Summary
הקמנו פרוטוקול כירורגיים חדשניים עבור שני הפוטונים הדמיה של עכברים חיים כבד עם הפלישה מינימלי. בטכניקה זו, זיהינו את מבנה נתונים היסטוריים של הכבד במהלך endotoxemia ליפופוליסכריד-induced. אנו צופים כי שיטה זו עשויה להיות מנוצל כדי לקבוע את היעילות של טיפול שונים ריאגנטים ליקוציט הכבד ההעברה.
Abstract
אלח דם הוא סוג של זיהום חמור העלולה לגרום לכשל איברים ורקמות נזק. למרות שיעור תמותה ותחלואה קרדיווסקולרית המשויך אלח דם גבוהה מאוד, לא ישירה טיפול או מנגנון הקשורות איברים נבדקה בפירוט בזמן אמת. הכבד הוא האיבר מפתח שמנהל רעלים וזיהומים בגוף האדם. במסמך זה, כיוונו לבצע הדמיה intravital של העכבר הכבד לאחר אינדוקציה של endotoxemia כדי לעקוב אחר על תנועתיות של תאים חיסוניים, כגון נויטרופילים ומקרופגים דרכים הכבד (LCMs). בהתאם לכך, תיכננו שיטה כירורגית לחשיפה של הכבד עם כירורגיה זעיר פולשנית. עכברים הוזרקו intraperitoneally ליפופוליסכריד (LPS), אנדוטוקסין נפוצות. באמצעות הגישה כירורגי הרומן שלנו עבור חשיפה intravital הדמיה של גיוס העכבר כבד, שמצאנו כי נויטרופילים בחלבון פלואורסצנטי LPS שטופלו LysM-ירוק (GFP) העכבר הכבד היה גדל לעומת זאת, באגירה פוספט הכבד שטופלו תמיסת מלח. לאחר הטיפול LPS, המספר של נויטרופילים גדל באופן משמעותי עם הזמן. בנוסף, שימוש בעכברים CX3Cr1-GFP, אנחנו בהצלחה דמיינו הכבד מקרופאגים תושב בשם איכות המזון. לכן, כדי לחקור את היעילות של ריאגנטים חדש כדי לשלוט ניידות המערכת החיסונית ויוו, קביעת תנועתיות של המורפולוגיה של נויטרופילים ו- LCMs בכבד עשוי לאפשר לנו לזהות את האפקט הטיפולי של האיבר כשל ורקמות הנזק שנגרם על ידי הפעלת לויקוציטים באלח דם.
Introduction
הכבד הוא האיבר חילוף החומרים העיקריים אצל יונקים; היא פועלת כמו מגדל פיקוח עבור אנרגיה, הורמונים, ניקוי רעלים1. בשל חשיבותה, חוקרים ניהלו ניסויים במבחנה , ויוו רבים התירי את השינויים בכבד בעת דלקת. מיקרוסקופ intravital שימש כדי ללכוד תמונות בשידור חי כבד2 . אכן, הכבד שונים בשיטות הדמיה כבר הציגה2,3,4,5,6. עם זאת, על מנת לפתח בגישה כירורגית פשוטה יותר ולהשיג ייצוב של איבר המטרה של תאים חיסוניים, תיכננו את פרוטוקול פשוט יכול להנחות חוקרים כדי לצמצם את המאמץ שלהם עבור הדמיה intravital.
