ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים
Summary
פיתחנו שיטה לביטוי בשיתוף מספר חלבונים chimeric פיוז’ן פלורסנט בצמחים כדי להתגבר על הקשיים של שיטות קונבנציונליות. זה לוקח את היתרון שבשימוש של פלסמיד ביטוי יחיד המכיל מספר חלבון פונקציונלית עצמאית המבטאת קלטות כדי להשיג חלבון ביטוי משותף.
Abstract
מידע על localization(s) subcellular זמן-מרחבי של חלבון חיוני להבין את פונקציות פיזיולוגיים בתאים. חלבונים פלורסנט והפקת חלבונים פיוז’ן פלורסנט בפראות שימשו ככלי יעיל ישירות להמחיש את החלבון לוקליזציה ואת הדינמיקה של תאים. זה שימושי במיוחד להשוות אותם עם סמנים אברון ידועים לאחר ביטוי משותף עם החלבון של עניין. יחד עם זאת, גישות קלאסיות להבעה שיתוף חלבון צמחי בדרך כלל כרוכים פלסמידים מרובים ביטוי עצמאי, לכן יש חסרונות הכוללים יעילות נמוכה ביטוי משותף, ביטוי ברמת וריאציה ושעת גבוהה ההוצאה לשירותים חציית וסינון גנטי. במחקר זה, אנו מתארים שיטה חזקות רומן ביטוי משותף של מספר חלבונים פלורסנט chimeric בצמחים. זה מתגבר על המגבלות של השיטות המקובלת באמצעות וקטור ביטוי יחיד המורכבת מספר קלטות לביטוי עצמאיות-למחצה. שכל קלטת ביטוי חלבון מכילה אלמנטים ביטוי חלבון פונקציונלי משלו, ולכן זה יכול להיות גמישה מותאם כדי לעמוד בביקוש ביטוי מגוונים. בנוסף, זה נוחה וקלה לביצוע ההרכבה, מניפולציה של ה-DNA קטעים בתוך פלסמיד הביטוי על-ידי שימוש לתגובה בשלב אחד אופטימיזציה ללא עיכול נוספים וצעדים מצדו. יתר על כן, זה תואם באופן מלא עם הנוכחי חלבון פלואורסצנטי נגזר הדמיה טכנולוגיות ויישומים, כמו סריג ו BiFC. כמו אימות של השיטה, אנחנו מועסקים מערכת חדשה זו כדי קולטן מיון vacuolar אקספרס שיתוף fluorescently התמזגו, מנשא הפרשה קרום חלבונים. התוצאות מציגות הגרסא המקומית subcellular הפרספקטיבה שלהם. הם כמו מחקרים קודמים על ידי ביטוי ארעי והן שינוי גנטי בצמחים.
Introduction
Chimeric פיוז’ן פלורסנט חלבונים התייחסו כמו כלים שימושיים ללמוד dynamics תאיים ולוקליזציה subcellular ולהבין יותר פונקציות פיזיולוגיים שלהם ואת העבודה מנגנונים1,2, 3 , 4. זה מועיל במיוחד אקספרס שיתוף אברון ידועים כתב חלבונים עם החלבון המדובר כדי להמחיש טוב יותר את הרציונל ייתכן הפצה, function(s) בתוך מערכת endomembrane תאים4 , 5 , 6 , 7 , 8.
