Summary
I denne artikel vil vise vi live billeddannelse af enkelte orme beskæftiger en brugerdefineret mikrofluid enhed. I enheden, er flere orme individuelt begrænset til separate kamre, så multipleksede langsgående overvågning af forskellige biologiske processer.
Abstract
I det sidste årti, mikrofluid teknikker har været anvendt til at studere små dyr, herunder nematode Caenorhabditis elegans, og har vist sig nyttige som en bekvem live imaging platform giver præcis kontrol af kapaciteter eksperimentelle betingelser i realtid. I denne artikel vil vise vi live billeddannelse af enkelte orme ansætte WormSpa, en tidligere udgivet brugerdefineret mikrofluid enhed. I enheden, er flere orme individuelt begrænset til separate kamre, så multipleksede langsgående overvågning af forskellige biologiske processer. For at illustrere kapacitet, udførte vi proof-of-principle eksperimenter hvor orme var smittet i enhed med patogene bakterier, og dynamikken i udtryk af immunrespons gener og æglægning blev overvåget løbende i de enkelte dyr. Den enkle design og drift af denne enhed gør det velegnet til brugere uden tidligere erfaring med mikrofluid-baserede eksperimenter. Vi foreslår, at denne tilgang vil være nyttig for mange forskere interesseret i længderetningen observationer af biologiske processer på veldefinerede betingelser.
Introduction
Ændringer i de miljømæssige forhold kan føre til aktivering af genetiske programmer ledsaget af induktion og repression af udtryk af specifikke gener1,2. Disse kinetic ændringer kan være variabel blandt væv i de samme dyr og mellem forskellige dyr. Undersøgelser af sådanne genetiske programmer kræver derfor metoder, der tillader langsgående billeddannelse af enkelte dyr og opnå præcis dynamisk styring af miljøforhold.
I de seneste år, har microfabricated fluidic enheder været brugt til at studere mange aspekter af reaktion og opførsel i små dyr, herunder orme, fluer, vand bjørne og flere3,4,5,6, 7. Programmer omfatter, for eksempel dybe fænotyper, optogenetic optagelse af neuronal aktivitet som svar på kemiske stimuli, og sporing af motor adfærd som bevægelse og pumpe8,9,10 , 11.
Mikrofluid-baserede tilgange holde mange egenskaber, der kunne gavne langsigtede langsgående billeddannelse af reaktion på miljømæssige stikord, herunder præcise dynamisk kontrol af de lokale mikromiljø, fleksibelt design, der giver mulighed for vedligeholdelsen af enkelte dyr i separate kvartaler og gunstige attributter for billeddannelse. Opretholde dyr i en mikrofluid afdeling i lang tid med minimal negativ indvirkning på deres godt væsener er dog en udfordring, som kræver særlig opmærksomhed i udformningen af mikrofluid enheden og i udførelsen af forsøget.
Her demonstrere vi brugen af WormSpa, en mikrofluid enhed for langsgående billeddannelse af Caenorhabditis elegans. 5 individuelle orme er begrænset i kamre. En konstant lav flow af flydende og bakteriel suspension sikrer orme er velnærede og tilstrækkelig aktiv til at bevare et godt helbred og lindre stress, og strukturen i afdelingerne tillader orme at lægge æg. Enkelheden i konstruktionen og driften af WormSpa bør tillade forskere uden tidligere erfaring i mikrofluidik at integrere denne enhed i deres egen forskningsplaner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen nedenfor bruger WormSpa5, en tidligere beskrevet mikrofluid enhed for langsgående billeddannelse af orme. Fabrikation af WormSpa (begyndende med CAD-filer, der kan opnås fra forfatterne på anmodning) er ligetil, men kræver nogle ekspertise. I de fleste tilfælde gøres der let fabrikation af en core facilitet eller en kommerciel virksomhed, der leverer sådanne tjenester. Når opdigte enheden, Sørg for at angive, at højden af funktionerne er 50 µm.
1. eksperimentel opsætning
- Mount mikrofluid enheden på en inverteret fluorescens mikroskop med en motoriseret fase.
- Placere en orbitalryster tæt på mikroskopet, men sørg for, at vibrationer fra shaker ikke påvirker direkte mikroskop. For eksempel sætte shaker på en hylde fast på væggen der gør ingen kontakt med den optiske tabel.
- Placer en sprøjten pumpe på en orbitalryster. Tape pumpe til shaker, således at det ikke jiggle under omrystning.
