Summary
Vi rapporterar här, enkel och billig silver färgning protokoll som kräver endast tre reagenser och 7 min behandling, och lämpar sig för snabb generering av hög kvalitet SSR data i den genetiska analysen.
Abstract
Enkel sekvens upprepa (SSR) är en av de mest effektiva markörer som används i växt- och genetisk forskning och molekylär avelsprogram. Silverfärgning är en allmänt använd metod för detektion av SSR markörer i en polyakrylamidgel. Konventionella protokoll för silverfärgning är dock tekniskt krävande och tidsödande. Som många andra biologiska laboratorium har tekniker, silver färgprotokoll stadigt optimerats för att effektivisera upptäckt. Här rapporterar vi förenklade silver färgning metod som avsevärt minskar kostnaderna för reagens och förbättrar detektion upplösning och bildkvalitet tydligheten. Den nya metoden kräver två stora steg (impregnering och utveckling) och tre reagenser (silvernitrat, natriumhydroxid och formaldehyd), och endast 7 min behandling för en icke-denatureringen polyakrylamidgel. Jämfört med tidigare rapporterade protokoll, denna nya metod är enklare, snabbare och använder färre kemiska reagenser för SSR upptäckt. Därför gynnar detta enkla, Billiga och effektiva silver färgning protokoll genetisk kartläggning och markör-assisted avel av en snabb generering av SSR markör data.
Introduction
Utvecklingen av PCR-baserade markörer har revolutionerat vetenskapen om växtgenetik och avel1. Enkel sekvens upprepade (SSR) markörer är bland de vanligaste och mest mångsidiga DNA-markörerna. Deras breda genomet täckning, överflöd, genomet specificitet och repeterbarhet är några av fördelarna med SSR markörer utöver sin codominant arv för detektion av heterozygot genotyper2. Flera studier har använt SSR markörer att undersöka genetisk mångfald, spåra anor, konstruera genetisk koppling kartor och karta gener för ekonomiskt viktiga drag3,4.
PCR-produkter av SSR markörer skiljs vanligen använda agaros eller polyakrylamid gel elektrofores och sedan visualiseras med silverfärgning eller under UV-ljus efter färgning med etidiumbromid. Silverfärgning av DNA-fragment i polyakrylamidgeler är känsligare än andra färgning metoder5,6 och har använts i stor utsträckning att upptäcka DNA-fragment som SSR markörer7.
Som många biologiska laboratorietekniker, har silverfärgning av polyakrylamidgeler stadigt förbättrats sedan dess första rapporteras som en fragment visualisering teknik i 19798. Tekniken ändrades initialt för upptäckt av DNA-fragment av Bassam o.a. 6 1991 och sedan förbättras genom Sanguinetti och medarbetare9 1994. Metoden har optimerats ytterligare sista några decennier6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. de flesta av dessa uppdaterade versioner av protokollen har dock vissa nackdelar såsom hög teknisk efterfrågan och långa handläggningstiden för fixering och montering6, som begränsa tillämpningen av dessa protokoll7, 11. En optimal protokoll som kombinerar låg kostnad med hög verkningsgrad för DNA fragment upptäckt behövs omgående för rutinmässiga tillämpningen av silver färgning i biologisk forskning.
Dessutom Polyakrylamidgelen kan delas in i denatureringen och icke-denatureringen polyakrylamidgeler, och båda kan användas för detektion av SSR markörer använder silver färgning metod. Effekten av och upplösning som avsevärt skiljer sig inte, men icke-denatureringen polyakrylamidgeler är lättare att bearbeta och ta mindre tid16.
På grundval av den tidigare forskningen15är syftet med den aktuella studien att beskriva en optimerad silver färgning protokoll i detalj för snabb, enkel och billig upptäckt av SSR markörer i en icke-denatureringen polyakrylamidgel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av PCR produkter av SSR markörer
- Förbereda alla kemikalier och reagenser för PCR-reaktioner inklusive mall DNA (30 ng/µL), 2 × PCR master mix (innehållande 2 × PCR buffer, 0,4 mM för varje dNTP, 3 mM av MgCl2, 0,1 U/µL av Taq-DNA-polymeras och färgämnen), 10 µM varje framåt och bakåt grundfärger , och destillerat eller avjoniserat vatten (dH2O).
