Summary
本文详细介绍了在培养人类胎儿脑神经干细胞的方法, 以及如何将它们区分成各种神经元亚型和星形胶质细胞, 重点是利用神经干细胞研究 Zika 病毒感染。
Abstract
人胎脑神经干细胞是一种独特的非基因修饰的模型系统, 研究各种刺激对人类发育神经生物学的影响。而不是使用动物模型或基因修饰的诱导多能细胞, 人类神经干细胞提供了一个有效的体外系统, 以检查治疗效果, 筛选药物, 或检查个体差异。在这里, 我们提供了详细的协议, 用于扩展人类胎儿脑神经干细胞在无血清培养基中的培养, 通过不同的启动程序将它们分化成各种神经元亚型和星形胶质细胞, 并进行冷冻和恢复这些细胞。此外, 我们描述了一个使用人胎脑神经干细胞研究 Zika 病毒感染的过程。
Introduction
Zika 病毒 (ZIKV) 是一种黄传播的性行为, 或由蚊子媒介的伊蚊蚊和白纹伊蚊蚊子。ZIKV 最近被认为是一个严重的公共卫生威胁, 由于其易于传播和附属神经系统症状1。其中一个最有关的神经效应是发育的小头在胎儿出生的孕妇感染的母亲2,3。小头是一种神经发育障碍, 在胎儿发育和出生时, 其头部小于典型的大小, 周长低于平均4的2标准偏差。较小的头围通常伴有各种并存, 如发育迟缓、癫痫、视力和听力丧失以及喂养困难。
最近的研究使用动物模型或诱导多能干细胞来研究 ZIKV 感染对神经的影响5,6,7,8。虽然这些研究有助于我们对 ZIKV 的认识, 但使用不同物种或基因修饰的细胞可能会耗费时间和/或增加可能混淆 ZIKV 对开发神经细胞的影响的其他变量5,6,7,8. 然而, hNSC 文化的困难, 特别是本协议中描述的非粘附干细胞文化, 是文化对用于进行区域性9的方法非常敏感。培养基成分的任何变化, 甚至培养容器的物理处理, 都足以引起细胞9的反应。为了解决这些问题, 我们开发了一个体外人胎儿脑源性神经干细胞 (hNSCs) 培养机械询问 ZIKV 对胎儿神经干细胞的影响。使用我们的方法, hNSCs 保持超过80通道没有明显的表型变化10。此外, 染色体的改变, 如体是无或最小的11。这种 hNSC 文化成长为一种非附着的干细胞文化。球的一个优点是, 球体在文化中创造了一个独特的环境生态位, 比起二维区域性9更能反映在体内的利基。该协议的另一个优点是可以从 hNSC 文化中获得多种细胞类型, 从而使调查人员能够观察给定变量对 hNSC 生存和分化的影响。本议定书适用于寻求回答有关中枢神经系统发育或功能障碍的机械问题的个人。下面的协议描述了如何扩大 hNSC 的文化感染与 ZIKV, 并随后区分 hNSCs, 以观察感染的影响, 分化过程。它还包括存储 hNSCs 用于长期使用的方法, 并将 hNSCs 分化成各种类型的神经元, 以便进一步调查 ZIKV 引起的大脑畸形的缺陷11。我们相信, 这项议定书也有兴趣, 调查人员试图了解任何环境刺激, 如感染或毒素对神经干细胞的生存和分化的影响。
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Protocol
人神经干细胞最初是从废弃的人胎儿皮质在第一个孕期12中获得的。所有的协议程序都遵循德克萨斯大学医学分会关于人体组织样本使用的伦理准则, 而细胞系则由机构生物安全委员会批准。
1. 培养基制备和干细胞回收
- 在步骤 1.1. 1-1.1. 5 中, 将试剂合成培养基 (DFHGPS)。
- 添加210毫升的 Dulbecco 氏改良鹰培养基高糖和 l-谷氨酰胺 (D)。储存在4˚C。
- 添加70毫升的火腿的 F12 营养混合物 l-谷氨酰胺补充剂 (F)。储存在4˚C。
- 添加4.2 毫升的 15 mM HEPES 缓冲区 (H), 并将其存储在室温下。
- 添加4.2 毫升的 10% d-葡萄糖溶液 (G), 并将其存储在室温下。
- 添加2.88 毫升青霉素/链霉素 (PS) 解决方案。分的股票解决方案成3毫升等分和存储等分在-20 ° c, 直到需要。
注: 培养基中青霉素的最终浓度为100单位/毫升, 链霉素浓度为100µg/毫升。这一媒介将被称为 DFHGPS 的协议的其余部分, 应储存在4° c 1-2 周内使用。如果需要, DFHGPS 可以按比例缩放。