2. forberedelse af mikrofluid miljø
Bemærk: Under eksperimentet, fire sprøjter er tilsluttet mikrofluid enheden via sprøjte rør, som skitseret i figur 1. Dette trin beskriver forberedelsen af disse sprøjter. Medmindre andet er nævnt, holde sprøjte rør så korte som muligt uden at gøre dem stramt.
- Forbered en outlet sprøjte og en sprøjte slange. Denne sprøjte (S1 i figur 1) vil senere tilsluttet outlet af enhed gennem sprøjte rør og anvendes til midlertidig opbevaring af væske kommer ud af enheden.
- Gøre en adapter nålen ved at fjerne plastik dele af et 20 G x 1/2 tomme sprøjte tip, holder kun nålen (metaldel). Gøre dette ved at holde de plast og metal dele med tænger og trække dem fra hinanden. Resterende plast rester på nålen kan være brændt med en bunsenbrænder.
- Bøje kanylen geometri af opsætningen af eksperimenterende mens du holder dets to ender med tænger. I det design, der er beskrevet her, er bøjning nålen i sin midten i en vinkel på ~ 110° mest praktisk.
- Stik adapter nålen halvvejs ind i røret. Anden halvdelen vil senere blive tilsluttet enheden. Sprøjte røret skal være kompatibel med 20 G sprøjte spids uden en lækage (for eksempel slanger med indvendig diameter på 0,86 mm og udvendig diameter af 1.32 mm). Den anbefalede rørlængde er ~ 50 cm.
- Tilslut en 10 mL luer-lock sprøjte til andre (åbne) udgangen af sprøjten tube via en 20 G x 1/2 tomme sprøjte tip.
- Forberede buffer-indløb sprøjter og sprøjten rør. En af disse sprøjter (S2 i figur 1) bruges som et reservoir for den væske, der går til enheden og til at styre injektion flow. Andre sprøjten (S3 i figur 1) er påkrævet til buffer exchange, som forklaret i trin 3.2.
- Tilslut en 10 mL luer-lock sprøjte (S2) direkte til en 3-vejs ventil og Tilslut en anden sprøjte (S3) til samme ventilen via en sprøjte røret (figur 1): Tilslut S3 til tube via en sprøjte tip, og Tilslut røret til ventilen via en anden sprøjte tip.
Bemærk: Den rækkefølge, der er forbundet med disse materialer betyder ikke noget. - Tilslut en sprøjte slange til resterende porten af 3-vejs ventil. Forberede en anden adapter nål som i trin 2.1.2, og stik nålen halvvejs i andre (åbne) udgangen af sprøjten slangen.
- Sæt ventilen, således at sprøjte røret i trin 2.2.2 og S2 er forbundet, mens S3 er lukket (figur 1).
- Tilslut en 10 mL luer-lock sprøjte (S2) direkte til en 3-vejs ventil og Tilslut en anden sprøjte (S3) til samme ventilen via en sprøjte røret (figur 1): Tilslut S3 til tube via en sprøjte tip, og Tilslut røret til ventilen via en anden sprøjte tip.
- Forbered en orm-indløb sprøjte og en sprøjte slange. Denne sprøjte (S4 i figur 1) bruges til at indlæse orme i enheden.
- Tilslut en lang sprøjte slange til en 10 mL luer-lock sprøjte (S4). Angive længden af denne tube fra omfanget af den væske, der skal bruges til lastning; for eksempel, 100 cm af slangen understøtter over 2 mL af væske (Se også trin 4.2).
- Forberede en anden adapter nål som i trin 2.1.2, og stik en halvdel af nålen til andre (åbne) slutningen af sprøjten slangen.
- Skyl alle sprøjter og slanger med S-medium12 to gange. Fyld sprøjter og rør med S-medium, at tage sig for at fjerne alle luftbobler.
- Tilsluttes enhed outlet outlet sprøjte tube.
- Tilslut adapteren nålen i slutningen af sprøjten tube til udgangsporten.
- Indsprøjte en lille mængde af S-medium gennem outlet at fylde enheden, indtil en lille S-medium kommer ud af både buffer indløb og ormen indløb.
- Tilslut buffer-indløb sprøjte tube til buffer-indløbsstuds af enheden, mens plugging orm-fjorden med en pin (rustfrit stål dyvel pin med en 1/32-tommers diameter).