Obs: De SSR-markörer som används i den aktuella studien var PT51333 (vidarebefordra primer sekvens: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' och reverse primer sekvens: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') och PT50903 (vidarebefordra primer sekvens: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' och Reverse primer sekvens: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') för tobak och CX-43 (vidarebefordra primer sekvens: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' och reverse primer sekvens: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') och CX-157 (vidarebefordra primer sekvens: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' och reverse primer sekvens: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') för blommande Kinakål. - Förbereda 10 µL av PCR-mix för förstärkning genom att lägga till 2 µL av DNA, 5 µL av 2 × PCR master mix, 0.2 µL av varje framåt primer och reverse primer och 2.6 µL av dH2O.
- Utför PCR-amplifiering reaktion i en termocykler med ett första steg 94 ° c i 5 min, följa vid 38 cykler av 45 s vid 94 ° C för denaturering, 45 s vid 55 ° C för primer glödgning och 1 min vid 72 ° C för förlängning, och en sista förlängning steg i 10 minuter vid 72 ° C; sedan lagra PCR-produkter vid 4 ° C för senare användning.
2. beredning av lösningar för polyakrylamid geler gjutning
- Förbereda 1 L 5 × TBE buffert genom upplösning 54 g Tris base och 27,5 g borsyra i dH2O, tillsats av 20 mL 0,5 M EDTA (pH 8,0) och justera lösningen till en slutlig volym av 1 000 mL med dH2O.
Obs: TBE buffert kan förvaras vid rumstemperatur i månader. - Förbered 2 L 0,5 × TBE buffert genom att lägga till 200 mL 5 × TBE buffert till dH2O till en slutlig volym av 2 L och förvara i rumstemperatur.
- Förbereda en 6% icke-denatureringen Polyakrylamidgelen lösning genom att lösa upp 29 g av molekylär biologi klass akrylamid och 1 g av molekylär biologi klass N, N'-methylenebisacrylamide i 0,5 × TBE buffert till en slutlig volym av 500 mL. Täcka lösning flaskan med aluminiumfolie och förvaras vid 4 ° C för senare användning.
Försiktighet: Akrylamid anses ett potent nervgift och bör hanteras med försiktighet. Använd alltid handskar vid vägning pulver och hantering lösningar som innehåller den. - Bered en 20% ammonium persulfatoxidation (APS) genom upplösning 2 g av APS med dH2O till en slutlig volym av 10 mL. Det kan lagras vid-20 ° C för månader.
Obs: För bekvämlighet, 10 mL 20% APS lösning kan vara aliquoted i 1,5 mL eller 2 mL centrifugrör för lagring vid-20 ° C. Tina och blanda väl före användning. - Bered en utspädd bind-silane genom upplösning 3 µL av bind-silane i 0,997 mL 95% etanol innehållande 0,5% ättiksyra. Det kan lagras vid 4 ° C i veckor.
Försiktighet: Bind-silane är giftigt, Använd handskar vid hantering av lösningen och hålla rum ventilerade.
3. beredning av akrylamidgeler för elektrofores
- Tvätta en uppsättning glasplattor och distanser med tvättmedel i kranvatten, följt av en fullständig sköljning med dH2O. lufttorka plattorna genom att ställa dem i en platta som Torkställ.
- Skingra 1 mL bind-silane lösning på den inre ytan av en rektangulär glasplatta, och torrt under 5 min.
Obs: Om bind-silane lösningen inte sprids jämnt på ytan av plattan, kan gelen tas loss under färgning och resultera i en otillfredsställande färgning effekt. - Skingra 1 mL avvärja-silane på inre ytan av en skårade glasskiva med en bomullstuss, torka av överflödig avvärja-silane med läskpapper och lufttorka för 5 min.
Obs: Om den repel-silan inte belägga ytan på glasplattan jämnt, kan den skada gelen genom delvis strippning. - Montera glasplattorna med distanser med fasade plattan ovanpå, och klämma båda sidor av församlingen med gjutning klämmor.
- Häll lagom mängd (40 mL) av 6% icke-denatureringen Polyakrylamidgelen lösning till en bägare för tallrik 33 cm Bredd × 10 cm höjd och spacer tjocklek 1,5 mm, tillsätt 20 µL av tetramethylethylenediamine (TEMED) och 200 µLfresh 20% APS och blanda försiktigt.
