التعبير المشارك من البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك متعددة بطريقة فعالة في النباتات
Summary
قمنا بتطوير طريقة جديدة للتعبير عن المشترك متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات للتغلب على صعوبات الطرق التقليدية. ويستفيد من استخدام بلازميد تعبير واحد يحتوي على بروتين مستقلة وظيفيا متعددة معربا عن أشرطة الكاسيت لتحقيق التعبير البروتين المشارك.
Abstract
معلومات حول localization(s) سوبسيلولار الزمانية المكانية للبروتين أمر بالغ الأهمية لفهم وظائفها الفيزيولوجية في الخلايا. البروتينات الفلورية وجيل من البروتينات الفلورية الانصهار بعنف استخدمت كأداة فعالة لتصور مباشرة التعريب البروتين والديناميات في الخلايا. أنها مفيدة بشكل خاص لمقارنتها مع علامات عضية المعروفة بعد التعبير المشترك مع البروتين للفائدة. ومع ذلك، النهج الكلاسيكي للتعبير البروتين المشارك في النباتات عادة ما تنطوي على عدة التعبير المستقل والبلازميدات، وبالتالي السلبيات التي تشمل التعبير المشارك منخفضة الكفاءة وتباين مستوى التعبير، وحان الوقت النفقات في عبور الوراثية والفحص. في هذه الدراسة، ونحن تصف طريقة قوية ورواية للتعبير المشترك من البروتينات الفلورية تشيميريك متعددة في النباتات. أن يتغلب على أوجه قصور الأساليب التقليدية باستخدام ناقل تعبير واحد يتكون من عدة أشرطة الكاسيت وإذ تعرب عن شبه مستقلة. كل كاسيت التعبير البروتين يحتوي على عناصر التعبير البروتين الفنية الخاصة به، ولذلك يمكن تعديله مرونة لتلبية الطلب التعبير متنوعة. كما أنها سهلة ومريحة لأداء الجمعية والتلاعب بالحمض النووي وشظايا في بلازميد التعبير باستخدام فعل أمثل في خطوة واحدة دون الهضم إضافية وخطوات عملية ربط. وعلاوة على ذلك، فإنه متوافق تماما مع التكنولوجيات الحيوية-التصوير الفلورسنت البروتينات المشتقة الحالية والتطبيقات، مثل الحنق وبيفك. كعملية التحقق من الأسلوب، استخدمنا هذا النظام الجديد إلى مستقبلات الفرز رغوي المشارك إكسبريس فلوريسسينتلي تنصهر وبروتينات الغشاء الناقل الافرازية. وتبين النتائج أن تعريب سوبسيلولار منظور هي نفسها كما هو الحال في دراسات سابقة بتعبير عابر والتحول الوراثي في النباتات.
Introduction
تعتبر البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك كأدوات مفيدة لدراسة الديناميات داخل الخلايا والتعريب سوبسيلولار وكذلك فهم الوظائف الفسيولوجية وعمل آليات1،2، 3 , 4-أنه مفيد خصوصا للبروتينات مراسل عضية المعروفة إكسبرس المشارك مع البروتين في السؤال لتوضيح أفضل الأساس المنطقي الزمانية المكانية وتوزيع الدالة داخل منظومة اندوميمبراني في خلايا4 , 5 , 6 , 7 , 8.