- Indsprøjtes et konstant flow af buffer i enheden. Indlæse buffer-indløb sprøjte S2 på en sprøjten pumpe13, og sæt pumpen så medium i S2 sprøjtes kontinuerligt til enheden ved en gennemstrømningshastighed på 3 µL/min.
3. Ilægning af bakterier i den mikrofluid enhed
- Forberede Escherichia coli OP50 suspenderet i S-medium12.
- Efter en standardprotokol, podes en 250 mL kolbe med 50 mL af LB og en enkelt koloni, og der inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Centrifugeres overnight kultur ved 4000 rpm i 10 minutter og resuspenderes i 30 mL af S-medium.
- Suspensionen filtreres på en 5 µm sprøjte filter. Måle den bakterielle koncentration af dets optisk tæthed på 600 nm (OD600), og justere koncentrationen til en OD600 af 3. Denne høj tæthed er forpligtet til at holde orme velnærede.
- Udveksle buffer i enhed med OP50 suspension.
- Forberede en ren sprøjte (S5) fyldt med OP50 suspension. Hold sprøjten lodret og tryk det flere gange for at indsamle alle luftboblerne i toppen.
- Slå 3-vejs ventil af buffer-indløb sprøjter at lukke forbindelsen til enheden, og Tilslut de to sprøjter, S2 og S3. Frigøre S2 fra sprøjten pumpe.
- Afbryde S2 fra ventilen og forbinde S5 til ventilen. Skubbe ud al luft indsamlet på toppen af S5 til S3 gennem ventilen indtil en lille smule af OP50 buffer går til S3. I den forbindelse at sikre at ingen luftboble forbliver i S5 eller ventilen.
- Drej 3-vejs ventilen tilbage til den oprindelige position til at lukke forbindelsen mellem S3 og S5 og tilsluttes enheden S5. Indlæse S5 på sprøjten pumpe. Tænd den orbitalryster, der holder pumpen. Indstille ryster hastigheden til ca 200 rpm.
- Angiv flow til at være 100 µL/min. Den tid det tager for en ny buffer at ankomme til orme i enheden afhænger af længden af buffer-indløb sprøjte tube (omkring 5 minutter med slangen beskrevet ovenfor). En højere strømningshastighed kan være ansat, hvis der kræves en hurtigere buffer exchange.
- Når OP50 buffer breder hele enheden, skal du indstille strømningshastigheden tilbage til 3 µL/min.
4. Ilægning af orme i mikrofluid-enheden
- Forberede en lille lav bindende microcentrifuge tube (650 µL) og fyld den med 100 µL af OP50 suspension. Overføre omkring 20-30 år-synkroniseret unge voksne orme (46 timer post L1 larver anholdelse ved 25 ° C) fra en NGM (ødelægge vækstmediet) agar plade til røret ved at samle dem én efter én med en orm pick. Alder-synkronisering kan ske til en standard-protokol12.
- Fylde orm-indløb sprøjte og sprøjte tube (S4 i figur 1) med OP50 suspension. Indsprøjtes ~ 500 µL af væsken i microcentrifuge tube med orme. Trække suspension med orm i orm-indløb sprøjte tube. Sørg for at sprøjte tube er lang nok (> 1 m) og at trukket orme bo i sprøjten tube ikke og gøre hele vejen til sprøjte S4.
- Tilslut S4 til orm-indgang. Injicere alle orm i orm-indløb sprøjte rør i mikrofluid enhed. Afbryde S4 og sprøjte tube. Sæt orm-fjorden med en PIN-kode.
- Frigøre buffer-indløb sprøjte S2 fra den mekaniske pumpe ( figur 1) og manuelt styre S1 og S2 for at skubbe alle ormene i separate kanaler. At trykke på S2 vil flytte orme i kanaler, mens du trykker på S1 vil bevæge dem i den modsatte retning. Når en kanal er indlæst, vil orm i hver kanal blokere indrejse af andre orme.
- Lad orme justere til det nye miljø for 2-3 timer.
5. oprettelse af en billeddannelse protokol
- Find alle orme, der er sikkert placeret i enheden, og sæt en tænkelig situation for hver af dem i image erhvervelse software, der styrer din mikroskop. Bemærk, at i nogle tilfælde (f.eks. når højere forstørrelse ønskes, eller når du bruger kameraer med en mindre CCD sensor) flere billeddannelse positioner er påkrævet for hver kanal.