Observera: Lämplig mängd (40 mL) gel lösning beräknades från den inre volymen av två skyltar med en tjocklek av distanser (30 cm × 8,5 cm × 0,15 cm). När det gäller mängden TEMED och APS för gel polymerisation finns det en standard förhållandet mellan gellösningen TEMED och APS baserat på referens17. Gellösningen beskrivs ovan lagras vid 4° C. Om gellösningen lagras i rumstemperatur, 20 µL av TEMED och 100 µL 20% APS bör användas. Försiktigt rör blandningen av gel lösning med en glas-käpp för att undvika luftbubblor i lösningen. - Häll över lösningen omedelbart och noggrant i monterade glasplattor längs kanten av fasade plattan, fylla utrymmet nästan till toppen, och infoga kammen. Tillsätt en liten mängd gel lösning över kammen.
Obs: Håll glasplattorna horisontella till hindra gelen från att läcka. Ta bort eventuella bubblor med en bubble krok, om nödvändigt. - Låt gelen att ställa in i 30 min i rumstemperatur.
Obs: Tiden för polymerisation kan ändra med temperaturer gellösningen och miljö. - När gelen är helt polymerisation, bort gjutning klämmorna och placera plattan uppsättningen i enheten elektrofores tank med fasade plattan vänd mot övre buffert reservoaren och använda stora klämmor för att fästa plattan inställd på tank enheten.
- Häll 1 L 0,5 × TBE buffert i var och en av övre och nedre kamrarna. Ta bort kammen och spola alla brunnarna grundligt med buffert med en pipett eller spruta.
Obs: Se till att gelsandwichen längst ned i plattan är helt indränkt i buffert utan eventuella bubblor.
4. kör geler
- Lägg ca 1 µL av PCR-produkten i varje brunn Polyakrylamidgelen. Ladda en DNA storlek stege till båda sidor av gel tillsammans med prover av PCR-produkter. Fixa skyddshöljet till övre buffert kammaren.
- Anslut ledarna till strömförsörjningen, på de färgkodade röd till röd och svart till svart. Kör gelen vid en konstant spänning 110 V tills färgen når en angiven position, normalt för ~ 70 min.
Obs: Spänning och kör tiden kan justeras beroende på storleken av PCR-produkter.
5. silver färgning för att upptäcka SSR markörer i en icke-polyakrylamidgel
- Efter elektrofores, Töm bufferten från den övre kammaren i en stor bägare via ventilen. Lossa sida klämmorna, ta bort plattorna från apparaten, noggrant skilja den skårade glasplattan längs ena sidan med en spatel och kontrollera att gel resterna bifogas andra glasskivan belagda med bind silan.
- Gör 1 L färska impregnering lösning genom att lösa upp 1,5 g AgNO3 i 1 L dH2O. förbereda 1 L färska utveckling lösning genom att lösa upp 10 g NaOH i dH2O 900 mL, tillsätt 1 mL av 37% formaldehyd , och anpassa sig till en slutlig volym av 1 L med dH2O.
Obs: Använd skyddshandskar och hantera ovanstående kemikalier och lösningar med omsorg. Det är inte nödvändigt att hålla i lösningar och motsvarande steg med lösningar i mörkret. - Skölj noggrant gel och glas plattan med gott om dH2O ta bort elektrofores bufferten, och sedan placera plattan med gelen uppåt på en plastbricka och dränka gelen i 1 L impregnering lösning. Placera brickan på en shaker.
- Skaka försiktigt facket vid 60 r/min för 3-4 min.
Obs: Skaka tid kan justeras enligt gel tjocklek och koncentration silvernitrat i impregnering lösningen. - Flytta plattan ur impregnering lösningen och placera den på ett annat fack. Skölj den kvarvarande impregnering lösningen bort från ytan av plattan och gelen med gott om dH2O två gånger för 3-5 s varje.
- Placera plattan med gelen vetter mot ett annat fack, sänk plattan i 1 L utveckling lösning, sedan skaka facket försiktigt vid 50 r/min för ~ 3 min. Monitor uppkomsten av DNA fragment och stoppa utvecklingen när den högsta andelen signalera av DNA fragment till bakgrund buller observeras (detta steg tar ~ 3 min).
- Skölj plattan och gelen med gott om dH2O två gånger, och torka gelplattan med en pappersnäsduk.
- Skanna gelen med hjälp av en lämplig skanner. En upplösning på 300 dpi ger en tydlig visualisering av DNA-fragment. Gelen kan även fotograferas med en kamera.
- Banding mönstret av SSR markörer kan vara poängsätts baserat på DNA fragment i bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De PCR-amplikoner producerades med hjälp av motsvarande SSR primer par i blommande kinakål och tobak. Efter elektrofores, var polyakrylamidgeler färgas med ovanstående silver färgning protokollet, som otvetydigt upptäckt banding mönster av SSR markörer (figur 1).
För att jämföra olika silver färgprotokoll upptäckt effektivitet, PCR-produkter av SSR markörer i tobak och blommande Kinakål skildes använder polyakrylamid gelelektrofores och visualiseras med hjälp av fem publicerade silverfärgning protokoll9,11,12,13,14 och det nya protokollet. Alla sex protokoll upptäckt SSR banding mönster för tobak och blommande Kinakål genotyper (figur 2), men detta protokoll hade lägsta bakgrundsljud och högsta kontrast av DNA fragment, sådan att det produceras högsta bilden tydlighet för entydig screening av SSR polymorfism. Den rinnande tiden och antalet de huvudsteg och reagenser som används för att slutföra silver färgning process listas i tabell 1 för varje protokoll, det nya protokollet tar minst tid och kräver färre kemiska reagenser och bearbeta steg.
Figur 3 visar känslighet protokollet mätt med 50-2,000 bp DNA-markör på en icke-denatureringen polyakrylamidgel.
Figur 1: Påvisande av SSR banding mönster. Påvisande av SSR banding mönster för genotyper av blommande Kinakål (A) och tobak (B) använda den nya silverfärgning protokoll. PCR-produkterna skildes på 6% icke-denatureringen polyakrylamidgeler och målat enligt ovan redovisade silver färgning protokoll. Lane M är DNA storlek markör, körfält 1 till 62 representerar amplikoner 62 genotyper förstärks av SSR primer par ”CX-157” (sekvenser av framåt och bakåt primers är 5'-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3' och 5'- GGACAGCTTCACACATTTGC-3', respektive) i blommande kinesisk kål (figur 1A) och ”PT51333” (sekvenserna av framåt och bakåt primers är 5'- GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' och 5'- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3', respektive) i tobak (figur 1B). Pilarna pekar på målet SSR banden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: jämförelse av upptäckt effektiviteten för SSR markörer i tobak och blommande Kinakål genotyper använder olika silver färgprotokoll. PCR-produkterna var separerade i 6% av icke-denatureringen polyakrylamidgeler och färgade med fem publicerade silver färgning protokoll9,11,12,13,14 och den nya protokoll. Lane M är DNA storlek-markör. Lanes 1 till 4 representerar amplikoner av SSR primers av ”PT50903” (sekvenserna av framåt och bakåt primers är 5'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3 'och 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3', respektive) i fyra tobak genotyper. Lanes 5 till 8 ange amplikoner av SSR primers ”CX-43” (sekvenser av framåt och bakåt primers är 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3 'och 5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3', respektive) i fyra blommande Kinakål genotyper. Målet SSR banden anges med pilar. Denna siffra har ändrats från figur 2 Liu et al. 8 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: känslighet av protokollet mätt med 50-2000 bp DNA-markör på en icke-denatureringen polyakrylamidgel. Den första lanen var lastat med 1µL av DNA-markör med fragment storlekar av 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 1000, 1500 och 2000 bp, var och en på 10 ng/µL. De återstående proverna var laddad med en seriell utspädning 1:2 i föregående lanes. Detekterbara minimibeloppet för protokollet var 9,8 pg i 11th lane (2,2 pg/mm2 i ett 4.5 mm2 väl). Denna siffra har ändrats från figur 1 av Liu et al. 8. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Objekt | Sanguinetti et al. 9 | Qu et al. 11 | En et al. 12 | Byun et al. 13 | Kumar et al. 14 | Nytt protokoll |
| Kör tid (min) | 30 | 12 – 25 | 8 – 9 | 9 – 31 | 42 | 6 – 7 |
| Antal steg | 5 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 |
| Antalet reagenser | 5 | 6 | 6 | 5 | 7 | 3 |
Tabell 1: Kör tid, antal steg och reagenser som används i olika silver färgprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tvättning av gel efter impregnering är ett viktigt steg. Otillräcklig tvätt tid och vatten volym kan orsaka ofullständig avlägsnande av impregnering lösning på ytan av plattan och gelen, och resultera i en mörk bakgrund. Utveckla tid är ett annat viktigt steg, överexploatering kan resultera i en mörkbrun bakgrund med låg kontrast bild av DNA-fragment. Dessutom påverkar det impregnering steget avsevärt färgning effektivitet av DNA-fragment. Trots att förlänga impregnering tiden över 5 min eller öka AgNO3 belopp i impregnering lösningen inte avsevärt förbättrar färgning kvalitet, en minska impregneringen tid till mindre än 3 min eller minska mängden AgNO3 ( < 1 g) kan resultera i grå eller grunt svart DNA-fragment.