- 在细胞被恢复的前一天, 外套一个 T75 烧瓶与5毫升被适应的媒介, 从早先文化 hNSC 细胞线获得, 并且在一个37° c 孵化器中留下以8.5% 二氧化碳 (CO2) 隔夜。
注意: 如果目前培养 hNSCs, 保存细胞在培养基变化中生长的培养基。这是条件介质, 因为它已经被细胞 "条件"。被条件的媒介可以被保存在一个螺丝盖帽管子和存放在4° c 大约7天。联系相应的作者以接收 hNSCs。条件培养基是首选, 但不是绝对必要的, 特别是当第一次启动文化 hNSCs。 - 恢复的一天, 温暖20毫升的 DFHGPS 在一个50毫升的螺丝帽管在一个37° c 水浴至少10分钟, 并保持它在水浴, 直到准备使用。
- 在一个单独的15毫升螺旋帽管, 温暖10毫升的 DFHGPS 在37° c 水浴至少10分钟, 并保持它在水浴, 直到准备使用步骤1.13。
- 检索冰容器和所有中型组件 (表 1)。解冻所有的介质成分在冰上, 让他们在冰上, 而准备中的变化。
- 获得5毫升的条件中等库存 (储存在4° c), 并保持在一个37° c 水浴, 直到准备使用步骤1.14。如果没有条件的培养基或当前人类胚胎神经干细胞培养, 请参见步骤1.2。
- 从步骤1.3 中检索50毫升螺旋帽管, 并将其放置在生物安全柜 (BSC) 中。将10毫升的 DFHGPS 转化为新的15毫升螺旋帽管, 然后将50毫升的管中含有剩余的10毫升的 DFHGPS 介质放回37° c 的水浴中。
- 得到一个冷冻的 hNSCs 储存在液氮中的小瓶。如果没有当前人类胎儿神经干细胞培养, 请参阅步骤1.2 后的注意事项。
注: 人类神经干细胞最初来源于废弃的人类胎儿大脑12 , 在没有遗传修改的情况下保存在文化中10。5 x 106单元格应在 T75 瓶上解冻和电镀。每个冷冻瓶应包含 5 x 106细胞;因此, 每瓶一瓶是需要的。 - 在37° c 水浴中解冻一小瓶细胞, 每十年代大约1分钟或直到冰融化, 瓶子的内容完全是液态的。不要将整个瓶子浸入水中以避免潜在的污染。
- 在 BSC 中, 使用 P1000 微吸管吸取解冻的细胞溶液, 并添加到15毫升管从步骤 1.7, 包含10毫升的 DFHGPS。要添加解冻的细胞溶液滴-明智的, 慢慢地按下柱塞, 以便只有一滴或两次释放一次。同时, 漩涡15毫升管, 让一个快速的混合物。
- 在室温下离心 200 x g 的5分钟的细胞悬浮液。丢弃上清液, 确保保持细胞颗粒。
- 在步骤1.11 中, 从步骤1.7 中检索包含剩余 10 ml 的 50 ml 管。离心后, 重10毫升 DFHGPS 中的细胞颗粒, 再在室温下离心 200 x g 5 分钟。
- 在最后的旋转过程中, 通过以下表 1来准备新的增长介质, 将增长因子添加到 BSC 中的步骤 1.4 (表 1) 中的 10 mL DFHGPS 介质中。将含有生长因子的新培养基留在平衡计分卡中, 直到准备好使用。
- 从步骤1.2 中取出 T75 烧瓶, 并通过抽吸将条件介质涂在烧瓶中。然后在步骤1.6 中添加 5 mL 条件介质。用一个血清学吸管对烧瓶。小心不要把瓶子的底部划伤。
- 从离心机中取出细胞管, 通过吸气去除上清液, 使细胞颗粒完好无损。
- 重细胞颗粒在10毫升新媒体从步骤 1.13, 使用5毫升血清吸管和移几次。将悬浮液添加到1.14 步的涂层 T75 烧瓶中。使用其余的5毫升冲洗的管, 包含细胞颗粒, 然后添加那些5毫升的烧瓶, 以及。
- T75 瓶来回晃动3次, 以确保细胞均匀分布在烧瓶中。确保瓶子的盖子松动以允许气流流动。在光显微镜下观察细胞, 做笔记, 并在可能的情况下拍摄图像。
注意: 细胞应该看起来半透明和球形。如果有细胞看起来暗, 不透明, 或有不对称的寄宿生, 因为这可能表明细胞死亡。也要注意任何真菌或细菌污染, 如媒体变成黄色的颜色。 - 放置在一个37° c 孵化器与 8.5% CO2的细胞烧瓶。
注: 使用8.5% 而不是 5.0% CO2在 7.1-7.4 的范围内保持此无血清培养基的 pH 值。
2. hNSC 介质变化
注: 每3-4 天更换介质。
- 打开平衡计分卡, 彻底清洁70% 乙醇。在光显微镜下观察细胞。
注意: 对单元格和球体大小的外观进行注释。在恢复或通过后三天, 细胞将聚集在一起, 开始形成非附着的球。