במחקר זה, הצגנו קאמרית הדמיה הרומן ויציבה בעלת טכניקה כירורגית שניתן להשתמש בו כדי למזער זיהומים דימומים וסיבוכים אפשריים. וידאנו בכבד נשארה במשך יותר מ 2 h... בשיטה זו, זיהינו בהצלחה מורפולוגיות של איכות המזון7 ו נויטרופילים בתנאי ספיגה. מאז בשיטה זו ממזערת פיזי וביולוגי גורמים מבלבלים כגון דלקת בלתי צפוי ורועדת במהלך הליך כירורגי, אנו צופים כי ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון תופעות חריפה של תאים חיסוניים בכבד בתגובה ריאגנטים כמו LPS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים נערכו בהתאם לקווים המנחים של טיפול בעלי חיים מוסדיים ושל שימוש הוועדה של Yonsei אוניברסיטת המכללה לרפואה, קוריאה. חלבון פלואורסצנטי ירוק-LysM (GFP; gfp / +) עכברים8 ו- CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 עכברים בגיל 8-12 שבועות של גיל שימשו עבור הדמיה intravital. כל כלי ניתוח היו בלוק חיטוי באלכוהול 70%.
1. אישית מעוצבת העכבר הכבד הדמיה קאמרית עם תמיכה כלים
- העכבר הכבד הדמיה עיצוב החדר
- להפוך תא של גודל הבא עבור כבד עכבר הדמיה (איור 1): בחדר הפנימי (120 מ"מ אורך × 160 מ מ רוחב × 30 מ מ גובה), החדר החיצוני (100 מ מ אורך × 100 מ מ רוחב × 24 מ מ גובה), בריחים (Ф 3 מ מ × 30 מ מ גובה), אגוזים (Ф 4 מ מ) , ואגוזים בצורת כנף (Ф 4 מ מ).
- למדוד את ריפוי הסוכן ולאפשר elastomer הבסיס ב- 1:9 יחס סך של 120 גרם של סיליקון.
- מכניסים את התערובת סיליקון נוזלי 250 מ ל Erlenmeyer הבקבוק ומערבבים היטב. לאחר מכן להכניס את הבקבוק desiccator, להסיר בועות אוויר עבור 1 h תחת ואקום באמצעות המשאבה.
- יוצקים את התמהיל סיליקון נוזלי לתא אישית מעוצבת העכבר בגובה 10 מ מ גובה ולתת לו תרופה כמה ימים (איור 1 א').
- הכנת כיסוי שקופיות, הכבד תיקון מיטה
- על מסגרת מתכת, לצרף את הזכוכית המכסה באמצעות דבק סיליקון. . תן לזה להתייבש ליום 1 (איור 1B).
- על מנת להחזיק ביעילות עם מים מזוקקים העדשה טבילה במים, מבנה קבועים־למחצה חסימת-מים חיוני. 1 מ מ עיגול דבק סיליקון ולבצע להקשיח את זה בן לילה.
- לערבב את הסוכן ואת elastomer הבסיס לריפוי, ואז ותשפכי לתוך צלחת 6-ובכן בגובה של 8-10 מ מ. בצע תהליך התקשות כמתואר ב- 1.1.2-1.1.4.
2. הכנת LPS
- להכין 1 × באגירה פוספט מלח סטרילית (PBS) כדי לדלל את האבקה LPS של סלמונלה enterica serotype enteritidis. (1 × PBS: 137 מ מ NaCl, אשלגן כלורי 2.7 מ מ, 10 מ מ נה2HPO4,2PO 1.8 מ מ ח'4).
- מראש בחום PBS באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C, פותחים את הבקבוק אבקת LPS (25 מ ג) בקפידה.
- באמצעות מכשיר pipet, שופכים את PBS סטרילי (5 מ"ל) לתוך הבקבוק אבקת LPS, מערבבים בעדינות או להשעות את הפתרון כדי להכין את הפתרון מניות.
הערה: לאחר אבקת LPS הוא מעובה, vortexing קשים עלולים לגרום בועות. להימנע בועות כדי למזער את אובדן בעת ביצוע aliquots 1.5-mL צינורות. - לאחסן את הפתרון LPS מניות ב−20 ° C, למהול אותו לתוך פתרון LPS 1 מ"ג/מ"ל להזרקה.