En snabb och enkel operation för effektiv DNA upptäckt är önskvärt för en silver färgning metod. Det nya protokollet som utvecklats i denna studie undviker fastställandet, stopp och flera tvätt steg beskrivs i andra protokoll6,9,10,11,12,13 , 14 utan att påverka färgning kvaliteten (figur 1 och figur 2), och kräver bara två enkla steg impregnering och utveckling som tar 7 min. Det nya protokollet är därför snabbare än alla de andra färgning protokoll nuvarande tillgängliga6,7,9,10,11,12, 13,14. Det nya protokollet kräver dessutom endast tre kemikalier, dvs. AgNO3, formaldehyd och NaOH, liknande belopp som används i andra protokoll6,7,9,10,11,12, 13,14, därför det nya protokollet är mer ekonomiskt och genererar mindre kemiska risker, som inte bara minskar kemiska kostnaden men också minimerar farliga materialhantering processen för extra kemikalier i den laboratorium.
Det nya protokollet producerat klara bilder med lågt bakgrundsljud för otvetydig detektering av SSR banding mönster i tobak och blommande Kinakål genotyper (figur 1). Det nya protokollet jämfört med andra protokoll, och producerade det bästa färgning effekt med lägsta bakgrundsljud och högsta bildkontrast (figur 2). I spänna av 50-500 bp, känsligheten i det nya protokollet för DNA upptäckt var mindre än 19,5 pg/µL (4,3 pg / mm2) med en lägsta koncentration på 9,8 pg/µL (2,2 pg/mm2) (figur 3), vilket är högre än som rapporterats i andra protokoll 7 , 12 , 13.
Även om fluorescens-märkning teknik kan ge hög genomströmning och resolution upptäckt av DNA amplikoner, kräver de specialutrustning och dyrare reagenser som inte kan nås för många biologiska laboratorier, särskilt de i utvecklingsländerna. Det nya färgning protokollet är enkelt och snabbt det kan skärmen ~ 800 DNA-prover per person och dag, således, är ett bra alternativ för dessa laboratorier för att utföra rutinmässiga forskning.
Sammanfattningsvis, det nya protokoll som utvecklats i denna studie är snabbare att processen, lättare att genomföra, billigare, och använder endast tre reagenser — utan att kompromissa med upptäckt effekt eller bild klarhet — än alla andra befintliga silver färgningsteknik. Den nya silver färgning protokoll har använts framgångsrikt i tobak och blommande Kinakål forskning och kan vara ett värdefullt verktyg för framgångsrik SSR genotypning hos andra arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av den Guangdong naturvetenskap Foundation i Kina (2015A030313500), den provinsiella nyckel internationella Cooperative Research Platform och stora vetenskapliga forskning projekt av Guangdong högre utbildning (2015KGJHZ015), vetenskapen och Plan för Guangdong tobak monopolförvaltningen (201403, 201705), vetenskap och teknik Plan i Guangdong i Kina (2016B020201001), den nationella innovationsprojekt utbildning för studenter (201711078001). Omnämnande av varunamn eller kommersiella produkter i denna publikation är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller bekräftelse av oss jordbruksdepartementet. USDA är en lika möjligheter leverantör och arbetsgivare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | - | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | - | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | - | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | - | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | - |
References
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).
