starten av elektrisk stimulering 30 s (høyre). Pilene angir områder av interesse (ROI) for analyse av kalsium tilstrømningen. (B) grafisk analyse viser endringen i relativ fluorescens versus tid for avkastning (endre fluorescens = (F-F0) /F0, der F0 = (∑F1-n) / n), med Nevron-like pigger oppstår før, under og etter stimulering. Svart linje angir lengden på elektrisk stimulering. Skalere bar (hvit) = 50 µm. Full opptak for hESC (som sett her) og en hiPSC linje (vises ikke) finnes i supplerende Video 1 og supplerende Video 2, henholdsvis. Opptak er i AVI-format, med 4 x hastighet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekstra Video 1: kalsium imaging video av 2D produkt fra hESC linje H01. På kultur d35, differensiering produkter fra hESC linje H01 ble registrert i 2 minutter under mikroskopet, etter inkubasjon med fluor5 farge. 30 s, celler var påtrykkes for 10 s ved 10 Hz. opptak ble gjort for 2 rammer/s, og behandlet AVI video på ~ 7 rammer/s, produsere en video varer ~ 30 s, hastighet på ~ 4 x. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra Video 2: kalsium imaging video av 2D produkt fra hiPSC linje hvs51. På kultur d35, ble differensiering produkter fra hiPSC linje hvs51 registrert i 2 minutter under mikroskopet, etter inkubasjon med fluor5 farge. 30 s, celler var påtrykkes for 10 s ved 10 Hz. opptak ble gjort for 2 rammer/s, og behandlet AVI video på ~ 7 rammer/s, produsere en video varer ~ 30 s, hastighet på ~ 4 x. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Kompleksiteten og kostnadene er relevante faktorer for stem cell forskere når velger eller utvikling differensiering. Dette gjelder særlig som det er et åpent spørsmål til hvor mye ekstern kontroll er nødvendig for å generere ønsket celletyper, eller -å utgjøre det annerledes — hvordan kompetent hPSCs er til å produsere sine egne oppvekstmiljø, hvis igjen til seg selv med tilstrekkelig næringsstoffer. Innføring av extrinsic faktorer i vitro kan godt gi ønsket celler, men de kan også forstyrre med iboende utviklingsmessige kapasiteten ville celler har utstilt i vivo. Slik er viktig, spesielt hvis målet er bruk av pasient-avledede iPSCs for sykdom modellering. Utstrakt bruk av mønstre og/eller vekst faktorer kan maskere sykdom fenotyper. Protokollene i denne rapporten følger trenden i tidligere studier å redusere kompleksitet, kostnader eller bruk av ytre mønstre faktorer8,9.

Basert på resultatene Muguruma et al., og vår egen fersk studie, virker det som det er mulig å oppnå differensiering mot lillehjernen skjebne uten anstrengelser for å reprodusere i vivo forhold, som tidligere studier har gjort 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. den spennende delen er at de to studiene brukt ulike sett av vekstfaktorer, tyder på at verken sett var nødvendig, selv om begge brukte FGF2. Vi kjørte flere tester, hvor FGFs var selektivt ekskludert fra protokollen, og viste at celler var generere samme produkter uten ytre FGFs10. Forskjeller mellom våre studier var kvalifisert av det faktum at vi brukt ulike hPSC linjer og kultur metoder, indusert nevrale differensiering med RA og inkludert komponenter for å støtte granule celle overlevelse og modning (BDNF, GDNF, SAG og KCL)11 -14. I tillegg var en mindre komplekse oppstartsmetode, sammenlignet med Muguruma et al., ansatt. Deres protokollen begynte ved å generere enhetlig EBs i 96WPs, som isolert dem fysisk og kjemisk fra hverandre. Protokollen her hadde klientstøtte relativt overfylt sammen i 6WPs under EB formasjon, som tillot dem å kommunisere fritt. Hvordan dette kan ha ulikt påvirket fysiske og kjemiske miljøet EBs og senere organoids (inkludert innebygde produksjon signalnettverk forbindelser) ukjent, og kan bli utforsket. Også, vi viser uttrykket av gener forbundet med – og så kan tyde på-lillehjernen opprinnelse, ligger strukturer morphologically ligner de som rapportert av Muguruma et al., vi ikke kan utelukke generasjon av neuronal-lignende strukturer som er ikke-lillehjernen identitet. Fremtidige studier, en stor panelet av antistoffer som rapportert av Muguruma et al. (dvs., ATOH1, CALB, etc.) vil gjøre slike tildelinger og sammenligning mellom produkter av begge protokollene, mer avgjørende.