חלבון chimeric פיוז’ן פלורסנט יכולה להתבטא צמחים באמצעות הבעה ארעי, שינוי גנטי יציב, אשר יש מגבלות9,10,11והיתרונות המתאימות שלהן. הביטוי ארעית של חלבון היא גישה נוחה הכוללת הפגזה biolistic-, פוליאתילן גליקול (PEG)-, או בתיווך אלקטרופורציה אן ארעי ביטוי protoplasts, Agrobacterium-מתווכת עלה בחדירת בתאי צמח שלם, כפי שמוצג באיור 1A, B12,13,14,15,16. עם זאת, ביטוי משותף של מספר חלבונים chimeric פיוז’ן פלורסנט בתא צמח דורש תערובת של מספר פלסמידים ביטוי עצמאי. כך, החסרונות של העסקת פלסמידים מרובים להבעה שיתוף חלבון צמחי הם ביטוי שיתוף התחתונות עקב הסיכוי מופחת באופן דרמטי של פלסמידים כמה בו זמנית נכנסים לאותם התאים בהשוואה פלסמיד יחיד, ו וריאציות של רמות ביטוי החלבון הנגרם על ידי הכמות אקראי ללא שליטה של כל סוגי פלסמיד מועבר לתוך התא17,18. בנוסף, זה מאתגר מבחינה טכנית להציג מספר פלסמידים ביטוי עצמאי לתוך יחידה Agrobacterium חלבון ביטוי שיתוף9,10,11. לכן, Agrobacterium-חלבון בתיווך ביטוי ארעי על-ידי הסתננות של טבק עוזב הוא רק מסוגל לבטא פלסמיד אחד בכל פעם, כפי שמוצג באיור 1B. לעומת זאת, דור של הצמחים הטרנסגניים המבטאים חלבונים פיוז’ן פלורסנט בדרך כלל מושגת על ידי Agrobacterium שנושאת וקטור טרנספורמציה בינארי. אולם, הווקטור בינארי המעביר את העברה גנטית ואת הכניסה לתוך הגנום הצמח הוא רק מסוגל לבטא של פיוז’ן ניאון יחיד חלבון (איור 1B)9,10,12. יצירת צמח מהונדס אשר מבטא חלבונים פלורסנט chimeric שונים בו זמנית דורש מספר סבבי ומעבר ההקרנה, אשר יכול לקחת חודשים עד שנים בהתאם המספרים של הגנים. להיות שותף ביטוי גנטי.
העבודה שוקטור ביטוי יחיד עבור ביטוי משותף של מספר חלבונים בצמח דווחה על-ידי מספר הקודם מחקרים19,20,21. עם זאת, מספר סיבובים של עיכול אנזימטי ו- DNA מצדו של מולקולות DNA ווקטורים עמוד השדרה נדרשים בדרך כלל לדור של פלסמיד סופית הביטוי שיתוף חלבון או לביטוי יתר. . הנה, פיתחנו שיטה חדשות ואיתנות לביטוי בשיתוף מספר חלבונים פלורסנט chimeric בצמחים. זה שיטה נוחה ויעילה מאוד משיגה חלבון מרובים שותף ביטוי בצמחים הן ביטוי ארעי וטרנספורמציה יציב בצורה ששורשיה. היא מעסיקה וקטור יחידה מכיל מספר קלטות ביטוי חלבון פונקציונלית עצמאית לביטוי שיתוף חלבון, ובכך גובר על החסרונות של שיטות קונבנציונליות. יתר על כן, זה מערכת רב תכליתי בדנ א איזה מניפולציות והרכבה מושגות על ידי תגובה פשוט צעד אחד אופטימיזציה ללא שלבים נוספים של ה-DNA לעיכול, מצדו. עקרון הפעולה מודגם באיור2. יתר על כן, זה תואם באופן מלא עם הסלולר מולקולרית, ביוכימיה לגישות המבוססות על חלבונים chimeric פיוז’ן פלורסנט.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנחנו הדגים שיטה להביע robustly משותפת chimeric פיוז’ן פלורסנט חלבונים בצמחים. זה יכול לשמש הן ביטוי ארעי ושינוי גנטי והוא תואם עם הנוכחי פלורסנט חלבון מבוססת הדמיה מולקולרית, ביוכימיה יישומים וטכנולוגיות9,10,13 . בנוסף, הכלי מתגבר את הקשיים של ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים חברי המעבדה וואנג מועיל דיונים והערות. עבודה זו נתמכת של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (NSFC, מענק מס 31570001) קרן מדעי הטבע של בפרובינצית גואנג-דונג ואת בעיר גואנגג’ואו (מענק מס 2016A030313401 ו- 201707010024) כדי ה. ו
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
Referências
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
- Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice” by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
