Co udtryk for flere kimære fluorescerende Fusion proteiner på en effektiv måde i planter
Summary
Vi har udviklet en ny metode til at co udtrykke flere kimære fluorescerende fusion proteiner i planter til at overvinde vanskelighederne af konventionelle metoder. Det tager fordel ved at bruge en enkelt udtryk plasmid som indeholder flere funktionelt uafhængige protein udtrykker kassetter for at opnå protein Co udtryk.
Abstract
Oplysninger om den spatiotemporelle subcellulært localization(s) af en protein er afgørende for at forstå dens fysiologiske funktioner i celler. Fluorescerende proteiner og generation af fluorescerende fusion proteiner har været vildt bruges som et effektivt redskab til direkte visualisere protein lokalisering og dynamik i celler. Det er især nyttigt at sammenligne dem med velkendte organelle markører efter Co interessetilkendegivelse med protein. Ikke desto mindre, klassiske tilgange for protein Co udtryk i planter som regel involverer flere uafhængige udtryk plasmider, og derfor har ulemper, der omfatter lav Co udtryk effektivitet, udtryk-niveau variation og høj tid udgifter i genetiske krydser og screening. I denne undersøgelse beskriver vi en robust og roman metode for Co udtryk for flere kimære fluorescerende proteiner i planter. Det overvinder begrænsningerne af konventionelle metoder ved hjælp af et enkelt udtryk vektor, der er sammensat af flere semi-uafhængig udtrykker kassetter. Hver protein udtryk kassette indeholder sin egen funktionelle protein udtrykselementer, og derfor det kan fleksibelt tilpasses for at imødekomme forskellige udtryk efterspørgsel. Også, det er nemt og bekvemt at udføre forsamlingen og manipulation af DNA fragmenter i udtryk plasmid ved hjælp af en optimeret one-step reaktion uden yderligere fordøjelse og ligatur trin. Derudover er det fuldt ud kompatible med aktuelle fluorescerende protein afledt bio-imaging teknologier og applikationer, såsom FRET og BiFC. Som en validering af metoden ansat vi dette nye system til co express fluorescently sammenvokset vakuolære sortering receptor og sekretoriske carrier Membranproteiner. Resultaterne viser, at deres perspektiv subcellulært lokaliseringer er den samme som i tidligere undersøgelser af både forbigående udtryk og genetiske transformation i planter.
Introduction
Kimære fluorescerende fusion proteiner har været betragtet som nyttige redskaber til at studere intracellulære dynamics og subcellulært lokalisering og yderligere at forstå deres fysiologiske funktioner og arbejder mekanismer1,2, 3 , 4. det er især gavnligt for Co express velkendte organelle reporter proteiner med protein til bedre illustrere sine spatiotemporelle rationale, distribution og funktioner inden for endomembrane systemet i celler4 , 5 , 6 , 7 , 8.
En kimære fluorescerende fusion protein kan udtrykkes i planter via forbigående udtryk og stabil genetiske transformation, som har deres respektive fordele og begrænsninger9,10,11. Forbigående udtryk for et protein er en praktisk tilgang, der omfatter biolistic bombardement-, polyethylenglycol (PEG)-, eller elektroporation-medieret DNA forbigående udtryk i protoplasts og Agrobacterium-medieret blad infiltration i intakt planteceller, som vist i figur 1A, B12,13,14,15,16. Co udtryk for flere kimære fluorescerende fusion proteiner i en enkelt plante celle kræver imidlertid en blanding af flere uafhængige udtryk plasmider. Ulemperne ved beskæftiger flere plasmider for protein Co udtryk i planter er således lavere Co udtryk niveauer på grund af den dramatisk reduceret chance for flere plasmider samtidigt ind i de samme celler i forhold til en enkelt plasmid, og den variationer af udtryk Proteinniveau forårsaget af ukontrolleret tilfældige mængden af hver slags plasmid overføres til den celle17,18. Det er endvidere teknisk udfordrende at indføre flere uafhængige udtryk plasmider i en enkelt Agrobacterium for protein Co udtryk9,10,11. Derfor Agrobacterium-medieret protein forbigående udtryk af infiltration af tobak efterlader er kun i stand til at udtrykke et plasmid ad gangen, som vist i figur 1B. Derimod er generation af transgene planter at udtrykke fluorescerende fusion proteiner normalt opnås ved Agrobacterium , der bærer en binær transformation vektor. Den binære vektor, der medierer genoverførsel og indsættelse i anlægget genomer er imidlertid kun i stand til at udtrykke en enkelt fluorescerende fusion protein (figur 1B)9,10,12. Generering af en genetisk modificeret plante, som udtrykker flere kimære fluorescerende proteiner samtidig kræver flere runder af genetiske passage og screening, som kan tage fra måneder til år afhængigt af antallet af generne at være co udtrykt.
Den beskæftigelse, et enkelt udtryk vektor for Co udtryk for flere proteiner i planter er blevet rapporteret af flere tidligere undersøgelser19,20,21. Dog er flere runder af enzymatisk fordøjelse og DNA ligatur af DNA-molekyler og rygraden vektorer normalt kræves til generering af den endelige plasmid for protein Co udtryk eller overdrevne udtryk. Her, har vi udviklet en ny og solid metode til co udtrykker flere kimære fluorescerende proteiner i planter. Det er en meget effektiv og praktisk metode, der opnår flere protein Co udtryk i planter til både forbigående udtryk og stabil transformation i en hævdvundne mode. Det beskæftiger en enkelt vektor, der indeholder flere funktionelt uafhængige protein udtryk kassetter til protein Co udtryk og dermed overvinder ulemperne ved de konventionelle metoder. Derudover er det et meget alsidigt system i hvilke DNA manipulationer og montage er opnået ved en simpel et-trins optimeret reaktion uden ekstra trin af DNA fordøjelse og ligatur. Funktionsprincip er illustreret i figur 2. Derudover er det fuldt ud kompatible med aktuelle cellulære, molekylære og biokemiske metoder, der er baseret på kimære fluorescerende fusion proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi vist en roman metode håndfast Co udtrykke kimære fluorescerende fusion proteiner i planter. Det kan bruges til både forbigående udtryk og genetiske transformation og er kompatible med aktuelle fluorescerende proteiner-baseret bio-imaging, molekylære og biokemiske applikationer og teknologier9,10,13 . Derudover overvinder det vanskelighederne af de konventionelle metoder, der bruger flere individuelle udtryk plasm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takke medlemmerne af Wang laboratorium for nyttige diskussioner og kommentarer. Dette arbejde er støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC, bevilling nr. 31570001) og Natural Science Foundation i Guangdong provinsen og Guangzhou City (Giv nr. 2016A030313401 og 201707010024) til H.W.
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
Referências
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
- Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice” by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