I 3D-protokollen, det er viktig å starte med og opprettholde et tilstrekkelig antall celler i kultur for å sikre tilstrekkelig antall produkter for analyse. Gitt betydelige die-off tidlig i protokollen, anbefaler vi starter med mer enn 500 EBs/godt under de første 3 dagene kultur (figur 1). Dette bør ikke være vanskelig å oppnå gitt kolonien størrelser for hPSCs i arkmateren-fri kultur, men kanskje ikke så lett for de som fortsatt bruker mater-avhengige metoder. Gitt det store antallet celler, er det viktig å se etter endring i medium (som viser pH endringer) og akkumulering av døde celler. Begge må rettes for å hindre kollaps av kulturen. Det kan også være klumper av celler og aggregat i massive strukturer. Selv om det kan fortsatt føre aggregater som kan analyseres, vil Produktmengde bli sterkt redusert, bryte dem opp i mindre mengder med mild føden kan være nyttig. Imidlertid unngå urovekkende normal aggregater, som selv kan vokse til store størrelser (Figur 4). Hvis aggregatene blir for sparsom, anbefales det å kombinere brønner slik at aggregater ikke er helt isolert. Produktvariasjon (i antall, størrelse og morfologi) er et kjent problem i 3D cellekultur, inkludert for disse protokollene starter med isolert, uniform EB formasjon skritt, tyder på at en mindre komplekse startprosedyre (for eksempel protokollen beskrevet her ) kan være mer praktisk8,15. Mens denne heterogene er noe forskning nød å huske, spesielt under analyse, generert rapporterte protokollen produkter samsvar med de som finnes i andre 3D protokoller8,9,15. Basert på størrelse og morfologi, faller de innen nevrale rosett til et organoid, som beskrevet i en fersk vurdering av Kelava og Lancaster15, med mest passende klassifisering av formet. Særlig kjent, er tilstedeværelsen av 3D strukturer suggestiv av nevrale rosetter lumen, (sub) ventrikkel soner og rhombic leppe som funksjoner (figur 5 og figur 6) som er identifisert av andre grupper8 , 15 , 16 , 17. siden hvert eksperiment produsert minst én samlet med antatte VZ/SVZs og lillehjernen-assosiert indikatorer (ZIC1, KIRREL2), de er nyttige kriterier for avgjør suksessen for en 3D differensiering med våre protokollen, RL-lignende funksjoner gir ekstra støtte. Utvide lengden på kultur siste 35 dager ble ikke testet, men kan gjennomføres for å fastslå grad av vekst, kompleksitet og modenhet som tillates av denne teknikken.

2D protokollen bruker samme ikke-tilhenger EB dannelse og neural induksjon prosessen som 3D protokoll og så kommentarene ovenfor også gjelder. Når belagt, bør et annet sett med hensyn vurderes. EBs bør følge raskt for cellene å spre utover på platen. Hvis det er problemer med etterlevelse, tillegg av RI (hvis ikke allerede brukes), redusert volum av medium eller eksperimentelle endringer i PLO/LAM konsentrasjon kan brukes. Det er viktig å holde celler fra voksende for tett eller sparsom (fortrinnsvis voksne mellom 20-80% confluency) i brønnene; daglig overvåking og rettidig passaging er viktig å unngå over-confluency eller flytende celler. I motsetning til 3D protokollen, bør det ikke være betydelig die-off under kultur, men det er dårlig vekstområder eller en bremse på spredning priser. Passaging påvirker modning delstaten celler (for eksempel fjerne celleprosesser og utviklet nettverk mellom celler) og bør holdes i bakhodet når du nærmer deg poeng der celler blir samlet eller analysert på noen måte. For eksempel for kalsium er imaging det svært viktig å passering celler mellom 2-6 dager før analyse. Passaging for nært til kan analyse bety celler ikke har hatt tid til å koble og/eller eldre, og også langt kan føre celler overbefolkning, gjør imaging vanskelig. Selv om variasjon mellom eksperimenter kan eksistere, er resultatene konsistente med de rapporterte i første 2D lillehjernen protokoller1,2. ICC flekker og gene expression analyse bekrefte tilstedeværelse av celler positivt for granule cellen merket ZIC1, samtidig identifisere markører knyttet til andre nevrale og lillehjernen identiteter (figur 7 og Figur 8). Kalsium bildebehandling, som innebærer elektrisk stimulering av celler inkubert med fluor5 fargestoff, angitt funksjonelle neuronal aktivitet (figur 9, supplerende figur 1og supplerende figur 2), men det ikke er bekreftet hvis disse var granule celler. Det er arguable at ved å gi celler mer tid å modne ved å forlenge lengden på kultur siste 35 dager, mengden funksjonelle neuronal aktivitet bør øke. Dette potensialet kan utforskes i fremtiden.