注意: 如果细胞黏附在烧瓶的底部, 细胞黏附将会增加过早分化, 细胞将无法维持干细胞的状态。如果烧瓶中有太多的细胞, 细胞可能形成大的球体 (直径大于2毫米), 在这种情况下, 球体中心的细胞将开始分化, 因为在培养基中无法获得生长因子。如果观察直径大于1毫米的球体, 细胞可以传代 (步骤 3.1-3.22)。 - 按照步骤1.4 和 1.5, 并准备10毫升的新鲜培养基 (见步骤 1.13)。
- 倾斜烧瓶的侧面, 使球下沉到瓶底。
- 使用5毫升的血清吸管从池顶移除5毫升有条件的培养基, 注意不要吸入任何球。将5毫升的条件介质放入干净的15毫升管中。
- 从烧瓶中取出额外的5毫升有条件的介质, 再次小心地避免球体, 并将5毫升放入相同的15mL 管中。
- 添加10毫升的新媒体从步骤2.2 到其余5毫升的条件媒体和细胞的烧瓶。将烧瓶放平, 在光显微镜下观察细胞。
- 如果出现细胞在条件培养基的收集过程中被吸气, 在室温下旋转 100 x g 的条件介质为5分钟。在1毫升的条件培养基中再悬浮在底部积聚的任何细胞, 然后将它们加入培养瓶中。
- 存储10毫升未使用的条件媒体从步骤 2.5/2.6 在4˚C 在15毫升螺旋帽管。
- 重复步骤 1.17/1.18。
3. hNSC 通道
注: 如果细胞正常生长, hNSCs 应每9-11 天通过一次, 因为人口加倍的时间约为3天,13。
- 如果将神经干细胞扩大到一个新的烧瓶, 确保所有新的烧瓶都涂在步骤1.2。
- 在步骤2.1 中清洁 BSC, 并执行步骤1.4 和1.5。
- 在步骤1.13 中准备介质。每个 T75 瓶需要10毫升的培养基。对于多个 T75 烧瓶, 乘以10毫升的培养基数瓶。
- 准备1或3毫升的 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (dPBS) 和葡萄糖, 并放置在37° c 水浴, 以温暖10分钟 (对于胰蛋白酶溶液) 根据表 2中的卷。此时不要添加胰蛋白酶或 dnasei。dnasei 可能需要打破从死细胞释放的任何 DNA 由于机械或化学细胞离解。
注: 对于一个 T75 烧瓶传代在9-10 天的增长后, 将有大约 30 x 106细胞, 如果 5 x 106最初在烧瓶上播种。通常, 1 毫升的 dPBS 解决方案用于 10 x 106单元格。因此, 9-10 天后 T75 烧瓶传代需要3毫升的 dPBS 溶液。 - 把干净的小重量船和例在胡德。清洁与70% 乙醇和允许空气干燥在敞篷大约5分钟。
注: 重量船将用于步骤3.17.1。 - 取回从孵化器传代的细胞, 并将其带入 BSC。倾斜烧瓶轻轻地让细胞下沉到池底的媒体。瓶子里有大约15毫升的培养基。
- 在5毫升的部分 (即5 毫升 + 5 毫升) 中去除大约10毫升的介质。将这10毫升的介质放入一个干净的15毫升管中, 标有 "CM" 为 "条件介质"。注意不要吸入在瓶中剩余的5毫升培养基中的任何细胞;这些细胞和5毫升的介质将受到步骤3.8。
- 采取3毫升的条件媒体从 "CM" 管 (从步骤 3.7) 和地方成一个15毫升管标签 "胰蛋白酶抑制剂解决方案"。这将在步骤3.12 中使用。去除3毫升后, 有7毫升的条件介质留在 "CM" 管。将 "CM" 管放在一旁直到步骤3.9。
- 去除5毫升的培养基和细胞残留在 T75 烧瓶, 并放置在一个干净的15毫升管标记 "细胞"。
- 采取 "CM" 管含有7毫升条件介质 (从步骤 3.7.1) 和冲洗 T75 瓶底部两次与3.5 毫升的条件媒体, 使用5毫升血清吸管。每次冲洗后, 将3.5 毫升部分放入 "细胞" 管中。这一步的目的是从 T75 烧瓶中去除所有的球 (细胞)。
- 在室温下将 "细胞" 管在 100 x g 离心5分钟。当细胞旋转, 获得 dPBS/葡萄糖溶液从37° c 水浴和添加适量的胰蛋白酶和 dnasei 根据表 2。
- 在 "细胞" 管停止旋转后, 取出所有条件中上清液并转移到 "CM" 管。
- 采取的管标 "胰蛋白酶抑制剂解决方案" 从步骤3.7.1。并添加在表 3中所示的胰蛋白酶抑制剂的体积。使用相同体积的胰蛋白酶抑制剂溶液, 用于胰蛋白酶溶液。
- 在37° c 水浴中放置胰蛋白酶抑制剂溶液直到需要。
- 在15毫升管和吸管中加入胰蛋白酶溶液, 用5毫升吸管向上和向下大约5-10 次。关闭管帽, 在37° c 水浴中孵育5分钟。5分钟后, 取出细胞和吸管向上和向下5-10 次。然后孵育在37° c 水浴为另外10-15 分钟。
- 在最后5分钟, 移动胰蛋白酶抑制剂溶液的 BSC。
- 在步骤2.14 完成后检索单元格, 并将细胞向上和向下移至完全分离的球体 (20-30 次)。然后立即添加胰蛋白酶抑制剂溶液和吸管向上和向下10次。这种离解细胞和胰蛋白酶抑制剂的解决方案将被称为 "细胞悬浮"。
- 按以下步骤计算单元格挂起中的单元格数。
- 吸管15µL 的台盼蓝预拌 (含5µL 0.4% 台盼蓝和10µL dPBS) 到一艘小重量船上, 然后加入5µL 的细胞悬浮。吸管上下3-5 次混合。然后, 吸管10µL 的台盼蓝/细胞悬架到两侧的例覆盖的玻璃片。
- 观察光镜下的细胞, 计算四角网格中每一个细胞的总数量。将这些数字相加。
- 重复计数的另一侧和平均双方在一起。
- 将此数字乘以 1万, 以使每个 mL 的单元格总数。将这个数乘以毫升的总数来计算细胞悬浮的总细胞数。计算每 T75 瓶种子500万细胞需要多少细胞悬浮液。
注意: 通常, 在9-10 天后, T75 将有 25-30 x 106单元格。因此, 如果将所有的细胞传代成新的烧瓶, 总共需要5-6 烧瓶。 - 将步骤3.19 中计算的单元悬浮容积添加到每个 T75 烧瓶中, 以获得每瓶 5 x 106单元格。如果体积小于5毫升, 添加额外的条件培养基, 以弥补总共5毫升。然后添加10毫升的新的 DFHGFPS 媒体包含生长因子 (表 1) 的烧瓶。
- 重复步骤1.17 和 1.18, 确保烧瓶中的单元格类型、日期、烧瓶中的单元格数和通道数 (这是单元格被传代的次数)。然后移动到步骤4-9。
- 如果需要, 种子额外的细胞到一个 T75 烧瓶在密度高达 30 x 106每瓶一夜, 并冻结第二天根据步骤4。
4. hNSC 冷冻和贮存
- 传代后的一天, 从孵化箱中提取出含有冷冻细胞的烧瓶 (从步骤3.19 和 3.22)。倾斜的烧瓶, 并删除所有的培养基和细胞从烧瓶和地方在一个15毫升的管。然后离心管在 216 x g 为5分钟。
- 在离心过程中, 准备冷冻培养基 (表 4)。为每 5 x 106细胞准备1毫升的冷冻培养基。在确定每个烧瓶中放入多少单元格时, 步骤3.19 中确定了单元格的个数。这个数字不会在一夜之间改变。
- 用细胞名称、通道号、细胞号、缩写和日期等标签来准备冷冻保存的小瓶。离心后, 在冷冻培养基中通过吸入和再悬浮细胞颗粒去除上清液, 使其有 5 x 106细胞/毫升。使用5毫升吸管, 分1毫升每瓶和密封紧密 (5 x 106细胞每瓶)。
- 用250毫升异丙醇 (最大用量为每取代异丙醇5次) 将小瓶放在冷冻保存容器中。贮存在-80 ° c 冷藏箱过夜, 然后再转移到液氮储罐系统。
5. 电镀附着 hNSC 验证
- 前一天传代 (步骤 3.1-3.22), 清洁 BSC, 在步骤 2.2, 并获得24井板和无菌玻璃 12 mm 片。
- 使用镊子, 在板的每个井的底部放置一个单一的片。
- 在无菌水中, 用0.01% 多聚 d-赖氨酸 (PDL) 覆盖含盖卡瓦的井, 在37˚C 孵育1小时。对于一个24井板, 使用250μ l 的 PDL 每井。
- 从井中取出 PDL, 然后用1µg/厘米2层粘连蛋白/dPBS (每井250μ l) 进行涂层。在37° c 的夜间孵育盘。如果不需要第二天, 密封板与膜包装的膜周围的边缘的板块和存储在4° c。
注: 涂覆层粘连蛋白的钢板可贮存长达2周, 如果用膜密封, 只要盖板不干即可。 - 如步骤 3.1-3.22 所描述的通道细胞, 然后确定的细胞数量, 以种子进入 24-井板与涂层片。
- 从井中取出任何多余的层粘连蛋白溶液, 再用0.5 毫升的 dPBS 冲洗一次。然后将种子细胞放入井中, 密度为 0.6-1 x 105细胞/cm2 。根据步骤 3.16-3. 21 使用任何剩余单元格。
- Atvarious 时间在24井板块培养, 修复和染色细胞的各种干细胞标记后, 步骤9。
6. 启动获得 GABA 和谷氨酸神经元
- 通过 3.1-3.22 中所描述的细胞, 然后确定在步骤5.6 中种子进入24井板的细胞数量。
