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Química

Construction de Thiol-ene/yne hélicoïdale Peptides Via photoinduit thioéther/sulfure de vinyle-attaché Hydrothiolation

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57356
, , ,
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology,Peking University Shenzhen Graduate School

Summary

Nous présentons un protocole pour la construction des thioéthers/vinyle sulfure-tethered hélicoïdales peptides utilisant photoinduit thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Abstract

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la préparation de peptides thioéther-attaché à l’aide de résine sur intramoléculaire/intermoléculaire thiol-ene hydrothiolation. En outre, ce protocole décrit la préparation de peptides vinyle-sulfure-attaché à l’aide de dans-solution intramoléculaire thiol-yne hydrothiolation entre amino acids qui possèdent des chaînes latérales alcène/alcyne et résidus de cystéine à i, i + 4 positions. Peptides linéaires ont été synthétisés à l’aide d’une synthèse de peptide de phase solide axée sur le Fmoc standard (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation est réalisée en utilisant une réaction intramoléculaire thio-ène ou une réaction intermoléculaire thio-ene, selon la longueur de peptide. Dans cette recherche, une réaction intramoléculaire thio-ène est effectuée dans le cas des peptides plus courts utilisant sur résine déprotection des groupes trityle des résidus de cystéine après la synthèse complète du peptide linéaire. La résine est ensuite définie à une irradiation UV à l’aide de photo-initiateur 4-méthoxyacétophénone (carte) et 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). La réaction intermoléculaire thiol-ene est réalisée en dissolvant Fmoc-Cys-OH dans un solvant de N, N– diméthylformamide (DMF). Cela réagit ensuite avec le peptide en utilisant les résidus de l’alcène portant sur résine. Après cela, la macrolactamization est effectuée en utilisant hexafluorophosphate de benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) et 4-méthylmorpholine (NMM) comme réactifs d’activation sur la résine. Suite à la macrolactamization, la synthèse de peptide est maintenue à l’aide de SPPS standard. Dans le cas de la hydrothiolation thio-yne, le peptide linéaire est clivé de la résine séché et ensuite dissous dans le DMF dégazé. C’est ensuite irradié à l’aide de rayons UV avec photo-initiateur 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Suite à la réaction, DMF est évaporée et le résidu brut est précipité et purifié à l’aide de la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Ces méthodes pourraient fonctionner afin de simplifier la génération de peptides cycliques thioéther-attachés en raison de l’utilisation de la chimie de clic de thio-ene/yne qui possède la tolérance supérieure groupe fonctionnel et avec un bon rendement. L’introduction des liaisons thioéther peptides profite du caractère nucléophile des résidus cystéine et oxydo-réduction-inerte par rapport aux liaisons disulfide.

Introduction

Le développement de ligands pour moduler les interactions protéine-protéine (IPP) offre une approche intéressante pour la découverte de médicaments modernes. Ainsi, beaucoup d’efforts ont été investi en étudiant les modalités chimiques roman qui pourraient moduler efficacement IPP1,2,3. IPP se composent généralement des surfaces qui interagissent peu profonds, grands ou abandonnées, et les petites molécules sont généralement considérés comme des ligands inadaptés pour la modulation de l’IPP4,5. Avec une approprié interaction surface exposée, petits peptides qui imitent les caractéristiques structurales des interfaces de protéines représentent des candidats idéaux pour régler ce problème6,7. Cependant, les petits peptides sont généralement non structurées dans une solution aqueuse. Cela est dû au fait que les molécules d’eau qui concurrencent le réseau de liaison hydrogène intramoléculaire du squelette peptidique et conformations bien définies sont entropiquement défavorables dans l’eau8. En outre, les peptides’ intrinsèquement faible stabilité et propriétés de perméabilité cellulaire largement limitent leur utilisation dans des applications biologiques9,10. Selon l’analyse de protein data bank (PDB), > 50 % des IPP impliquent hélice α court interactions11. Ainsi, les méthodes chimiques différentes ont été développées en ce qui concerne la stabilisation de l’hélice. Ceux-ci incluent disulfure/thioéther bond formation12,13,14, métathèse de fermeture de cycle15, lactam ring formation16, « cliquez » chimie17, ajout de perfluoroarenes18,19et vinyle-sulfure formation20.