I tillegg til linjene av forskning foreslo over, ville det være av interesse å finne forskjeller i produktet identiteter (kvantitet og kvalitet) mellom 2D og 3D protokollene. Betydningen av ytre FGFs ble ikke testet i 2D-protokollen, og det ville være nyttig å vite om mangel på 3D struktur etter plating, og så de tilknyttede signalveier, ville gjøre 2D kulturer mer eller mindre avhengig av de tidlig mønstre forbindelser. Nedstrippet protokoller (f.eksingen RA, BDNF, SAG) er like sannsynlig linjer for videre etterforskning. Til slutt, fremtidige studier kan ha nytte av ny forskningsverktøy å bedre karakterisere (og vurdere generasjon effektiviteten av) human-spesifikke lillehjernen neuronal undertyper.

Med de gitt advarslerne i tankene rapportert både protokoller kan brukes til lillehjernen atskillinger, med produkter til forskjellige formål. De kan fungere som praktisk utgangspunkt for forskere gjennomfører pilotstudier, teste levedyktighet av linjer for slike atskillinger eller som en grunnleggende modell for andre typer målrettet nevrale differensiering.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for Gerbren Jacobs og Jurjen Broeke for deres ekspert teknisk assistanse, til Prisca Leferink for å bidra til generasjon og karakterisering av to kontroll iPSC linjer og Lisa Gasparotto for å vise våre prosedyrer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12+Glutamax Gibco 31331-028 glutamine fortified DMEM/F12
Neurobasal medium Gibco 21103-049 neural basic medium
N2 supplement Gibco 17502-048
B27 supplement Gibco 17504001
Insulin Imgen PT468-B
L-glutamine Gibco 25030-024
Non-essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
beta-mercaptoethanol Gibco 21985-023
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma P3932 aka Poly-Hema
Laminin Sigma L2020
E8 medium and supplement Gibco A1517001 hPSC medium and supplement
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Sodium Chloride Sigma S-5886
y-27632 (ROCK inhibitor) SelleckChem S1049-10mg
DMSO Sigma D-2650
Geltrex Gibco A1413302 hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)
0,5M EDTA Gibco 15575-020
0.2 um filter VWR 28145-77
1.5 mL Eppendorf tube VWR 525-0130
DMEM/F12 Gibco 21331-020
Ethanol VWR 83804360
Parafilm Sigma PM996 wrap for culture plates
cryotubes ThermoFisher 368632
TrypLE Gibco 12563-029 trypsin-based dissociation agent
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) Gibco R-007-100
FGF-2 Peprotech 100-18B
FGF-4 R&D Systems 100-31
FGF-8B Peprotech 100-25
Retinoic Acid Sigma R2625
Brain Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-02
Glial Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-10
Potassium Chloride Sigma P5405
Neurotrophic Factor 3 Peprotech 450-03
Smoothened Agonist (SAG) Cayman 11914 CAS 912545-86-9
Axiovert 40C microscope Zeiss Brightfield imaging microscope
Axiocam Zeiss Brightfield imaging - image aquisition
Eppendorf Centrifuge 5810 Eppendorf 521-0996 centrifuge for cell culture
PBS (gebufferde natrium oplossing) Braun Medical 3623140
5 ml Serological pipets VWR 612-4950
10 ml Serological pipets VWR 612-4951
6-wells culture plates VWR 734-2323
12-wells culture plates VWR 734-2324
hESCs WiCELL line H01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).
  2. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. , Chapter 1, Unit 1H 5 (2012).
  3. Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells. Dev Biol. 290, 287-296 (2006).
  4. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).
  5. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development. Trends Genet. 12, 15-20 (1996).
  6. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).
  7. Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities. Fetal and Neonatal Physiology. , 5th ed, (2017).
  8. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Rep. 10, 537-550 (2015).
  9. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12, 671-678 (2015).
  10. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6, 402-406 (2017).
  11. Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened. Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).
  12. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).
  13. Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  14. Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129, 1435-1442 (2002).
  15. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).
  16. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).
  17. Englund, C., et al. Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J Neurosci. 25, 247-251 (2005).
  18. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, 782-789 (2011).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 130 3D organoid pluripotent stamceller lillehjernen granule celle cortex
Strømlinjeformet 3D lillehjernen differensiering protokoll med valgfri 2D modifikasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holmes, D. B., Heine, V. M.… More

Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification. J. Vis. Exp. (130), e56888, doi:10.3791/56888 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter