La co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes Fusion de façon efficace dans les plantes
Summary
Nous avons développé une nouvelle méthode pour exprimer conjointement plusieurs protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes à surmonter les difficultés des méthodes conventionnelles. Il prend avantage d’utiliser un plasmide d’expression unique qui contient plusieurs protéines fonctionnellement indépendant exprimant des cassettes pour atteindre la co-expression de protéine.
Abstract
Informations sur la localization(s) subcellulaire spatio-temporelle d’une protéine sont essentielles de comprendre ses fonctions physiologiques dans les cellules. Protéines fluorescentes et génération des protéines de fusion fluorescents ont sauvagement servis comme un outil efficace pour visualiser directement la localisation des protéines et la dynamique dans les cellules. Il est particulièrement utile pour les comparer avec des marqueurs de l’organite bien connu après la co-expression avec la protéine d’intérêt. Néanmoins, les approches classiques pour la co-expression de protéines chez les plantes impliquent généralement plusieurs plasmides d’expression indépendante et par conséquent ont des inconvénients qui incluent la co-expression de faible efficacité, variation du niveau de l’expression et grand temps dépenses en traversant et le dépistage génétiques. Dans cette étude, nous décrivons une méthode nouvelle et robuste pour la co-expression de multiples protéines fluorescentes chimériques dans les plantes. Il surmonte les limites des méthodes courantes à l’aide d’un vecteur d’expression unique qui se compose de plusieurs cassettes exprimant semi-indépendante. Chaque cassette d’expression de protéine contient ses propres éléments d’expression de protéine fonctionnelle, et par conséquent il peut être souple ajusté pour répondre à la demande de l’expression diversifiée. En outre, c’est facile et pratique d’effectuer l’assemblage et manipulation de l’ADN des fragments dans le plasmide d’expression à l’aide d’une réaction en une seule étape optimisé sans digestion supplémentaire et étapes de ligature. En outre, il est entièrement compatible avec les technologies actuelles de bio-imagerie des protéines fluorescentes dérivées et applications, telles que la frette et BiFC. Comme une validation de la méthode, nous avons utilisé ce nouveau système récepteur tri vacuolaire express co fluorescent fusionnés et protéines membranaires du porteur. Les résultats montrent que leurs localisations subcellulaires perspective sont les mêmes que dans les études antérieures par expression transitoire et transformation génétique chez les plantes.
Introduction
Protéines chimériques fluorescentes fusion ont été considérés comme des outils utiles pour étudier la dynamique intracellulaire et localisation subcellulaire et mieux comprendre leurs fonctions physiologiques et le travail des mécanismes1,2, 3 , 4. il est particulièrement bénéfique aux protéines de journaliste bien connu organite express Co avec la protéine en question pour mieux illustrer son raisonnement spatio-temporel, la distribution et l’ou les fonctions au sein du système endomembranaire dans les cellules4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Une protéine de fusion fluorescent chimérique peut être exprimée dans les plantes par expression transitoire et de la transformation génétique stable, qui ont leurs avantages respectifs et les limites de10,9,11. Expression transitoire d’une protéine est une approche pratique qui comprend biolistique bombardement-, polyéthylène glycol (PEG)-, ou expression transitoire ADN induite par électroporation de protoplastes et Agrobacterium-médiée par infiltration de la feuille dans cellules végétales intactes, comme illustré à la Figure 1 a, B12,13,14,15,16. Toutefois, la co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes fusion dans une cellule végétale unique exige un mélange de plusieurs plasmides d’expression indépendante. Ainsi, les inconvénients d’employer plusieurs plasmides pour la co-expression de protéines chez les plantes sont plus faibles en raison de la chance considérablement réduite de plusieurs plasmides entrer simultanément dans les mêmes cellules par rapport à un plasmide, la co-expression et le variations des niveaux d’expression de protéine causées par le volume de chaque types de plasmide transféré dans la cellule17,18incontrôlable aléatoire. En outre, il est techniquement difficile d’introduire plusieurs plasmides d’expression indépendante dans un seul Agrobacterium pour la protéine co-expression9,10,11. Par conséquent, Agrobacterium-médiation protein expression transitoire par infiltration de tabac laisse est seulement capable d’exprimer un plasmide simultanément, comme illustré dans la Figure 1 b. En revanche, la génération de plantes transgéniques exprimant des protéines de fusion fluorescent est habituellement obtenue par Agrobacterium qui transporte un vecteur de transformation binaire. Toutefois, le vecteur binaire qui intervient dans le transfert de gène et l’insertion dans le génome de la plante n’est capable d’exprimer une seule fusion fluorescent protéine (Figure 1 b)9,10,12. Générant une plante transgénique exprimant simultanément plusieurs protéines fluorescentes chimériques nécessite plusieurs cycles de croisement génétique et le dépistage, qui peut prendre des mois ans selon le nombre de gènes d’être exprimée conjointement.
L’emploi de qu’un vecteur d’expression unique pour la co-expression de multiples protéines végétales a été signalé par plusieurs précédentes études19,20,21. Toutefois, plusieurs cycles de digestion enzymatique et ligature d’ADN des molécules d’ADN et des vecteurs de la colonne vertébrale sont habituellement exigées pour la génération du plasmide final pour la co-expression de protéine ou une surexpression. Ici, nous avons développé une méthode nouvelle et robuste permettant d’exprimer conjointement plusieurs protéines fluorescentes chimériques dans les plantes. C’est une méthode très efficace et pratique qui permet d’obtenir plusieurs co-expression de protéines dans les végétaux destinés tant l’expression transitoire et transformation stable de manière séculaire. Il emploie un vecteur unique qui contient plusieurs cassettes d’expression de protéines fonctionnellement indépendants pour la co-expression de protéine et ainsi permet de surmonter les inconvénients des méthodes conventionnelles. En outre, c’est un système très polyvalent dans laquelle l’ADN les manipulations et l’Assemblée sont atteints par une réaction en une étape simple optimisée sans étapes additionnelles de digestion de l’ADN et la ligature. Le principe de fonctionnement est illustré à la Figure 2. En outre, il est entièrement compatible avec les approches cellulaires, moléculaires et biochimiques actuelles qui reposent sur des protéines de fusion fluorescent chimérique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons démontré une méthode inédite pour robustement co expriment des protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes. Il peut être utilisé pour l’expression transitoire et transformation génétique et est compatible avec l’actuel fluorescent basées sur les protéines bio-imagerie, moléculaires et biochimiques des applications et technologies9,10,13 . En outre, elle surmonte les difficultés d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Wang des discussions utiles et commentaires. Ce travail est soutenu par la Fondation National sciences naturelles de Chine (NSFC, grant no 31570001) et la Fondation sciences naturelles de la Province de Guangdong et la ville de Guangzhou (Don 201707010024 et no 2016A030313401) à H.W.
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
Referências
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