Bemærk: Selv om dette kan gøres manuelt, nogle erhvervelse softwarepakker kan indlæse en tekstfil, der viser de positioner, hvor der tages billeder. Da disse positioner er bestilt regelmæssigt i WormSpa, kan en bruger skrive et lille script (f.eks. i Python eller kommerciel software), der opretter automatisk en sådan liste. Det præcise format af dette script vil afhænge af det filformat, der forventes af erhvervelse software (se et eksempel i supplerende materiale 1). - Indstil de påkrævede frekvens time-lapse Imaging. For eksempel sker billeddannelse af immun gen reaktion på infektion ved en frekvens på 10 minutter pr frame. Sørg for, at alle nødvendige kanaler (f.eks. lysfelt og normal god landbrugspraksis fluorescens) er erhvervet for hvert tidspunkt.
6. vært svar på Pseudomonas infektion
Bemærk: Dette trin er specifikke for at studere vært-patogen interaktioner. Alternativt, kan man udarbejde en buffer, som indeholder andre miljømæssige stikord af interesse (biotiske og abiotiske stressfaktorer, narkotika, signalering molekyler, osv.).
- Forberede Pseudomonas aeruginosa PA14 suspenderet i SK-medium14.
- Podes en 250 mL kolbe med 50 mL af LB og en enkelt koloni, og der inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Podes en anden 250 mL kolbe med 50 mL af LB og en alikvot del af kulturen, og der inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Centrifugeres overnight kultur ved 4000 rpm i 10 minutter og resuspenderes i 10 mL af SK-medium. Måle den bakterielle koncentration og justere koncentrationen til OD600 = 4.
- Overføre suspension til en ren kolbe, og der inkuberes ved 37 ° C i 24 timer og ved 25 ° C i yderligere 24 timer under omrystning. Dette trin efterligner trinnet plade-inkubation i drab assay14-standarden.
- Suspensionen filtreres på en 5 µm sprøjte filter. Dette er for at forhindre bakteriel aggregater fra tilstopning enheden.
- Udskift OP50 suspension i enheden med PA14 suspension, efter samme procedure som i trin 3.2. Holde imaging til 10 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alder-synkroniseret unge voksne orme (46 timer post L1 larver anholdelse ved 25 ° C)12 blev indlæst på enheden, som beskrevet i protokollen. Ormene var individuelt placeret i separate kanaler, aktivering af langsgående måling af dyrenes svar til patogenet. Når eksperimentet er vellykket, forbliver de fleste orme i deres kanaler for varigheden af forsøget. I dette tilfælde tages billeder af individuelle orme simpelthen ved at placere deres kanal i imaging stien, undgå behovet for at finde aktivt dyret. Figur 2 A viser lysfelt billeder af en enkelt repræsentant orm i løbet af 10 timer i enheden. Mens orme er begrænset inden for deres kanaler, de kan flytte op - og nedstrøms, og kan frit vende deres hoveder. Dette er afgørende for at sikre, at selve enheden ikke forårsage stress eller skade dyrene.
Vi overvågede svar af orme til bakteriel infektion af P. aeruginosa, en af de bedst undersøgte bakterielle patogener af C. elegans. Det er også en opportunistisk menneskelige patogen, som forårsager infektion i cystisk fibrose og immunkompromitterede patienter. Fodring af orme med bestemte stammer af P. aeruginosa, som den kliniske isolere PA14, fører til dødelige tarm infektion, og virulens faktorer involveret i denne proces er også involveret i infektion af pattedyr værter. 14 , 15
For at undersøge mønstret af ændringer i genekspression under bakteriel infektion, kan være ansat fluorescerende journalister. Blandt mange gener, der viser dynamisk reaktion på infektion, vi overvåges irg-1 (infektion svar gen 1), transcriptional reaktion af imaging normal god landbrugspraksis fluorescens fra transgene orme at udtrykke irg-1::GFP (AU0133 [agIs17 () pirg-1::GFP; pmyo-2::mCherry)], fremstillet af Ausubel lab). IRG-1 er kendt for at være stærkt induceret i tarmen af inficerede dyr i den tidlige fase af infektion af P. aeruginosa PA14. 16 , 17 Figur 2 B viser time lapse billeder af en repræsentativ orm (det samme dyr som i fig. 2A). Hver fluorescens billede blev taget straks efter den tilsvarende lysfelt billede. I de første 5 timer efter infektion, normal god landbrugspraksis fluorescens øger kun mildt i midten af kroppen og halen. Derefter, en betydelig stigning i Fluorescens er observeret, startende fra midten af kroppen. Den samlede fluorescens i hver orm er afbildet i figur 2C som funktion af tiden efter infektion. Disse data illustrere ikke kun tidligere beskrevet induktion af irg-1 efter PA14 infektion, men også den orm til worm variation i timingen og omfanget af induktion.