- להזריק את הפתרון LPS 1 מ"ג/מ"ל (20 מ"ג/ק"ג) לתוך הצפק של עכבר שאינו ומורדמת באמצעות מזרק 1-mL. לבעל שליטה, להזריק באותו אמצעי אחסון של PBS.
- המתן 2 h מספקת תגובה דלקתית.
3. הכנה של טקסס-אדום לתוספי כתם הדם
- להכין שני צינורות חרוט 15-mL 10 מ"ל של PBS סטרילי.
- לדלל לתוספי טקסס-אדום אבקת (25 מ ג) ב- 3 מ"ל של PBS ומערבבים היטב. להעביר את התערובת שפופרת ריק 15-mL חרוט.
- להעביר את PBS הנותרים (7 מ ל) 15-mL צינור חרוטי המכיל את התערובת לתוספי (3 מ ל).
- להתחבר מסנן מזרק מיקרומטר 0.45 הקצה של מזרק 10-mL. המסנן מזרק צריך להחליף את המחט.
- לסנן את התערובת לתוספי (10 מ"ל). הקש את המזרק באופן שווה על מנת למנוע שפיכת.
- לוותר על µL 500 של 2.5 מ"ג/מ"ל פתרון לתוספי בצינור 1.5-mL חסום-אור ואחסן אותו ב −20 מעלות צלזיוס. ברגע הקרת, לאחסן אותו ב 4 º C.
4. תהליך כירורגי
- לחטא שולחן הניתוחים כל הכלים באמצעות אלכוהול 70% לפני הניתוח. לאחר מכן, להגדיר את הכלים לניתוח בכבד, להתאים את הצלחת חימום עד 37 ° C (איור 2 א, ב').
- עבור הרדמה, להזריק intraperitoneally העכברים עם 30 מ"ג/ק"ג של tiletamine/zolazepam ו- 10 מ"ג/ק"ג של חריגות השירותים הווטרינריים. פתרונות אלו יכולים להיות מעורב, מדולל ב- PBS להזרקה בו זמנית. לאשר ההרדמה בהקשת בעדינות את האצבע של העכבר. המשך לצעד הבא כאשר יש רפלקס אין.
- למרוח כמות קטנה של העין משחה למניעת היובש של הרשתית של העכבר.
- הסרת שיער הגוף סביב אזור הבטן בעזרת קרם להסרת שיער (איור 2C).
- מזריקים µL 200 של טקסס-אדום לתוספי פתרון (ריכוז של 2.5 מ"ג/מ"ל) דרך וריד הזנב או הזרקת רטרו-מסלולית באמצעות על מזרק אינסולין (איור דו-ממדי).
- לסמן את האזור subcostal נכון עם סמן. הקו צריך ניתן להסיק מן הסרעפת בסוף הצלע. חותכים את האפידרמיס עם מלקחיים ומספריים (איור 2E, F).
- פתח את חלל הבטן בעזרת מיקרו-מספריים ומלקחיים, לחשוף את הכבד בקפידה. האונה השמאלית לרוחב צריך להיות התגלגל באמצעות ספוגיות כותנה (איור 2G, H).
- יוצקים µL 500 ל- PBS סטרילי על חלל הבטן כדי למנוע יובש של הכבד.
- למקם את העכבר במיקום נכון-חמצן בתוך תא אישית מעוצבת ולהחיל כמות קטנה של רקמת דבק על המיטה סיליקון. לאחר מכן, בזהירות לצרף את הכבד באמצעות ספוגיות כותנה (איור 2I).
הערה: מכיוון רקמת הכבד ביותר לעזאזל, אין מכנית למשוך את הכבד. בעדינות גלגלו עם ספוגיות כותנה. - כמה שניות לאחר מכן, רטוב הכבד שוב עם µL 500 ל- PBS סטרילי כדי למנוע ייבוש מתוך הכבד. להציב את המסגרת מתכת על הכבד ולתקן אותה בחוזקה עם אגוזים (איור 2J).
