Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten
Summary
We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.
Abstract
Informatie over de spatio subcellular localization(s) van een eiwit is kritiek te begrijpen zijn fysiologische functies in cellen. Fluorescente proteïnen en generatie van fluorescerende fusion eiwitten zijn wild gebruikt als een effectief instrument te visualiseren direct het eiwit lokalisatie en de dynamiek in de cellen. Het is vooral nuttig om ze te vergelijken met bekende organel markeringen na co expressie met de proteïne van belang. Toch klassieke benaderingen voor co eiwituitdrukking in planten meestal sprake van meerdere onafhankelijke expressie plasmiden, en daarom hebben nadelen die lage co expressie efficiëntie, expressie-niveau variatie en hoog tijd bevatten uitgaven in genetische oversteken en screening. In deze studie beschrijven we een robuuste en nieuwe methode voor co expressie van meerdere chimeer fluorescente proteïnen in planten. Het overwint de beperkingen van de conventionele methoden met behulp van een enkele uitdrukking vector, dat is samengesteld uit meerdere semi-onafhankelijke waarin cassettes. Elk eiwit expressie cassette bevat eigen functioneel eiwit expressie-elementen, en daarom het flexibel kan worden aangepast om te voldoen aan de vraag van de diverse expressie. Ook, het is eenvoudig en handig voor het uitvoeren van de vergadering en manipulatie van DNA fragmenten in het plasmide expressie met behulp van een geoptimaliseerde one-step reactie zonder extra spijsvertering en Afbinding stappen. Bovendien, het is volledig compatibel met de huidige TL eiwitten bio-imaging technologieën en applicaties, zoals FRET en BiFC. Als een validatie van de methode werken we dit nieuwe systeem Co express fluorescently gesmolten vacuolar sorteren receptor te secretoire vervoerder membraaneiwitten. Uit de resultaten blijkt dat hun vooruitzichten subcellular lokalisaties hetzelfde als in eerdere studies door voorbijgaande expressie zowel genetische transformatie bij planten zijn.
Introduction
Chimeer fluorescerende fusion eiwitten werden beschouwd als een nuttig instrument te bestuderen van intracellulaire dynamiek en subcellular localisatie en verder begrijpen hun fysiologische functies en werkende mechanismen1,2, 3 , 4. het is vooral gunstig voor Co express bekende organel verslaggever eiwitten met het eiwit in kwestie beter illustreren de spatio grondgedachte, distributie en functie (s) binnen het endomembraansysteem in cellen4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Een chimeer fluorescerende fusieproteïne kan worden uitgedrukt in planten via voorbijgaande expressie en stabiele genetische transformatie, die hun respectieve voordelen en beperkingen9,10,11 hebben. Voorbijgaande uitdrukking van een eiwit is een handige aanpak waarin biolistic bombardement-, polyethyleenglycol (PEG)-, of electroporation-gemedieerde DNA voorbijgaande expressie in protoplasten en Agrobacterium-gemedieerde blad infiltratie in intact plantencellen, zoals weergegeven in figuur 1A, B12,13,14,15,16. Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in een enkele plant cel vereist echter een mix van verschillende onafhankelijke expressie plasmiden. De nadelen van het gebruik van meerdere plasmiden voor co eiwituitdrukking in planten zijn dus lagere CO expressie toe te schrijven aan de sterk verminderde kans op verschillende plasmiden gelijktijdig invoeren dezelfde cellen in vergelijking met een enkele plasmide, en de varianten van eiwit expressie niveaus veroorzaakt door het ongecontroleerd willekeurige hoeveelheid elke soorten plasmide wordt overgebracht in de cel17,18. Bovendien is het technisch uitdagend te introduceren van verschillende onafhankelijke expressie plasmiden in een enkele Agrobacterium voor eiwit co expressie9,10,11. Daarom Agrobacterium-gemedieerde eiwit voorbijgaande expressie door infiltratie van tabak verlaat is alleen geschikt voor het uitdrukken van een plasmide tegelijk, zoals weergegeven in figuur 1B. In tegenstelling, wordt generatie transgene planten uiting van fluorescerende fusion eiwitten gewoonlijk bereikt door Agrobacterium die een binaire transformatie-vector draagt. De binaire vector die de genenoverdracht en inbrengen in het genoom van de plant bemiddelt is echter alleen geschikt voor het uitdrukken van een enkele fluorescerende fusion eiwit (figuur 1B)9,10,12. Het genereren van een transgene plant die gelijktijdig verschillende chimeer fluorescente proteïnen uitdrukt vereist meerdere rondes van genetische kruising en screening, die kan maanden tot jaar afhankelijk van de nummers van de genen tot duren samen uitgedrukt worden.
De werkgelegenheid die de speerpunt van een enkele uitdrukking voor co expressie van meerdere eiwitten in de plant is gemeld door verscheidene vorige studies2120,19,. Meerdere rondes van de enzymatische spijsvertering en DNA Afbinding van DNA moleculen en ruggengraat vectoren zijn echter meestal vereist voor generatie van de definitieve plasmide voor co eiwituitdrukking of overmatige expressie. Hier hebben we een nieuwe en robuuste methode voor het uitdrukken van meerdere chimeer fluorescente proteïnen in planten samen ontwikkeld. Het is een zeer efficiënte en handige methode die meerdere co eiwituitdrukking in planten voor zowel voorbijgaande expressie en stabiele transformatie in een aloude mode behaalt. Het maakt gebruik van een enkele vector die meerdere functioneel onafhankelijk eiwit expressie cassettes voor co eiwituitdrukking bevat en daardoor ondervangt de nadelen van de conventionele methoden. Bovendien, het is een zeer veelzijdig systeem waarin DNA manipulaties en vergadering worden bereikt door een eenvoudige one-step geoptimaliseerd reactie zonder extra stappen van DNA spijsvertering en afbinding. Het werkingsprincipe is geïllustreerd in Figuur 2. Bovendien, het is volledig compatibel met de huidige cellulaire, moleculaire en biochemische benaderingen die zijn gebaseerd op chimeer fluorescerende fusie-eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben wij een nieuwe methode om te krachtig drukken mede chimeer fluorescerende fusion eiwitten in planten aangetoond. Het kan worden gebruikt voor zowel voorbijgaande expressie en genetische transformatie en is compatibel met de huidige TL proteïne gebaseerde bio-imaging, moleculaire en biochemische toepassingen en technologieën9,10,13 . Bovendien, overwint het de problemen van de conventionele methoden die gebruikmaken…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van het laboratorium van de Wang voor nuttige discussies en opmerkingen. Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC, subsidie nr. 31570001) en de Natural Science Foundation van de Guangdong provincie en Guangzhou stad (nr. 2016A030313401 en 201707010024) aan H.W.
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
Referências
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
- Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice” by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