- 在启动前的前一天, 如步骤 5.1-5.4 所述, 准备盖子卡瓦和涂层板。
- 在启动日, 取回含有2-3 天细胞的烧瓶。放置在15毫升管和颗粒的细胞由离心在 100 x g 5 分钟。
- 根据表 5, 准备表皮生长因子/白血病抑制因子/层粘连蛋白启动培养基。
- 重细胞与培养基。
- 种子悬浮细胞进入一个24井板 (跟随步骤 5.6)。
7. 启动获得运动神经元
- 按照步骤 6.1-6.4。
- 根据表 6, 准备碱性成纤维细胞生长因子/肝素/层粘连蛋白 (FHL) 启动培养基。
- 按照步骤5.6。
8. Zika 病毒感染
注: ZIKV 对温度高度敏感, 因此 ZIKV 储存在-80 ° c 时势在必行, 避免了冻融循环。继续在冰上工作等分。
- 如步骤 3.1-3.22 所述的通道细胞。总共需要3-4 百万的细胞来播种一个24好的盘子, 因此当传代时, 把感染所需的细胞数量和在传代中播种。
- 如果将细胞播种到24井板进行染色, 根据步骤 5.1-5.4 准备片和板材。
- 在传代后, 将1毫升的细胞悬架从步骤8.2 到1.5 毫升离心管, 并离心在 200 x g 在室温下为5分钟。然后用抽吸去除清液。
- 重颗粒从步骤8.3 在 ZIKV 的股票, 以获得一个多样性的感染 (莫伊), 无论是1到10。ZIKV 溶液的体积不应超过0.5 毫升。对于模拟治疗 (控制细胞), 重细胞在相同的体积和类型的培养基中使用的 ZIKV 股票。
注: ZIKV 库存准备和感染在以前的出版物11中进行了详细介绍。模拟感染也用培养基进行。 - 在37° c 以上的 ZIKV 混合物上孵育 1 h. 倒置管2-3 次, 然后离心混合物在室温下为5分钟, 在 216 x g 处获得细胞颗粒。重颗粒在 dPBS 和离心机再次为5分钟在室温 216 x g。
- 通过吸入去除上清, 用适当的培养基重细胞, 并将受感染的细胞装入实验所需的烧瓶或盘子中。如果在12毫升的适当培养基中将细胞播种到一个24重的板上, 然后在每个井中加入500μ l 悬浮液。
注意: 在这一点上, 要么保持生长培养基中的细胞观察 ZIKV 对干细胞的影响, 要么去步骤6或 7, 研究 ZIKV 对分化过程的影响。
9. 染色程序
- 要固定细胞, 取出培养基, 用0.5 毫升 (24 井板) 的冰冷磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗一次。
- 去除 pbs, 并在 pbs 中覆盖0.5 毫升4% 甲醛的细胞, 在室温下保持20-30 分钟。
- 去除甲醛和冲洗细胞三次与0.5 毫升 pbs, 离开第三 pbs 冲洗10分钟的室温。
- 在这一点上, 要么离开 PBS 过夜, 储存在4˚C 的盘子, 或开始染色后, 10 分钟冲洗。
- 在10分钟 PBS 冲洗后, 用0.5 毫升5% 正常山羊血清 (NGS), 0.3% 牛血清白蛋白 (BSA), 0.25% X-100 在三缓冲盐水 (TBS) 的固定位置阻断细胞45-60 分钟。例如, 使1毫升的阻断溶液使用:10 µL 25% 海卫 X-100, 50 µL 100% NGS, 100 µL 3% BSA 混合840µL 的 TBS。
- 在阻断步骤, 准备主抗体溶液, 确保所有的试剂都保持在冰上。为了验证 hNSCs, 蛋白质, 如巢可以使用适当的抗体针对它们。要验证 ZIKV 感染, 请使用抗 ZIKV 外壳蛋白抗体11。为区别, 使用标记例如类 III β-蛋白辨认神经元人口, 而胶质纤维酸性蛋白质 (胶蛋白) 可以用于辨认星形胶质细胞。主要抗体的浓度根据供应商和批次的经验确定。我们使用了大多数抗体从1:100 到1:2000 稀释。
- 离心机主抗体在 1.2万 x g 为2分钟在4° c, 然后做稀释;如要使1:1000 的抗体稀释, 可在 TBS 中将7.2 µL 的抗体加入7.2 毫升的0.25% 海卫 X-100。
- 将大约300µL 的抗体溶液添加到24个井板的每一个井中, 并在室温下或在固定位置上一夜之间在4˚C 的静止位置孵育具有主抗体的细胞。
- 在孵化后, 在室温下用0.5 毫升的 TBS 洗涤细胞三次, 每在一个固定的位置10分钟。