5. intravital הדמיה של הכבד, עם מיקרוסקופ שני הפוטונים
- הפעל תוכנת זן (Carl Zeiss) כדי להפעיל את הלייזר, לקבוע את אורך הגל עד 880 ננומטר, והינו ממוקם ירוק, וערוצי אדום. להתאים את עוצמת הלייזר על פי עוצמת קרינה פלואורסצנטית (איור 3 א). מידע אודות מסנן פליטה הוא כדלקמן: ירוק/Alexa488, 500-550 ננומטר, אדום/אלקסה 555, 575-610 nm.
- למקם את התא על הבמה הדמיה ולמקם את 20 X עדשה המטרה טבילה במי קרוב הזכוכית המכסה.
- לתקן את התנור גומי סיליקון מתחת לגופה בעכבר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה (איור 3B).
- ירידה µL 500 של מים מזוקקים על מסגרת המתכת, ולאחר מכן משוך את העדשה המטרה קרוב הכבד (איור 3C).
- התאם את המוקד וקבע את העומק ואת הזמן של אזור ההדמיה.
- התנהגות הדמיה.
- עבור הדמיה לטווח ארוך, להזריק חצי מנה של תערובת tiletamine/zolazepam חריגות השירותים הווטרינריים כל שעה במהלך דימות. שמירה על טמפרטורת הגוף של העכברים ב 37 ° C חיוני בשלב זה. תמיד לשמור על העין העכבר, מאז זמן ההרדמה שונה מכל כל עכבר.
הערה: שיטה זו היא לא מתאים השחזור לאחר כירורגיה והדמיה. מבחינה אתית, אנו מקריבים את העכבר מיד לאחר הניתוח. - בדוק את הרפלקסים פדלים במשך כל 30 דקות על ההרדמה יציב.
6. ניתוח נתונים
- פתח את תוכנת ניתוח נתונים Volocity ולאחר מכן לייבא את הנתונים הגולמיים בספריה לתוך התוכנה.
- הסר את רעש התמונה כדי להתאים את המצב ואת תצלום בזק.
הערה: כדי לקבל תמונות חלקה, השתמש במסנן 'קנס' או 'חציון'. יתר על כן, השתמש בתכונה 'ניגודיות שיפור' כדי ליצור תמונות כהה או מטושטשות לברורה. - להתאים את הפריטים הערוך 100% וייצוא קבצי JPEG או TIFF עבור תמונות תמונה, קבצי AVI סרטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הומצאה תא הדמיה פשוטה ויציבה מאוד. החלק התחתון של תא היה מכוסה סיליקון, אשר מנעו החלקה של העכבר הגוף והאיברים. בנוסף, בגלל הסיליקון יש את הכמות הנכונה של גמישות, זה יכול למנוע נזק הצפוי המושרה על ידי הלחץ של השקופית כיסוי (איור 1 א', ג). דבק השני, רקמות-כספת (הוטרינר בונד) הוחלה על מנת לתקן את הכבד שחולצו על המיטה סיליקון בצורת עיגול. שיטה זו אפשרה לנו להימנע רועד נגרמת על ידי פעימות הלב או תנועה respirational. לבסוף שקופית כיסוי מתכת היה להציב, לתקן על ידי ואומים בהתבסס על גודל הגוף העכברים ואת המיקום של הכבד בולטות (איור 1B–D). כאשר ההרדמה בוצעו כהלכה, הגדרות הדמיה אלה יכול להימשך יותר מ 6-אייץ '.