Udformningen af enheden WormSpa mikrofluid omfatter filtre som indsamler æg lagt af hver individuel orm5. Når æggene klækkes, er L1 larver skyllet igennem filteret og ind i outlet rør. Dette tillod os at manuelt overvåge individuelle orme æg-æglæggende forsvindingskinetik under bakteriel infektion. Time lapse billeder af æg lagt af den samme orm som i figur 2 er vist i fig. 3A. Disse billeder blev taget lige efter de tilsvarende lysfelt billeder i figur 2A. Det kumulative antal æg lagt af hver orm er vist som funktion af tiden efter infektion i figur 3B, og den gennemsnit og standardafvigelse over hele befolkningen er vist i figur 3C. Disse data capture dyr at dyr variabilitet samt den tidligere beskrevet tilbagegang i æglægning som infektion skrider frem. Derimod i ikke-inficerede dyr æglægning sats ikke falde indtil det toppe på ~ 54 timer post L1 på 25 ° C5,18.
Figur 1: eksperimentelle ordningen live Imaging af orme i en mikrofluid enhed. Orme er indlæst i enheden via orm indløb, og er efterfølgende skubbet i separate kanaler. Bakteriel suspension sprøjtes ind enheden fra buffer indløb af en mekanisk pumpe monteret på en orbitalryster. Bufferen udgange via udgangsporten på enheden. Fire sprøjter (S1, S2/S5, S3 og S4) bruges til at betjene enheden. De røde stiplede linjer er sprøjten rør forbinder sprøjter og enheden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentant gen expression kinetik. Time lapse billeder af en repræsentativ orm taget af Bright-felt, (A) og (B) NGL Fluorescens mikroskopi. Længst til venstre billederne blev taget lige før patogenet blev indført, mens de højreste billeder blev taget 10 timer efter infektion af PA14. Tidsintervallet mellem billeder er 1 time. (C) tid kurset samlede irg-1:: normal god landbrugspraksis fluorescens i individuelle orme. Hver enkelt række svarer til et enkelt dyr. Rækker blev sorteret i faldende rækkefølge efter gennemsnitlig fluorescens. Fluorescens intensitet er farvekodede og farveskalaen er vist til højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative æglægning kinetik. (A) Time lapse billeder af antallet af æg lagt af den samme orm, vist i figur 2A og B. Længst til venstre billederne blev taget lige før patogenet blev indført, mens de højreste billeder blev taget 10 timer efter infektion af PA14. Tidsintervallet mellem billeder er 1 time. (B) tid løbet af kumulative antal æg i individuelle orme. Hver enkelt række svarer til et enkelt dyr. Rækker blev sorteret i faldende rækkefølge efter det samlede antal æg lagt pr. orm. Antallet af æg er farvekodede og farveskalaen er vist til højre. (C) det gennemsnitlige antal æg lagt pr. orm som funktion af tiden. Det grå område angiver ± én standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende materiale 1: et eksempelscript, som opretter en tekstfil, der indeholder de billeddiagnostiske positioner for alle kanaler i WormSpa enheden. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrofluid værktøjer giver flere fordele i at studere orme. Imaging i en PDMS tilbyder indretning højere billeddiagnostiske kvalitet sammenlignet med en standard NGM agar plade. Flere billeder kan tages fra et enkelt worm, i modsætning til traditionelle metoder, hvor dyr er plukket fra pladen og monteret på et objektglas til billedbehandling. Derudover kan mikromiljø, orme bor holdes konstant eller moduleret som ønsket, tillader præcis kortlægning mellem sammensætningen af miljøet og svar af dyrene.
Her vist vi, hvordan du udfører en langsgående måling af host reaktion på bakteriel infektion af imaging svar af flere individuelle orme til den opportunistisk patogen P. aeruginosa PA14 ved hjælp af en brugerdefineret mikrofluid enhed (WormSpa). Både lyse-feltet og fluorescens billeder blev taget på flere gange uden forstyrrende det igangværende eksperiment. Især kinetik af æglægning og genekspression irg-1 var probed hvert 10 minut, en betydelig stigning i tidsmæssige opløsning over traditionelle metoder14,15.