Peptides hélicoïdales stabilisés sont largement utilisés pour différentes cibles intracellulaires, dont p53, oestrogène récepteurs, Ras, BCL-2 protéines de la famille et d’autres21,22,23,24. ALRN-6924, un tout-hydrocarbure agrafé peptide inhibiteur double de MDM2 et MDMX, est actuellement utilisé pour l’investigation clinique25. En quelques années, notre groupe a mis l’accent sur le développement de méthodes de stabilisation nouveau peptide utilisant thiol-ene et thiol-yne réactions26,27,28. En général, nous avons démontré que ces réactions amorcées sont efficaces dans des conditions douces lorsqu’il est naturellement abondante cystéine est utilisé. En outre, nous avons montré que ces réactions ont une tolérance de l’excellent groupe fonctionnel, sont bio-orthogonaux et sont est avérées pour être applicable pour les peptides et les protéines modifications29. Les peptides de sulfure tethered thioéther/vinyle qui en résulte largement améliorer l’espace chimique des peptides de contrainte, fournissent un centre de labile sur sangles modification et s’avère pour être applicable pour des utilisations dans nombreuses applications biologiques30 ,31,32. A ce jour, seuls les rapports limités ont été décrits au sujet de la cyclisation de peptide de thiol-ene/thiol-yne. Dans une étude publiée par Anseth et coll. en 2009, une réaction sur la résine intramoléculaire thiol-ene de cyclisation de peptide entre alcènes activés avec la cystéine a été démontrée33. En 2015, Chou et al. décrit une réaction bi-composants radical initiés thiol-ene peptide agrafage34 et une réaction de couplage thiol-yne/ene ultérieurs, séquentiel35. Récemment, nous avons décrit une série de travaux basés sur thioéther/vinyle sulfure tethered peptides20,26,27. Ce protocole décrit une synthèse détaillée des peptides susmentionnés de thioether/vinyle sulfure attaché dans l’espoir qu’il sera utile pour la collectivité de la recherche.

Protocol

1. matériel préparation Pour l’appareil de synthèse peptidique manuelle, placez une tubulure de vide (Table des matières) dans une hotte de laboratoire efficaces. Ensuite, placer les robinets à trois voies sur le collecteur d’aspiration et le raccorder à une canalisation de gaz azote ou argon. Cap toutes les prises non utilisées à l’aide de septa caoutchouc. Brancher les colonnes remplies de résine (0,8 x 4 cm, 10 mL réservoir, voir Table des matières…

Representative Results

Les spectres HPLC et MS du peptide Ac-YmS5AAAC-NH2 et son produit cyclisés Ac – Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] – NH2 qui ont été générés à l’aide de la photoréaction sur résine intramoléculaire thiol-ene sont représentés en Figure 6 b. le peptide cyclique s’est avéré pour avoir un poids moléculaire identique par rapport à son précurseur linéaire. Cependant, son temps de rétention HPLC a été observ?…

Discussion

Dans la cyclisation sur résine intramoléculaire thio-ene décrite à la Figure 3, l’enlèvement du groupe trityle d’un résidu cystéine s’est avéré pour être une étape cruciale pour la photoréaction ultérieure. En outre, le poids moléculaire de peptide avant et suit que la réaction s’est avérée identique comme décrite dans Figure 6 b. Par conséquent, l’utilisation d’une identification de l’HPLC ou un dosage DTNB est nécessaire afin …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs reconnaissent le soutien financier de la Fondation de sciences naturelles de Chine subventions (n ° 21372023, 21778009 et 81701818) ; le ministère de la Science et la technologie de la République populaire de Chine (n° 2015DFA31590) ; la Science de Shenzhen et Comité d’Innovation technologique (no. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 et GJHS20170310093122365) ; et le FNS Postdoctoral de la Chine (n° 2017 M 610704).

Materials

Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550
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Keywords: ThioetherVinyl SulfideHelical PeptidesPhoto-induced Thiol-ene/yne Hydro-thiolationRink Amide MBHA ResinFmoc DeprotectionHCTUDIPEATrityl DeprotectionSolid-phase Peptide Synthesis
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Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).
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