לפני תחילת הניתוח, טמפרטורת הגוף של העכברים היה נשלט על ידי הצבת החיה על תא חימום שהוגדר מראש ל- ° 37 C (איור 2 א). לאחר מכן, כדי למנוע זיהום משני, כל הכלים הדרושים עבור העכבר כירורגיה והדמיה היו סטיריליים עם אלכוהול 70% ו/או בלוק למניעת זיהום משני (איור 2B). לאחר מכן, שיער גוף העכבר הוסר, בעיקר מאזור הבטן, עם קרם להסרת שיער (איור 2C). לפני ביצוע החתך, העור היה מעוקר עם povidone יוד. זרימת הדם היה בלוחיות טקסס-אדום לתוספי באמצעות הזרקה לווריד (איור דו-ממדי). קו החלה על הסרעפת והסתיימה ב הצלעות נכון נמשך. קו החתך נכון subcostal זה עזר למזער את הדימום. האיזמל או מיקרו-מספריים, החלה את הקרע; הבטן לא נפתח מדי כדי למנוע גירוש של המעיים חלל הבטן (איור 2E, F). שכבות שומן ורקמות הוסרו עם מלקחיים ומספריים ניתוח מיקרו, אזור החתך ניקו עם מטליות PBS וכותנה סטיריליים (איור 2G). האונה הלטראלי השמאלי, לארבעה אונות הכבד, הגדולים ביותר היה להוציא ספוגיות כותנה, אז מצורף אל המיטה סיליקון באמצעות קשר רקמות (בונד הוטרינר). כמו רקמת הכבד היה מאוד לעזאזל, הועבר הכבד באמצעות ספוגיות כותנה (איור 2 H, אני). לאחר החלת זכוכית מכסה מתכת, הכבד היה נתון הדמיה. למניעת יובש, PBS סטיריליים הוחל על השטח בין הכבד כיסוי זכוכית (איור 2J). הגובה של הזכוכית המכסה היה מותאם עם אגוזים בעת הצורך.
מיקרוסקופ שני הפוטונים היה מצויד X, Y ו- Z axes מיקרומטר בקר ו סוכך וילון שחור (איור 3 א). הלייזר היה stably במצב נעול על התוכנה זן. לרכוש הדמיה יציב, נסחף איבר היעד צריך למנוע. לכן, בנוסף קאמרית הדמיה שיטה כירורגית, החוטים של כרית החימום אלקטרוניים היו מאובטחת מן השלב הדמיה ומאורגן היטב על ידי קלטות דביק (איור 3B). לבסוף, כמות מספקת של מים מזוקקים נוספה לחלק העליון של הזכוכית המכסה של העדשה טבילה במים (איור 3C).
זרימת הדם היה לציין בבירור על המסך לאחר ורידיות לתוספי טקסס-אדום. כדי לתפוס, אדום וירוק בו זמנית, ביצענו הדמיה עם אורך גל של 880 ננומטר. על פי ניתוח ההדמיה intravital, מספר מתאים של נויטרופילים היתה תמיד במחזור הדם במצב PBS. בעוד מספר נויטרופילים ב- LPS מטופלים עכברים היה משמעותי מוגברת. שימו לב כי הרבה נויטרופילים הסתובבו בתוך מחזור הדם, אבל הם לא נודדים החוצה כלי הקיבול במצב דלקתי. (איור 4A, הסרט משלים 1). נויטרופילים בעכברים LPS שטופלו היו יותר אתת השטח luminal של הכלי, מה שגרם לזיהוי בתדירות גבוהה יותר של נויטרופילים בתוך הכלי (איור 4A, 1 הסרט משלים). מלבד תנועתיות של נויטרופילים, איכות המזון בעכברים CX3Cr1-GFP נצפו על פני השטח של רקמת הכבד ולא עמוק בתוך הרקמה (איור 4B). איכות המזון הראה מעט תנועה או הפעלת בכבד אפילו בעכברים שטופלו LPS.