- 离心第二抗体在 1.2万 x g 为2分钟在4° c, 然后稀释在0.25% 海卫 X-100/TBS 解答。使足够的抗体溶液, 以增加300µL 每井。这里, 稀释荧光二级抗体 1:500 (图 3)。
- 在最后的 TBS 洗涤之后, 增加300µL 二次抗体解答对每井并且在黑暗孵育在 1 h 在室温在一个固定位置。从这一点上, 所有的步骤必须发生在一个黑暗的房间。
- 用 TBS 洗涤细胞三次, 每个固定位置10分钟。
- 在最后10分钟洗涤期间, 稀释核标记 DAPI 核污点到推荐的集中在 TBS (典型地 1:1, 000-1:5, 000)。使足够的解决方案, 以增加300µL 每井。
- 最后一次洗涤后, 将300µL 的 DAPI 溶液添加到每个井中, 并在室温下孵育5分钟以固定位置。然后用0.5 毫升的 TBS 洗一次。
- 使用防褪色安装介质的荧光和1滴 (10-15 µL) 每片将放在幻灯片上。小心地用镊子将片从24井板井中取出, 并将细胞表面放在滑动的安装介质上。
- 将片放在幻灯片上后, 将幻灯片放在平面滑轨托架中。确保标签的幻灯片将所有相关的信息, 需要识别的细胞在该幻灯片上, 然后覆盖的持有人铝箔, 以保持幻灯片保护免受光。
- 将幻灯片存储在4˚C, 并允许安装介质在一夜之间凝固。第二天, 观察幻灯片使用 epifluorescent 显微镜与 UV-2E/C 过滤器 (340-380 nm), GFP HYQ BP 过滤器 (450-490 nm), 或 Y-2E/C 得克萨斯红色过滤器 (540-580 nm), 20X 放大倍数。
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Representative Results
培养的 hNSCs 在他们的增殖阶段将增长作为非黏附球 (图 1)。紧接在 hNSC 通道之后, 将会有许多单独的单元格, 它们将在接下来的几天内聚集并开始形成球体 (图 1A和1B)。健康的球体应该是大约1-2 毫米直径的9-10 天后的通道 (图 1C)。直径大于2毫米的球体会形成一个暗中心, 培养基中的生长因子将无法到达球体中心的细胞, 导致不必要的分化。健康的球体会出现半透明, 并在球体的边缘 (图 1C) 上显示伪纤毛。
在附着面上电镀球染色的目的将导致附着球体的生长 (图 2A)。这些球体将触及培养容器的表面, 并在保持一个中心球体 (图 2A) 的同时, 在容器表面延伸出一些突起。细胞的启动和分化要求细胞黏附在细胞培养板底部的盖子滑动, 例如24井板。在适当的启动步骤和加入分化培养基之后, 细胞将在培养容器的表面上扩散, 并作为相互连接的单层细胞生长 (图 2B)。
为了证实 hNSC 培养或分化细胞表型的有效性, 可以采用荧光免疫组织化学方法。巢是一种通常在神经干细胞中表达的中间灯丝, 可用于验证 hNSC 区域性 (图 3A)。为了验证分化后神经元的存在, III 类β-蛋白通常可以用来标记神经元 (图 3B)。虽然启动步骤是用来达到较高的百分比神经元后分化, 仍将有星形胶质细胞在文化。胶质纤维酸性蛋白(胶质蛋白) 可用于对星形胶质细胞进行标记, 以量化哪些百分比的分化单元成星形胶质或神经元。
我们发现, K048 线神经干细胞被感染的非洲和亚洲菌株的 ZIKV 检测荧光染色与特定 ZIKV 抗体。代表图像显示在图 4中。模拟感染没有引起 hNSC 形态学或生存率的变化 (图 4A, 4C)。ZIKV 倾向于留在感染细胞的外围区域一天后, 1 小时的感染, 但填补整个细胞在3至7天 (图 4B, 4D, 4E)。明显地, 与相同的莫伊 (0.1), 估计5% 感染率的 K048 细胞是大大低于最近报告的 ZIKV 感染率 (高达 80%) 在人类皮肤诱发神经干细胞7。这项研究, 报告80% 传染性, 使用的原型非洲菌株的 ZIKV (MR766), 可能已经适应了神经表型在140多个通道的小鼠脑细胞。
