小鼠骨髓胰岛移植的一种方法
Summary
介绍了一种小鼠胰岛外移植的方法。分离的胰岛与水凝胶混合, 混合物放入糖尿病小鼠的小袋中。然后对血糖进行监测, 并进行免疫组织化学分析。
Abstract
胰岛移植已被提出为1型糖尿病的潜在治疗方法。最近令人信服的证据表明, 血管内胰岛输注远不理想, 因此, 动量正在重新成为胰岛移植的潜在有价值的部位。这个实验需要隔离高质量的胰岛和植入胰岛的糖尿病患者。移植到动量需要手术步骤, 可以更好地显示视觉。在此, 将介绍此过程的详细步骤。本文介绍了将分离的胰岛与水凝胶混合后再将其放入糖尿病小鼠的小袋中的两种方法。不同的条件下使用不同的水凝胶。对糖尿病小鼠共症胰岛患者的血糖水平进行了长达35天的监测。一些动物在14天后被牺牲进行免疫组织化学分析。这种临床移植前的方法可以作为初步数据, 导致转化为临床移植。
Introduction
根据国际糖尿病联合会 (idf) 的数据, 糖尿病目前影响到3.82亿人, 预计到 2035将增加到5.92亿人。在异基因和异基因胰岛移植中, 全身免疫抑制治疗是必要的。如果没有免疫抑制, 免疫排斥是移植物丢失的主要原因2。由于即时血液介导的炎症反应 (ibmir)3,4, 也存在移植胰岛丢失的重大问题。然而, 即使在没有免疫反应的情况下, 如在联合或自动移植模型中, 通过门静脉移植到肝脏的胰岛细胞也会因为炎症和/或血液不好等不利的环境条件而丢失提供较低的氧合和/或营养成分5,6。因此, 为了确保长期的代谢功能, 更高的胰岛数量是必要的, 以补偿最初的细胞丢失, 减少雕刻 7.
为了优化胰岛雕刻, 一些替代解剖位点已经进行了实验和临床研究, 有希望, 但不是明确的结果8。而一些替代部位提供了方便和安全的通道 (如皮肤、肾囊、胃黏膜下和眼睛前房) 或更宽的表面, 用于较大的胰岛肿块 (如腹腔)、生存和生理移植小岛的代谢表现仍然有限, 仍然是一个令人关切的问题。目前正在寻找一个更适合胰岛雕刻的地点。
在胰岛移植的早期发展中, 它是许多解剖部位之一, 并被证明是一个成功的小岛环境10,11,12, 13, 14岁然而, 在动物模型6中, 静脉内胰岛输液成为临床选择, 部分原因是手术相对简单, 早期成功.另外, 在一定程度上, 与这个网站相关的底片, 特别是大量的早期胰岛丢失, 在实验胰岛移植的早期随着领域的成熟而不太被理解和约束。最近有令人信服的证据表明, 血管内胰岛输注远不理想, 因此, 动量正在重新成为细胞移植的潜在有价值的部位。
动量 (以主动袋的形式) 比肝脏提供相对优势 15,16。它是良好的血管化和易于访问。它允许回收移植 (如有必要) 和/或活检。与肝脏相比, 胰岛经历的缺血期减少, 可以接受相对较大的胰岛质量, 这是不可能的, 在那里门静脉压力的上升会引起并发症。
在研究中测试的程序中使用了一个联合小鼠移植模型, 使用 c57bl6 雄性小鼠, 体重 20-25 g. 胰岛受者只需注射一次链霉素, 剂量为250mg/kg ip。如果小鼠的血糖水平在注射后超过 24 mmomol.48 小时, 并且在至少5天的时间内保持在该水平以上, 则糖尿病的诱导可以被认为是成功的。
按照先前公布的方法, 采用了一些修改方法, 从年龄匹配的捐献者的胰腺中分离出了合基因胰岛。简而言之, 胶原酶被注射到胆囊而不是胆管。这样做是为了方便注射。胶原酶输注后, 进行孵育、组织破坏、密度梯度分离和人工采摘, 以获得纯胰岛。在 37°c t175 瓶中, 在移植前95% 的空气-5% co 2 中, 在 cmrl-1066 培养基中隔夜培养胰岛, 辅以10% 的热灭活胎牛血清 (fbs )。
Protocol
Representative Results
Discussion
胰岛移植到肝脏通过门静脉是最常用的方法, 在人类胰岛移植, 但仍然存在效率和安全问题, 如门静脉血栓形成和肝脂肪变性 17.最近的研究表明, 动量可能是肝脏的合适替代品, 但更多的研究需要在临床翻译12,14,18,19之前进行。
小鼠是一个合适的模型, 测试作为胰?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作的一些作者得到了中国国家重点研发 & 项目 (2017YFC1103704)、深圳三明医学项目 (szsm2014122020)、深圳高级医疗学科建设基金 (20160163838) 的部分资助,深圳科技基金会 (JCJY20160229204849975, gjhz20170131712556, jcypy6042511010658), 深圳卫生与计划生育基金会 (szxj20170921)。
Materials
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200μl Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
Referências
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