איור 1 . העיצוב של תא כבד וכלים חברת-בת. (א) לשפוך את התערובת סיליקון אל החדר העכבר אישית מעוצבת. (ב) מידות של השקופית כיסוי מתכת (1 ס מ = 25.4 מ מ, Ф = קוטר). (ג) התמונה מציגה את הפלסטיק אישית מעוצבת קאמרית כבד מלא עם סיליקון elastomer. (ד) חלקים אחרים שימשו כדי להרכיב את התא בכבד. תיקון ברגים ואומים עשויים ברזל. חצים המצוין ברגים ואומים, בהתאמה, (ג) ו- (ד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . שלבי ניתוח לניתוח בכבד. (א) מתכת וגומי חימום צלחות ב 37° C ו DC בקר טמפרטורה לפני הניתוח. (ב) הכולל ניתוח וכלים תומכת לניתוח בכבד (ע' כותנה ספוגית, מיכל, נולד ב- 70% אלכוהול, ג נייר טישו, ד גילוח, קרם להסרת שיער אי, פ אישית מעוצבת קאמרית, ג'י הדבקה, תוצרת בית הדום הכבד ה, אני משוגע, אגוזים, כיסוי מתכת ג'יי שקופית ק' ניתוח מיקרו מספריים, ל' מלקחיים, מספריים מ, מזרק 3-mL (ש ע), או סמן, מזרק אינסולין 0.3-mL עמ', ש 1-mL מזרק). נוהל לניתוח בכבד (C-J). (ג) החלה קרם להסרת שיער באתר בטן. (ד) רטרו-מסלולית זריקה של עכברים עם לתוספי טקסס-אדום. (ה) סימון מקום החתך עם סמן. (ו) חיתוך לאפידרמיס עם מלקחיים ומספריים. (ז) ביצוע חתך לתוך חלל הבטן. (ח) הוצאת לרוחב האונה השמאלית בעדינות. (I) הצמדת האונה המעמד בכבד באמצעות הוטרינר בונד. (י) תמונה של המערכה האחרונה למעלה. אגוזים, תוקן לשקופית כיסוי מתכת ולאחר מכן השקופית כיסוי היה קבוע עם פרפר אגוזים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . הגדרות עבור מיקרוסקופ שני הפוטונים והבמה הדמיה- (א) נוף של מיקרוסקופ שני הפוטונים (LSM 7 MP), שלב ההדמיה, אשר יכול לנוע ב- x ו- y כיוונים. (ב) כבד הדמיה תא עם גומי חימום משטח הוצמד באמצעות הקלטת כדי לכסות את העכבר. (ג) יורד לגלידה עם פיפטה בין המטרה עדשת כיסוי זכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . ויזואליזציה של נויטרופילים ומקרופגים דרכים כבד בכבד של עכברים בשידור חי- (א) מורחב בזק המוקד של נויטרופילים בכבד של עכברים LysM-GFP. פקד התמונה היתה של עכברים שטופלו PBS. התמונה LPS היה מ- LPS מטופלים עכברים. תמונות נרכשו באמצעות 20 X / 1.0 NA-טבילה במי עדשה (שדה ראייה [FOV] = מיקרומטר 424.3 × 424.3 מיקרומטר, עומק = 40 µm, פרוסה מרווח = 1 מיקרומטר, מרווח זמן = 60 s, מחזור = 31). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) הפנימית, משטח אזור בזק של איכות המזון הכבד של עכברים CX3Cr1-GFP. תמונות נרכשו באמצעות עדשת המים-טבילה 20 × / 1.0 NA (FOV = מיקרומטר 424.3 × 424.3 מיקרומטר, עומק = 40 µm (הפנימית) / 10 מיקרומטר (פני השטח), פרוסה מרווח = 1 מיקרומטר, מרווח זמן = 60 s (הפנימית) / 20 מחזור (פני השטח), s = 31). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
הסרט משלים 1. השוואה של PBS מטופלים כבד לעומת LPS מטופלים הכבד. ברור ההבדל בין שני תנאים שונים היא אבחנה. ב- LPS מטופלים כבד, המספר של נויטרופילים הוא גדל באופן משמעותי, תנועתיות הוא ירד. היציבות של שני התנאים הסרט שנצפו. זרימת הדם מסומן עם לתוספי טקסס אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכבד נחקרה באופן פעיל על ידי הרבה קבוצות3,10, בשל חשיבות תפקודה. למשל, היימן ואח הציע שיטה עדינה באמצעות agarose. למרות ששיטה זו נמצאה להיות מדויק מאוד, ההגדרה agarose לוקח זמן. עם זאת, עם המתודולוגיה שלנו, כל ההליכים יכול להתבצע בתוך 30 דקות, צמצום גורמים אחרים מבלבלים. שנית, ייצוב הכבד הוא מאוד חשוב כי פעימות יכולים להפריע את הוידאו. כדי למנוע תופעה זו, אנחנו לטאבים העכברים למצב חימום נכון.