图 1: hNSC 文化的明亮字段图像.(A-C)在传代1、4和9天的 hNSC 培养基上分别有代表性的明亮场图像。缩放栏:60 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 粘附区域性的明亮字段图像.(A) 在镀后7天内, 以10X 放大的贴附 hNSC 文化为代表的明亮的现场图像。(B) 具有代表性的明亮的现场图像, 在10X 放大后的粘附分化细胞, 在启动和9天的分化。缩放栏:60 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: hNSCs 和差异化文化的荧光图像.(A) 具有代表性的荧光图像, 在20X 放大的贴附 hNSCs 染色的核标记, DAPI (蓝色), 和干细胞标记巢(红色)。比例栏:60 µm (B) 有代表性的荧光图像, 在60X 放大的分化细胞染色的神经标记βIII-蛋白 (绿色), 星形胶质蛋白 (红色), 和核标记 DAPI (蓝色)。缩放栏:10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 人类胎儿脑源性神经干细胞 ZIKV 感染.人神经干细胞不是模拟治疗 (A 和 C), 接种1小时与非洲血统菌株的 ZIKV 在莫伊的 0.1 (B 和 D), 或与亚洲菌株 ZIKV 最近从蚊子在墨西哥 2016年 (E)。荧光染色检测神经干细胞中 ZIKV 抗体的标记, 在一个到七天后接种 (1 dpi 在 B, 7dpi 在 D, 3 dpi E)。缩放条形图10µm, 在 E. 中为5µm,请单击此处查看此图形的较大版本.
| DFHGPS 媒体为一个 T75 | 10毫升 |
| 卟* | 173µL |
| 200毫米 l-Glutamin | 50µL |
| 10毫克/毫升胰岛素 ** | 25µL |
| 20µg/毫升表皮生长因子 | 10µL |
| 20µg/毫升碱性成纤维细胞生长因子 | 10µL |
| 10µg/毫升白血病抑制剂因子 | 10µL |
| 5毫克/毫升肝素 | 10µL |
| * 含有100µg/毫升转铁蛋白、100µM putresine、20 nm 黄体酮和 30 nm 亚硒酸钠的混合物。 混合物由集中的存货, 并且等分被存放在-80 ° c 和 preferablly 使用在6星期之内准备。 集中储存的是10毫克/毫升转铁蛋白, 30 毫米腐, 10 µM 黄体酮和15µM 亚硒酸钠储存在-80 ˚C。 | |
| ** 胰岛素被溶解在 0.01 N hydroen 氯化物, 过滤通过0.2 µM 低蛋白结合过滤器, 并存储在4˚C 6 周。 | |
表 1: 新增殖培养基的生长因子。
| dPBS * | 1 mLa | 3毫升b |
| 10% 葡萄糖 | 60µL | 180µL |
| 2.5% 胰蛋白酶 | 10µL | 30µL |
| dnasei ** | 5µL | 15µL |
| * Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 | ||
| ** Deoxyribonuclease | ||
| a用于1000万单元格 | ||
| b用于3000万单元格 | ||
表 2: 胰蛋白酶的制备。
| 条件媒体 | 1 mLa | 3毫升b |
| 胰蛋白酶抑制剂 | 10µL | 30µL |
| a用于1000万单元格 | ||
| b用于3000万单元格 |
表 3: 胰蛋白酶抑制剂的制备。
| DFHGPS * | 0.7 mLa | 2.1 毫升b |
| FBS ** 20% | 0.2 毫升 | 0.6 毫升 |
| 亚砜 ** 10% | 0.1 毫升 | 0.3 毫升 |
| * DMEM, F12, HEPES, 葡萄糖, 青霉素-链霉素 | ||
| ** 胎牛血清 | ||
| 二甲基亚砜 | ||
| a用于一个小瓶中的500万单元格 | ||
| b用于三小瓶、500万细胞/小瓶 | ||
表 4: 冻结介质的制备。
| DFGHPS * 为24井板中的一井 | 1毫升 |
| 卟 ** | 17.3 µL |
| 200毫米 l-谷氨酰胺 | 5µL |
| 10毫克/毫升胰岛素 | 2.5 µL |
| 20µg/毫升表皮生长因子 | 1µL |
| 10µg/毫升白血病抑制因子 | 1µL |
| 1毫克/毫升层粘连蛋白 | 1µL |
| * 含 DMEM、F12、HEPES、葡萄糖、青霉素-链霉素 | |
| ** 含100µg/毫升转铁蛋白, 100 µM putresine, | |
