Un método para el trasplante de islotes pancreáticos para el epiplón en ratón
Summary
Se introduce un método para el trasplante omental de islotes en un ratón. Los islotes aislados se mezclan con hidrogel y la mezcla se coloca en la bolsa omental de un ratón diabético. Luego, se controla la glucosa en la sangre, y se realiza el análisis inmuno-histoquímico.
Abstract
Trasplante de islotes pancreáticos se ha propuesto ser un potencial tratamiento para la diabetes tipo 1. Reciente evidencia convincente indica que infusión intravascular del islote está lejos de ser ideal y por lo tanto, el epiplón es reapareciendo como un sitio potencialmente valioso para el trasplante de islotes pancreáticos. Este experimento requiere el aislamiento de islotes de alta calidad y la implantación de los islotes a los destinatarios diabéticos. Trasplante para el epiplón requiere pasos quirúrgicos que pueden demostrarse mejor visualmente. Aquí, se presentan los pasos detallados para este procedimiento. Aquí se describen dos métodos de mezcla de los islotes aislados con hidrogel antes de colocar la mezcla en la bolsa omental de ratones diabéticos. Diferentes hidrogeles se utilizan para las diferentes condiciones. Niveles de glucosa en sangre de los receptores de ratón diabético de syngeneic islotes en el epiplón fueron monitoreados durante 35 días. Algunos animales fueron sacrificados después de 14 días para realizar el análisis inmuno-histoquímico. Este enfoque preclínicos de trasplante puede utilizarse como datos preliminares previos a la traducción a un trasplante clínico.
Introduction
Según la Federación Internacional de Diabetes (FID), mellitus de la diabetes afecta actualmente a 382 millones de personas, con un aumento proyectado a 592 millones personas en 20351. En ambos trasplante allogeneic y xenogeneicos islote, terapia inmunosupresora sistémica es necesaria. Sin inmunosupresión, rechazo inmune es una causa importante de pérdida de injerto2. También es un problema importante de pérdida de islotes trasplantados debido a la sangre inmediata mediada por reacción inflamatoria (IBMIR)3,4. Sin embargo, incluso en la ausencia de una respuesta inmune como syngeneic o modelos de auto-trasplante, las células del islote transplantadas en el hígado vía la vena porta se pierden debido a inflamación o a condiciones ambientales desfavorables, tales como sangre pobre de la fuente con menor oxigenación y nutrientes5,6. Como resultado, para garantizar la función metabólica a largo plazo, son necesarios para compensar la pérdida celular inicial que reduce el engraftment7números más altos de la isla.
En un intento por optimizar el engraftment de islote, varios sitios anatómicos alternativos han sido investigados experimentalmente como clínicamente, con prometedores, aún no definitivo resultados8. Mientras que algunos de los sitios alternativos ofrecen un acceso fácil y seguro (e.g., piel, cápsula renal, submucosa gástrica y cámara anterior del ojo) o una superficie más amplia para grandes masas de islote (e.g., cavidad peritoneal), supervivencia y fisiológicas rendimiento metabólico de los islotes trasplantados son todavía limitado y siguen siendo una preocupación9. La búsqueda de un lugar más adecuado para el engraftment del islote está en curso.
El epiplón fue uno de los muchos sitios anatómicos que fueron investigados en el desarrollo temprano del trasplante de islotes pancreáticos y probó un ambiente exitoso para islotes10,11,12,13, 14. Sin embargo, infusión intraportal islote se convirtió en el clínico opción debido en parte a la relativa simplicidad del procedimiento y modelos de éxito temprano en animales6. También, en parte, los negativos asociados con este sitio, particularmente masiva pérdida temprana de la isla, fueron menos restringir comprendido y menos en los primeros días del trasplante de islotes experimental como el campo madurado. Más reciente evidencia convincente que indica que la infusión intravascular del islote está lejos de ideal, el epiplón es reapareciendo como un sitio potencialmente valioso para la célula.
El epiplón (bajo la forma de una bolsa omental) ofrece ventajas relativas sobre el hígado15,16. Es fácilmente accesible y bien vascularizado. Permite la recuperación del injerto (si es necesario) o biopsia. El período isquémico experimentado por los islotes es reducido en comparación con el hígado, y el epiplón puede aceptar relativamente las masas gran islote que no es posible intraportally, donde un aumento de la presión portal pueden causar complicaciones.
Se utilizó un modelo de ratón syngeneic de trasplante en el protocolo de prueba en el estudio, emplear ratones machos C57BL/6 entre 6-8 semanas de edad con un peso de 20 a 25 beneficiarios del islote de g. fueron despojados de diabéticos con una sola inyección del streptozotocin con una dosis de 250 mg/kg ip. La inducción de la diabetes puede considerarse exitoso si el nivel de glucosa de la sangre del ratón es mayor de 24 mmol/L 48 h después de la inyección y se mantiene por encima de ese nivel durante un mínimo de 5 días.
Syngeneic islotes fueron aislados de páncreas de donantes pareados por edad siguiendo métodos previamente publicados con algunas modificaciones. En Resumen, la colagenasa fue inyectado en la vejiga de rozadura en lugar de la vía biliar. Esto fue hecha como una mejora para facilitar la facilidad de inyección. Infusión de colagenasa fue seguido por incubación, interrupción de tejido, separación de gradiente de densidad y selección de mano para obtener puros islotes. Islotes fueron cultivados durante la noche en CMRL 1066 suplementado con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) en T175 frascos a 37 ° C, bajo 95% aire – 5% CO2 antes del trasplante.
Protocol
Representative Results
Discussion
El trasplante de islote al hígado vía la vena porta es el más de uso general método de trasplante de islotes pancreáticos en humanos, pero todavía hay preocupaciones de eficacia y seguridad como vena porta trombosis y hígado esteatosis17. Estudios recientes muestran que el epiplón puede ser una alternativa adecuada para el hígado, pero necesita más investigación para llevarse a cabo antes de la traducción clínica12,14,</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Algunos de los autores de este trabajo fueron apoyadas en parte por subvenciones de nacional clave de R & D programa de China (2017YFC1103704), proyecto de Sanming de medicina en Shenzhen (SZSM201412020), Fondo para el alto nivel médico disciplina construcción de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Fundación de ciencia y tecnología (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Fundación de Shenzhen de la Comisión de salud y planificación familiar (SZXJ2017021).
Materials
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200μl Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
Referências
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