צעד קריטי נוסף פרוטוקול זה היה ייצור של המסגרת כיסוי מתכת והמיקום שלו בסרגל מתכת. המכשול הכי חשוב בפנינו היה כדי לקבוע כיצד להתגבר על friability של הכבד, בהתאם הכבד קיבוע באמצעות כמות מספקת של הלחץ. בתחילה, כאשר רק את האגוזים פרפר הוחלו להחזיק את השקופית כיסוי, היה המניע את זרימת הדם, הכבד לא הצליח לשאת את המשקל של השקופית כיסוי. במקום זאת, אנחנו המציאו שיטה מטה המנעולים לפני הצבת השקופית כיסוי לאורך הבר. מאז השקופית כיסוי נתמכה על ידי ברגים, היא נתנה מרחב עבור עובי הכבד, בזאת, אל תלחץ חזק לתוך הכבד, עדיין שמרו על איזון ועל הקיבעון. באמצעות LysM-GFP עכברים6, אנחנו אישר כי זה עיצוב עלולה לאפשר ויזואליזציה של נויטרופילים ב- sinusoids וורידים המרכזית. CX3Cr1-GFP עכברים5 שימשו גם במודל זה על מנת לצפות איכות המזון-LCMs נמצאו לעתים קרובות על פני השטח של הכבד.
הגובה של המעמד בכבד או המיטה סיליקון, היה גם חיוני. אם זה היה גבוה מדי, להיות משובשות מחזור הדם בכבד. כאשר גובה המעמד הכבד היה נמוך מדי, זה היה קשה לשמור על קיבוע יציבה של הכבד. כי כל העכברים היו מידות גוף שונים, שהפקנו מיטות הסיליקון שהיו בגבהים שונים באמצעות צלחת 6-ובכן, דומה לזה המשמש עבור תרבית תאים. בדרך זו, היינו יכולים להתאים אישית את החדר לפי גודל העכבר כל. לסיכום, תיכננו הרומן ופרוטוקול פשוטה intravital הדמיה של העכבר הכבד לחקור המורפולוגיה, תנועתיות של תאים חיסוניים בכבד תחת תנאים דלקתיים.
פרוטוקול חדש זה יכול להועיל מאוד חוקרים בתחום זה מי תרצי לצפות תגובה חיסונית חריפה של הכבד. עם זאת, בשיטה זו, החוקרים לא יכולים לנהל הדמיה לטווח ארוך יותר מ 6 שעות עקב קיבוע כבד עם דבק רקמות. פרוטוקול זה היא שיטה רק חד פעמי, לכן, עכברים צריך להיות מיד קורבן לאחר דימות. כאשר הכבד היא מנותקת מן המיטה סיליקון, הכבד בסופו של דבר להיות הפשיטו מן המיטה, וכתוצאה מכך דימום יתר. לכן, ותפירה של אזור הבטן של הכניסה מחדש בלתי אפשרי תצפית לעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק של נבחרת מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP; מענק מס 2016R1A2B4008199 Y-מ'. ח'), ו משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה (להעניק את המספר: HI14C1324).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