| 20纳米黄体酮和 30 nm 亚硒酸钠 | |
表 5: 制备培养基。
| DFGHPS * 为24井板中的一井 | 1毫升 |
| 卟 ** | 17.3 µL |
| 200毫米 l-谷氨酰胺 | 5µL |
| 10毫克/毫升胰岛素 | 2.5 µL |
| 20µg/毫升碱性成纤维细胞生长因子 | 0.5 µL |
| 5毫克/毫升肝素 | 0.5 µL |
| 1毫克/毫升层粘连蛋白 | 1µL |
| * 含 DMEM、F12、HEPES、葡萄糖、青霉素-链霉素 | |
| ** 含100µg/毫升转铁蛋白, 100 µM putresine, | |
| 20纳米黄体酮和 30 nm 亚硒酸钠 | |
表 6: FHL 启动介质的制备。
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Discussion
培养和操纵 hNSCs 的能力提供了一个关键的工具, 可用于各种目的从建模人类疾病到高通量药物筛选10,11,12,14, 15、16、17。许多问题仍有待解决, 如人胎脑神经干细胞或其子代如何易受 ZIKV 感染, 不同的 ZIKV 菌株是否会以同样的效率感染干细胞, 以及神经系统发育过程中的感染如何导致小头。我们使用此 hNSC 区域性来调查 Zika 病毒关联的神经病11,14。通过使用三个个体捐献者的三株细胞, 我们也能够比较个体差异与 ZIKV 感染后观察到的神经性缺损的敏感性11。这项技术的一个局限是 hNSC 样品的可及性, 以及对适当的文化至关重要的条件培养基。为了绕过这一障碍, 请与相应的作者联系, 安排一个物质转移, 因为在这个协议中使用的单元不是商业可用的。
体外使用 hNSCs 的研究不仅提供了对基本干细胞行为的独到见解, 还为进行临床前期研究提供了良好的平台。然而, 培养 hNSCs 的技术挑战可以作为一个障碍, 使用它们作为有效和可重复的模型。在本议定书中, 我们概述了一些关键步骤和方法, 可用于减少培养方法的变异性, 并产生健康和稳定的 hNSC 干细胞培养。使用 hNSC 干细胞文化的缺点是, 细胞对任何刺激都非常敏感。即使有了上述详细的协议, 重要的是要密切注意 hNSCs 的烧瓶或菜肴的处理, 因为微妙的变化, 在协议可以导致变化的干细胞行为。
本方法最关键的部分是生长因子的鸡尾酒和不同培养基的制备。如果 hNSC 文化的加倍时间是非常低的, 或许多细胞 adherie 到文化船 (当他们应该是不附着的), 第一步是保证使用的成长因素是适当的集中, 并且不过期。本议定书的所有生长因子都有一个非常短的保质期, 一旦解冻 (5-6 天)。此外, 我们还利用了来自多家公司的增长因素, 并注意到维持文化所需的质量和集中的差异。因此, 我们强烈建议使用材料表中详细描述的精确增长因子。传代步骤 (步骤 3.1-3.22) 也是常见的错误来源。如果有许多死细胞在离解过程之后, 减少移的次数向上和向下离解细胞, 因为太多的物理离解可能导致细胞死亡。或者, 如果有许多细胞群在离解步之后, 增加移的活力或次数向上和向下, 因为这些星团将很快成为大球体, 将无法保持在文化中的可行性。如果文化得到适当的维护, 感染与 ZIKV 是相对简单的。
虽然 ZIKV 感染是本议定书中详述的治疗方法, 但可以使用这种 hNSC 文化系统进行广泛的研究。该模型系统可用于筛选药物, 检查个体易感性, 并调查各种疾病和发育障碍的基本机制14。这一系统也是理想的基因组研究, 因为培养细胞没有被基因操纵和显示很少到没有染色体异常, 甚至多达80通道10,11。我们相信这种培养体系是理想的模拟体外如何环境刺激, 如感染, 药物, 酒精, 毒素等, 可以影响神经系统的发展。
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Disclosures
作者没有利益冲突声明。
Acknowledgments
这项工作得到了来自邓恩基金会和德克萨斯大学医学分会 (p.w) 人类感染和免疫研究所的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission - Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