ويمكن التعبير عن بروتين انصهار نيون تشيميريك في النباتات عن طريق التعبير عابرة والتحول الوراثي المستقرة، التي لديها مزايا كل منهما وقيود9،،من1011. تعبير عابر من البروتين هو نهج مناسب يتضمن biolistic-القصف، البولي إثيلين غليكول (شماعة)-، أو بوساطة انهانسر تعبير عابر الحمض النووي في بروتوبلاستس و المتبعة-وساطة التسلل إلى أوراق خلايا نباتية سليمة، كما هو مبين في الشكل 1 ألف، ب12،13،14،،من1516. بيد أن التعبير المشارك متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في خلية نبات واحدة يتطلب مزيج البلازميدات التعبير مستقلة عدة. وهكذا، عيوب استخدام البلازميدات متعددة للتعبير البروتين المشارك في النباتات أدنى مستويات التعبير المشترك بسبب فرصة والبلازميدات عدة في نفس الوقت إدخال نفس الخلايا عند بلازميد واحد، بالمقارنة مع انخفاض كبير اختلافات مستويات التعبير البروتين تسبب بمقدار حسيب عشوائي لكل أنواع بلازميد نقله إلى خلية17،18. وبالإضافة إلى ذلك، أنها تمثل تحديا من الناحية التقنية ﻹدخال عدة التعبير المستقل والبلازميدات مفردة المتبعة للبروتين المشارك التعبير9،،من1011. ولذلك، المتبعة-وساطة البروتين يترك التعبير عابر بتسلل التبغ فقط قادرة على التعبير عن بلازميد واحد في كل مرة، كما هو مبين في الشكل 1 باء. في المقابل، جيل نباتات المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية الانصهار عادة ما يتحقق عن طريق المتبعة التي يحمل ناقل ثنائي تحول. ومع ذلك، ناقل ثنائي أن يتوسط في نقل الجينات والإدراج في جينومات النباتات فقط قادرة على التعبير عن انصهار فلورسنت مفردة بروتين (الشكل 1B)9،،من1012. توليد نبات المعدلة وراثيا التي تعبر عن العديد من البروتينات الفلورية تشيميريك في وقت واحد يتطلب جولات متعددة من عبور الوراثية والفحص، التي يمكن أن تتخذ من أشهر إلى سنوات اعتماداً على عدد الجينات لتكون المشترك أعرب.
توظيف أبلغ تعبير واحد متجه للمشارك التعبير متعددة من البروتينات في النباتات قبل عدة السابقة الدراسات19،،من2021. ومع ذلك، جولات متعددة من الهضم الأنزيمي وربط الحمض النووي من جزيئات الحمض النووي وناقلات العمود الفقري مطلوبة عادة لتوليد بلازميد النهائي للبروتين المشارك أو تعبير الإفراط. وهنا، قمنا بتطوير طريقة جديدة وقوية للتعاون معربا عن البروتينات الفلورية تشيميريك متعددة في النباتات. وهي طريقة كفاءة عالية ومريحة ليحقق متعددة البروتين التعبير المشارك في النباتات للتعبير عابرة على حد سواء وتحول مستقر في طريقة العريقة. ويعمل ناقل واحد يحتوي على عدة شرائط التعبير البروتين مستقلة وظيفيا للبروتين المشارك التعبير ومما يتغلب على عيوب الأساليب التقليدية. وعلاوة على ذلك، وهو نظام متعدد الاستخدامات بدرجة في الحمض النووي الذي تحقق بفعل خطوة واحدة بسيطة الأمثل دون اتخاذ خطوات إضافية لهضم الحمض النووي وربط التلاعب والجمعية. ويتضح مبدأ العمل في الشكل 2. وعلاوة على ذلك، فإنه متوافق تماما مع النهج الخلوية والجزيئية والكيمياء الحيوية الحالية التي تعتمد على البروتينات تشيميريك الانصهار الفلورسنت.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا لقد أظهرنا طريقة جديدة للتعبير عن المشاركة قوة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات. فإنه يمكن استخدامها للتعبير عابرة والتحول الوراثي ومتوافق مع الحالية الفلورسنت القائم على البروتين بيو-التصوير الجزيئي والكيمياء الحيوية تطبيقات وتكنولوجيات9،<sup c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر أعضاء المختبر وانغ لإجراء مناقشات مفيدة وتعليقات. يدعمه هذا العمل الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (تشرف، المنحة رقم 31570001) ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ ومدينة قوانغتشو (منح رقم 2016A030313401 و 201707010024) للأب
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
Referências
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
- Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice” by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