I denne enhed, kan langsgående målinger af flere orme udføres ved at revidere den gemte placering af hver orm på ethvert givet tidspunkt. Dette blev demonstreret i figur 2C og 3B, hvor vi kvantificere irg-1:: normal god landbrugspraksis fluorescens og æg lagt af individuelle orme. Disse tal viser, at orme viser bred vifte af kinetic profiler. Som tidligere vist i én celle undersøgelser19,20,21, kan denne individualitet bruges til at forstå design af genetiske kredsløb, samt sammenhængen mellem forskellige veje19, 22.
For vellykkede eksperimenter er det kritisk at indlæse orme i enhedens mikrofluid hurtigt. Mens orme kravle på agar overfladen, de har tendens til thrash i flydende miljø, og denne adfærd inducerer en genetisk program hvor AMP aktiveret protein kinaser er involveret23,24. For at minimere denne uønskede undertrykkelse af netbårne, er det vigtigt at placere orme i deres separate kamre hurtigt, da mikrostrukturer i salen og luft permeabilitet af PDMS giver orme med et miljø, der efterligner fast overflade. 5 selv om højere pressionsmiddel hjælper lastning orme hurtigere, presse enheden for meget kunne fremkalde mekanisk stress på orme. Orme, der er alvorligt stresset gør ikke foder eller lægge æg, hvilket resulterer i et klart observerbare sække fænotype25. Efter ladning fodres orme E. coli OP50 for 2-3 timer, så orme til at tilpasse sig mikrofluid miljøet og giver forskeren mulighed for at observere dyrene og kassere dem, der blev beskadiget.
Størrelse og afstand af mikrostrukturer i hver afdeling er optimeret til ormene vokset til 46 timer fra L1 anholdelse på 25 ° C. Strukturerne, der kan skaleres op til at studere ældre orme eller nedsat for at undersøge L4 larver, som er mindre i størrelse. Orme er imidlertid ikke købedygtig med held molt i salen, udelukker undersøgelse af post embryonale udvikling i denne enhed. For sådanne ansøgninger betragtes metoder såsom WorMotel26 . Da orme er begrænset, men ikke immobiliseret i WormSpa, afhænger af en vellykket holdbare eksperiment om dyrenes ophold i salen. Vi finder, at dette kan være udfordrende for tidligt larver, mandlige voksne og nogle hermafrodit mutanter.
Stedet for at bruge en enkelt buffer inlet (i midten af øverst, figur 1), kan de to hovedet ballon-formet fjorde bruges samtidig. Fylde de to sprøjter med forskellige buffere, kan man generere tidsligt struktureret miljøer ved at trykke på forskellige sprøjter på andet tidspunkt. Dette, for eksempel tillader undersøgelse af tilpasning til skiftende miljø. 27 , 28
Som nævnt ovenfor, kan den mikrofluid enhed, der beskrives her bruges til en bred vifte af andre programmer. Disse omfatter at studere svar til andre miljømæssige stikord. Sådanne reaktioner kan omfatte ændringer i genekspression og æglægning adfærd, som eksemplificeret her, men også ændringer i stofskiftet og fedt ophobning (f.eks. gennem fedt farvning af Nilen rød), neuronal fysiologi og signalering (f.eks. af calcium imaging og optogenetic perturbationer), ændringer i motor adfærd såsom pumpning, afføring og hoved bevægelse (via automatiseret kvantitative billeddannelse af time-lapse sekvenser), og meget mere.
Endelig, denne tilgang er i vid udstrækning automatiseret og reducerer den arbejdsmængde, der kræves for lange eksperimenter over mange timer, endda dage. Når placeringen af individuelle orme er gemt i data erhvervelse software, består eksperimentet af automatisk registrering af billeder mens den mekaniske pumpe controller fastholder den konstante flux af buffer i enheden. Vigtigere, fabrikation af en WormSpa enhed kræver ikke nogen mere end standard bløde litografi protokol, og dens udformning og drift er simpelt nok selv til forskere uden tidligere erfaring i mikrofluidik. Med de forskellige fordele diskuteret ovenfor og relativt enkle forberedelsestrin, kan denne tilgang være nyttigt at dem, der overvejer langsgående måling af levende orm under nøjagtigt kontrollerede forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af National Science Foundation gennem tilskud PHY-1205494 og MCB-1413134 (EL) og National Research Foundation i Korea grant 2017R1D1A1B03035671 (bekymret).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
References
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
- Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
- Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
- Stiernagle, T.
- NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , New Era Pump Systems Inc. (2017).
- Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
- Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
- Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J.
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
- Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).
